姚曉華　吳昆侖青海省農(nóng)林科學(xué)院 / 青海省青稞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 青海省高原作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地, 青海西寧8006

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青稞脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因blt4.9的克隆及其對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)

姚曉華吳昆侖*
1青海省農(nóng)林科學(xué)院 / 青海省青稞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 青海省高原作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地, 青海西寧810016

摘要:為了解脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在青稞中的功能, 以青稞品種昆侖12為材料, 利用同源克隆得到青稞blt4.9基因序列(GenBank登錄號(hào)為KU170187), 該基因的cDNA序列全長720 bp, 開放閱讀框長348 bp, 編碼115個(gè)氨基酸殘基, 相對(duì)分子質(zhì)量為11.2 kD, 理論等電點(diǎn)9.04, 不穩(wěn)定系數(shù)為28.41, 是一個(gè)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。blt4.9編碼的蛋白絕大多數(shù)屬于疏水區(qū), 沒有較大的親水區(qū)。序列比對(duì)顯示, 該基因與大麥blt4.9基因編碼蛋白的同源性最高(98.3%)。Real-time PCR分析結(jié)果顯示, blt4.9基因在20%～30% PEG-6000、4℃以及50 μmol L-1ABA處理后表達(dá)量顯著增加,且在抗逆性強(qiáng)的青稞品種(旱地紫)中的表達(dá)量高于在抗逆性弱的品種(大麻)中, 推測(cè)該基因與青稞的抗逆性有關(guān)。該研究結(jié)果為利用青稞脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因改良青稞抗逆性奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:青稞; blt4.9基因; 克隆; 非生物脅迫; 基因表達(dá)量

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160284)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-05)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31160284) and the Special Program of Modern Agro-industry Technology System (CARS-05).

第一作者聯(lián)系方式: E-mail: yaoxiaohua009@126.com, Tel: 15009717456

青稞(Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f.)為禾本科大麥屬, 因其成熟時(shí)籽粒內(nèi)外稃與穎果分離,籽粒裸露, 故稱裸大麥[1]。青稞在青藏高原地區(qū)利用價(jià)值以及獨(dú)特的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)和保健作用使其成為極具開發(fā)利用價(jià)值的高原特色農(nóng)作物之一[2]。青稞主要種植于我國西北、西南地區(qū), 特別是西藏、青海、

甘肅南部、四川甘孜和阿壩州、云南迪慶州等高原地區(qū), 種植區(qū)域高寒缺氧, 環(huán)境惡劣, 降雨量少, 蒸發(fā)量大。青稞在如此惡劣的條件下表現(xiàn)出很強(qiáng)的適應(yīng)性, 說明其基因組中蘊(yùn)藏了豐富的與抗逆相關(guān)的優(yōu)良基因。開發(fā)利用這些優(yōu)良基因, 不僅對(duì)選育青稞抗逆新品種具有重要理論意義, 而且對(duì)作物抗脅迫基礎(chǔ)研究具有促進(jìn)作用。

高等植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(lipid-transfer protein, LTP)是一類小分子量堿性單體蛋白質(zhì), 主要參與生物膜、角質(zhì)和脂類的形成, 在離體條件下參與磷脂、脂肪酸、糖脂等在生物膜之間的運(yùn)輸, 在植物生殖發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物途徑中發(fā)揮重要作用[3-5]。研究表明, LTP基因易受溫度、鹽、干旱脅迫、外源ABA、以及損傷等逆境誘導(dǎo)而過量表達(dá), 是植物抵抗逆境脅迫的蛋白[6-8]。Hincha Dirk[9]研究表明, 當(dāng)植物遭遇低溫脅迫時(shí), LTP可以充當(dāng)調(diào)控蛋白, 穩(wěn)定質(zhì)膜活性, 抵抗低溫傷害。

在大麥中blt (low-temperature responsive barley gene)基因家族是一類低溫反應(yīng)基因[10], 主要包括blt4 (blt4.2、blt4.6和blt4.9)、blt14 (blt14.1和blt14.2)、blt63、blt101 (blt101.2)、blt410和blt80等, 受低溫誘導(dǎo)表達(dá)[11], 個(gè)別基因(如blt4)也同時(shí)受干旱和ABA的誘導(dǎo)。研究表明, blt4基因編碼的是一種脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 可以通過改變質(zhì)膜的組成來提高膜的冷穩(wěn)定性, 對(duì)調(diào)控植物抗寒性具重要作用[12]。本文利用同源克隆技術(shù), 獲得了青稞blt4.9基因序列, 通過序列分析和功能驗(yàn)證, 初步認(rèn)為該基因與非生物脅迫有密切關(guān)系, 可為研究青稞blt基因家族奠定基礎(chǔ), 為青稞抗逆基因的深入研究和抗逆育種提供候選基因。

1　材料與方法

1.1供試材料

選用3個(gè)青稞品種, 其中來自青海省的昆侖12用于基因克隆和基因功能驗(yàn)證, 該品種由北青1號(hào)(母本)和昆侖1號(hào)(父本)通過有性雜交選育而成, 中抗條紋病和散黑穗病, 較抗倒伏, 抗落粒性強(qiáng), 具較強(qiáng)的耐旱、耐寒性; 來自四川省的旱地紫具有較強(qiáng)的抗旱性和耐冷性, 來自甘肅省的大麻, 其抗旱和耐冷性較弱, 這兩個(gè)品種用于基因功能驗(yàn)證。2013年春, 將3個(gè)品種同時(shí)種植于青海省農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)田(青海西寧), 2013年秋收獲種子進(jìn)行室內(nèi)試驗(yàn)。

1.2目的基因克隆及基因分析

1.2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/nuccore/U63993.1)公布的大麥blt4.9基因序列設(shè)計(jì)引物P1 (F: 5′-CGGGATCCCGAACCCA ATGGACGCAATAC-3′; R: 5′-CGAGCTCGACTCAT AGGTCCCCTCAAAG-3′), 由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.2blt4.9基因的克隆與測(cè)序?qū)⑶囡N子置于鋪3層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中, 在人工氣候箱中培養(yǎng),溫度為(25±1)℃, 光照強(qiáng)度為433 μmol m–2s–1, 每天光照14 h, 其間每天向?yàn)V紙加數(shù)滴蒸餾水, 浸透濾紙并稍有剩余, 以避免干旱。待幼苗長至約10 cm高時(shí)(約2周), 以4℃低溫處理12 h, 取其葉片提取植物總RNA, 經(jīng)PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)試劑盒反轉(zhuǎn)錄后用于目標(biāo)基因的擴(kuò)增模板。PCR體系為20 μL, 包括10× buffer 2.0 μL, 25 mmol L–1Mg2+1.5 μL, cDNA模板1 μg, 10 mmol L–1dNTP 0.5 μL, Taq DNA聚合酶1 U, 10 μmol L–1上、下游P1引物各0.5 μL。反應(yīng)參數(shù)為94℃ 5 min; 94℃ 1 min, 56 ℃ 1 min, 72℃ 1 min 40 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃ 延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 并回收、純化目的片段, 與pMD20-T載體連接, 連接體系含pMD20-T Vector 1 μL, Insert DNA 0.1～0.3 pmol, 加ddH2O至5 μL; 再加5 μL (等量)的Solution I; 16℃反應(yīng)30 min。將連接好的重組DNA全量(10 μL)加至100 μL Top10感受態(tài)細(xì)胞中, 冰浴30 min, 42℃熱激45 s,再在冰上放置1 min; 加入800 μL LB液體培養(yǎng)基(無抗生素)。混勻, 37℃、150轉(zhuǎn) min–1搖床振蕩1 h; 取200 μL菌液鋪于含Amp (50 μg μL–1)的LB固體培養(yǎng)基上, 37℃平放20 min, 后倒置培養(yǎng)12～14 h。挑取陽性克隆于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基上, 37℃、250轉(zhuǎn)min–1搖床振蕩8～10 h, 用TIANpure Midi Plasmid Kit試劑盒(天根)提取質(zhì)粒DNA, 分別通過PCR檢測(cè)和BamH ?、Sac ?酶切鑒定, 并將5個(gè)克隆送至生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

1.2.3青稞blt4.9基因分析及結(jié)構(gòu)特性預(yù)測(cè)采用ExPasy網(wǎng)站的在線工具ProtParam (http://expasy.org/tools/protparam.html)計(jì)算克隆基因編碼蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量, 預(yù)測(cè)蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu);通過蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)服務(wù)器(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu), 通過DNAstar7.1軟件的Protean模塊, 分別應(yīng)用Garnier-Robson、Deleage-

Roux、Hydropathy-Kyte-Doolittle、Karplus-Schulz、Emini計(jì)算氨基酸殘基的特定結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的疏水區(qū)和親水區(qū)、蛋白質(zhì)骨架區(qū)的柔韌性以及蛋白質(zhì)表面的可能性。

1.3blt4.9基因在非生物脅迫下的表達(dá)

1.3.1脅迫處理按前述方法在人工氣候箱中培養(yǎng)青稞幼苗, 待幼苗長至約10 cm高時(shí)(約2周)分別進(jìn)行干旱(PEG-6000)、低溫(4℃)和ABA處理, 脅迫處理期間, 每天向?yàn)V紙加相應(yīng)溶液數(shù)滴, 以浸透濾紙并稍有剩余為標(biāo)準(zhǔn), 盡量減少水勢(shì)變動(dòng)。PEG-6000 (0、5%、10%、15%、20%、25%、30%)和ABA (0、5、10、50、100、200、500 μmol L–1)處理1 d 后, 低溫處理0、12、24、48 h后, 分別提取葉片總RNA, 用PrimeScriptRT Master Mix (TaKaRa)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 用于檢測(cè)blt4.9基因的表達(dá)量。1.3.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)測(cè)得的blt4.9序列, 在開放閱讀框(ORF)內(nèi)設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物P2 (F: 5′-AAACCGCCTGTGACCT-3′; R: 5′-CACGCCGCTTG CTTGT-3′), 利用穩(wěn)定表達(dá)的18SrRNA作為內(nèi)參基因, 其引物(P3)序列為F: 5′-AAACCGCCTGTGA CCT-3′; R: 5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3′。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3.3Real-time PCR反應(yīng)程序采用Bio-Rad公司iQ5熒光定量PCR儀, 按照生工生物(上海)有限公司的熒光試劑盒Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits (SYBR Green I)分別建立目的基因和內(nèi)參基因的反應(yīng)體系, 其組成為cDNA 42.5 ng,10 μm L–1P2/P3上下游引物各0.5 μL, Hotstart Fluo-PCR mix 12.5 μL, 加ddH2O至25 μL。反應(yīng)參數(shù)為, 95℃3 min; 95℃ 10 s, 61℃ 30 s, 95℃ 1 min, 61℃ 1 min, 40個(gè)循環(huán)。

1.3.4基因表達(dá)分析采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[13], 干旱和低溫脅迫以旱地紫無脅迫處理的表達(dá)量為1; ABA脅迫以0 μmol L–1ABA處理昆侖12的表達(dá)量為1。用Stst2與SPSS13.0進(jìn)行方差分析和多重比較。用Origin 8.0制作柱狀圖。

2　結(jié)果與分析

2.1青稞blt4.9基因的克隆

用設(shè)計(jì)的特異引物擴(kuò)增得到一條約800 bp的特異性片段, 與預(yù)期結(jié)果相符。將該條帶純化后與pMD20-T克隆載體連接, 并轉(zhuǎn)入大腸桿菌, 在含有Amp的LB培養(yǎng)基上通過藍(lán)白斑篩選得到陽性克隆。分別對(duì)陽性克隆進(jìn)行PCR和酶切鑒定, 隨機(jī)選取5個(gè)經(jīng)鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果表明, blt4.9基因全長為720 bp, 其ORF為348 bp, 編碼115個(gè)氨基酸(圖1)。氨基酸組分分析結(jié)果顯示, blt4.9富含Ala (23.48%)、Ser (11.3%)、Val (8.7%)、Gly (8.7%)、Cys (6.96%)、Ile (6.09 %)和Lys (6.09 %), 不含Trp、Glu和Phe。這與已報(bào)道的其他冷誘導(dǎo)基因編碼蛋白氨基酸組成[14-15]相似。

圖1　青稞品種昆侖12中blt4.9基因的序列Fig. 1　Sequence of blt4.9 gene from hulless barley variety Kunlun 12

2.2青稞blt4.9基因及其編碼產(chǎn)物分析

Blast分析結(jié)果表明, 青稞blt4.9基因編碼的氨基酸序列與幾個(gè)大麥blt基因編碼產(chǎn)物的同源性很高(圖2-A), 均在96%以上, 尤其與大麥blt4.9編碼蛋白的同源性最高, 達(dá)98.3%; 其次是與硬粒小麥、黑麥(blt4.9)和普通小麥blt4編碼蛋白的同源性, 分別為81%、77%和72%; 與粳稻blt4.9編碼蛋白的同源性最低, 僅為62%。通過DNAStar得到分離自不同物種blt4.9基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2-B)顯示了與Blast比對(duì)一致的結(jié)果, 其原因可能是青稞與大麥同屬大麥屬, 而且blt家族的基因都報(bào)道是低溫反應(yīng)相關(guān)的基因。

利用DNAStar7.1軟件中的Protean模塊計(jì)算得知, blt4.9是編碼115個(gè)氨基酸的小分子蛋白質(zhì), 分子量為11.2 kD, 等電點(diǎn)為9.04, 是一個(gè)堿性蛋白,其分子量介于9.9～11.9 kU之間, 推測(cè)屬于LTP I家族[16]。利用軟件預(yù)測(cè)blt4.9編碼蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu),表明該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為28.41, 說明這是一個(gè)穩(wěn)定的蛋白質(zhì); 脂肪系數(shù)為92.78, 總平均親水性為0.597。且蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(48.70%)、β-折疊(7.83%)和無規(guī)則卷曲(43.48%)構(gòu)成(圖3); 絕大多數(shù)結(jié)構(gòu)位于疏水區(qū), 沒有形成較大的親水區(qū)(圖4)。

2.3blt4.9基因在逆境脅迫下的表達(dá)分析

2.3.1blt4.9在干旱和低溫脅迫下的表達(dá)以PEG-6000模擬干旱脅迫24 h, 當(dāng)PEG-6000濃度在5%～15%時(shí), blt4.9表達(dá)量雖有提高, 但增加幅度不明顯; 隨著干旱脅迫程度的增加, 當(dāng)PEG-6000濃度為20%時(shí)基因表達(dá)量顯著增加(P<0.05); 當(dāng)25% PEG-6000處理時(shí), 基因表達(dá)量達(dá)到峰值, 約為對(duì)照的53.04倍(旱地紫)和24.18倍(大麻); 當(dāng)PEG-6000濃度為30%時(shí), 表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照。并且在模擬干旱脅迫下, blt4.9基因在抗旱性強(qiáng)的品種(旱地紫)中的表達(dá)量顯著高于在抗旱性弱的品種(大麻)中(圖5-A)。

圖2　不同物種blt4基因編碼氨基酸序列的同源性比較(A)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(B)Fig. 2　Analysis of amino acid sequences (A) and phylogenetic tree (B) of blt4 genes from different speciesA: 昆侖12 blt4.9; B: 大麥blt4.2 (Q43785); C: 大麥blt4.3 (Q42842); D: 大麥blt4.1 (Q43767); E: 大麥blt4.9 (U63993.1); F: 硬粒小麥blt4 (AEG47274); G: 小麥blt4 (AAV66924); H: 黑麥blt4.9 (ABG27011); I: 粳稻blt4.9 (AAA74624)。A: blt4.9 from Kunlun 12; B: blt4.2 of Hordeum vulgare (Q43785); C: blt4.3 of Hordeum vulgare (Q42842); D: blt4.1 of Hordeum vulgare (Q43767); E: blt4.9 of Hordeum vulgare (U63993.1); F: blt4 of Triticum durum (AEG47274); G: blt4 of Triticum aestivum (AAV66924); H: blt4.9 of Secale careale (ABG27011); I: blt4.9 of Oryza sativa (AAA74624).

圖3　SOPMA軟件預(yù)測(cè)blt4.9的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 3　Secondary structure of the blt4.9 analyzed by SOPMA卷曲、螺旋、延伸鏈分別用粉、藍(lán)和紅線條表示。Curly, helix and extension chain are indicated with pink, blue, and red lines, respectively.

圖4　blt4.9編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性以及抗原分析Fig. 4　Secondary structure, hydrophilicity, and antigenic analysis of blt4.9

4℃低溫脅迫0～48 h, 旱地紫和大麻兩品種的blt4.9基因表達(dá)量都隨脅迫時(shí)間的延長而顯著增加,并且在耐冷性較強(qiáng)的旱地紫中表達(dá)量高于在耐冷性較弱的大麻中(圖5-B)(P<0.05)。2.3.2blt4.9在ABA脅迫下的表達(dá)0～500 μmol L-1ABA脅迫處理下, 隨著外源ABA濃度的增加, blt4.9基因表達(dá)量呈先增加后降低的趨勢(shì), 50 μmol L–1ABA處理的表達(dá)量最高, 為對(duì)照的8.96倍(P<0.05); 100～500 μmol L–1ABA脅迫下, blt4.9基因表達(dá)量均低于對(duì)照, 但與對(duì)照差異不顯著(圖6)。

3　討論

植物在遭遇低溫脅迫時(shí), 會(huì)誘導(dǎo)多種在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子區(qū)域有一個(gè)cis作用元件(TACCG AC AT)基因表達(dá), 受冷調(diào)節(jié)信號(hào)作用, 稱為脫水反應(yīng)因子DRE[17]。國內(nèi)外對(duì)大麥blt基因家族各成員研究比較多, 何濤和賈敬芬[15]、鄧曉青等[18]都克隆了青稞blt14.2基因, 證明該基因是低溫專一誘導(dǎo)基因, 在組織中特異性表達(dá), 在植物的抗寒中具有一定的作用。White等[19]用低溫感應(yīng)基因blt4.1作為探

針, 克隆了編碼大麥脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的3個(gè)同家族的基因序列g(shù)blt4.2、gblt4.6和gblt4.9, 并且發(fā)現(xiàn)它們的序列中存在與低溫反應(yīng)元件(accgac a)相似的序列, 但blt4基因家族的耐寒功能是否與低溫反應(yīng)原件有關(guān), 還有待進(jìn)一步證明。本研究通過克隆青稞blt4.9基因及其序列分析, 也發(fā)現(xiàn)一個(gè)與上述順式作用元件相似的低溫反應(yīng)元件CCGAC, 由此推測(cè), 該元件可能與青稞的耐寒性有一定關(guān)系。另外, 受實(shí)驗(yàn)條件限制, 本試驗(yàn)只測(cè)定了抗逆性不同的兩個(gè)青稞品種中blt4.9基因?qū)?℃低溫脅迫的表達(dá)反應(yīng), 初步結(jié)果顯示青稞品種耐冷性與blt4.9基因表達(dá)呈正相關(guān),這一結(jié)果若能經(jīng)研究確認(rèn), 則或許能作為選育青稞耐寒新品種的鑒定方法之一。

圖5　blt4.9基因在模擬干旱脅迫下(A)和低溫下(B)的表達(dá)Fig. 5　Expressions of blt4.9 gene under drought (A) and low temperature (B) stresses以旱地紫無脅迫處理為對(duì)照, 不同小寫字母表示處理間在0.05水平有顯著差異。Handizi without stress treatment was used as the control. Different letters above error bars indicate significant difference among treatments atP<0.05.

圖6　blt4.9基因在ABA脅迫下的表達(dá)Fig. 6　Expression level of blt4.9 gene under ABA stress以昆侖12無ABA處理為對(duì)照, 不同小寫表示處理間在0.05水平有顯著差異。Kunlun 12 without ABA treatment was used as the control. Different letters above error bars indicate significant difference among treatments at P<0.05.

通過分析青稞品種昆侖12中blt4.9的基因序列,得知該基因編碼的蛋白質(zhì)是一個(gè)高度疏水蛋白, 其氨基酸成分和冷誘導(dǎo)基因編碼蛋白的氨基酸成分相似; 在二級(jí)結(jié)構(gòu)上, blt4.9富含α-螺旋(48.7%)。高比例的α螺旋使blt4.9蛋白在空間上具有很大的柔性和流動(dòng)性, 有利于在分子內(nèi)形成氫鍵, 使蛋白質(zhì)分子形成任何方向上伸展、拉長及彎曲的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu), 保護(hù)細(xì)胞及膜免遭逆境的傷害[20]。Steponkus 等[21]提出一個(gè)假設(shè), 即某些親水脂α螺旋對(duì)膜磷脂層內(nèi)部的彎曲性有很強(qiáng)的作用, 并影響到它們形成六角形II相。用這個(gè)內(nèi)部彎曲假說可以解釋抗凍基因編碼的親水性多肽的作用。它們都形成親水脂性α螺旋的區(qū)域, 因此都可能通過影響膜磷脂層內(nèi)部的彎曲性, 來穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)以抵抗干旱、冷凍和高鹽等引起的細(xì)胞脫水而造成的膜傷害。據(jù)鄧江明等[22]報(bào)道, 這些高度的親水性蛋白質(zhì)對(duì)膜起保護(hù)和穩(wěn)定作用, 從而防止冰凍損傷, 提高植物的抗凍性。但本研究結(jié)果與之相反, 青稞blt4.9基因編碼的蛋白質(zhì)絕大多數(shù)都位于疏水區(qū), 沒有形成較大的親水區(qū),是一個(gè)高度疏水性蛋白質(zhì)。有研究表明, blt4和植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因高度同源[23], LTP肽鏈也具有較大的疏水面, 且LTP在植株體內(nèi)主要充當(dāng)防御蛋白,外界溫度、干旱等環(huán)境因子的變化, 誘導(dǎo)LTP基因的表達(dá)[24-25]。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明, 青稞blt4.9基因?qū)Ω珊?、低溫和ABA均能產(chǎn)生上調(diào)表達(dá)現(xiàn)象, 說明該基因可能在青稞抗旱、冷凍

脅迫和ABA信號(hào)通路中發(fā)揮著重要的保護(hù)功能; 這一研究結(jié)果與李倩等[26]研究的小麥脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaLTP在ABA、PEG、NaCl及4℃低溫脅迫誘導(dǎo)下均上調(diào)表達(dá), 可能與抗逆性調(diào)節(jié)相關(guān)的結(jié)果類似。另外, 本研究還發(fā)現(xiàn), 在相同的逆境脅迫下抗逆性強(qiáng)的青稞品種, 其blt4.9基因表達(dá)量顯著高于抗逆性弱的品種, 提示我們可以檢測(cè)在一定程度的干旱或者冷脅迫下blt4.9基因的表達(dá)量來判斷青稞的抗逆性。

4　結(jié)論

克隆了青稞blt4.9基因(GenBank登錄號(hào)為KU170187), 該基因?qū)Ω珊?、冷凍以及ABA脅迫均有表達(dá)響應(yīng), 且在干旱和低溫脅迫下抗逆性強(qiáng)的品種表達(dá)量顯著高于抗逆性弱的品種, 推測(cè)該基因在青稞的抗逆性反應(yīng)中起重要作用。

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Isolation of blt4.9 Gene Encoding LTP Protein in Hulless Barley and Its Response to Abiotic Stresses

YAO Xiao-Hua and WU Kun-Lun*
Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Qinghai Provincial Key Laboratory of Hulless Barley Genetics and Breeding / State Key Laboratory Breeding Base for Innovation and Utilization of Plateau Crop Germplasm, Xining 810016, China

Abstract:Higher plant lipid transfer protein (LTP) is a class of small molecular weight alkaline single protein that can transfer phospholipids between biomembrane and form the biomembrane in cells. The objective of this study was to understand the function of LTP gene in hulless barley (Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f.). The cDNA sequence of the LTP gene, blt4.9 (Gen-Bank accession number KU170187), was cloned from hulless barley variety Kunlun 12. The full length of blt4.9 cDNA is 720 bp including 348 bp of open reading frame and encodes 115 amino acids. The encoding product is a stable protein with a molecular weight of 11.2 kD, theoretical pI of 9.04, and instability coefficient of 28.41. This protein is rich in Gly, Ala, Leu, and Val amino acids excluding Trp, Glu, and Phe and similar to proteins encoded by other LTP genes. Sequence alignment indicated high similarity (98.3%) of protein encoded by blt4.9 from hulless barley and barley (Hordeum vulgare L.). The Real-time PCR assay showed that blt4.9 was up-regulated by 20–30% PEG-6000, 4oC and 50 μmol L-1ABA and the expression level was higher in the most tolerant variety Handizi than in the most susceptible variety Dama, indicating a possible relationship between stress tolerance and blt4.9 in hulless barley. These results provide basic information in the utilization of LTP genes to improve hulless barley tolerance to abiotic stresses.

Keywords:Hulless barley; blt4.9; Isolation of gene; Abiotic stresses; Gene expression level

收稿日期Received(): 2015-05-29; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2015-12-18.

通訊作者*(Corresponding author): 吳昆侖, E-mail: wklqaaf@163.com, Tel: 13997276769

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00399