賀曉嵐　王建偉　李文旭　陳真真　趙繼新　武　軍　王中華陳新宏,*

1西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西楊凌 712100;2凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院, 貴州凱里556011;3河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所, 河南鄭州 450002

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大賴草6-SFT基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因煙草抗旱和抗寒性分析

賀曉嵐1王建偉2李文旭3陳真真1趙繼新1武軍1王中華1陳新宏1,*

1西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西楊凌 712100;2凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院, 貴州凱里556011;3河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所, 河南鄭州 450002

摘要:果聚糖合成酶(6-SFT)在植物抵御逆境脅迫中起重要作用。利用RACE結(jié)合RT-PCR技術(shù)從大賴草(Leymus racemosus, 2n = 4x = 28, NsNsXmXm)中克隆到6-SFT基因, 其完整開放閱讀框?yàn)?863 bp。該基因被命名為Lr-6-SFT (GenBank登錄號KT387273), 編碼620個(gè)氨基酸, 其推導(dǎo)氨基酸序列含有保守的果糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對及進(jìn)化樹分析表明, 大賴草6-SFT與華山新麥草、普通小麥、西爾斯山羊草和大麥6-SFT具有高度相似性。采用基因重組技術(shù)構(gòu)建p1300-35SN-Lr-6-SFT表達(dá)載體, 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該載體轉(zhuǎn)入煙草品種W38中。對經(jīng)過抗性篩選、PCR和RT-PCR驗(yàn)證的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗旱和抗寒性鑒定, 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株與對照相比, 抗旱和抗寒性明顯增強(qiáng); 在逆境脅迫條件下, 轉(zhuǎn)基因植株的果聚糖、可溶性糖、脯氨酸含量都顯著高于對照, 而丙二醛的含量顯著低于對照。本研究表明, Lr-6-SFT基因是典型的GH32家族成員, 其表達(dá)能夠提高煙草對干旱和寒冷脅迫的抗性。

關(guān)鍵詞:6-SFT基因; 干旱; 寒冷; 大賴草; 生理指標(biāo); 轉(zhuǎn)基因煙草

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31571650)和西北農(nóng)林科技大學(xué)唐仲英育種基金資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31571650) and the Tang Zhong-Ying Breeding Fund of the Northwest A&F University.

第一作者聯(lián)系方式: E-mail: helingzhi123@126.com, Tel: 18285549260

果聚糖是以果糖為基本單位, 由蔗糖與一個(gè)或多個(gè)果糖基連接而成的聚合物[1], 廣泛分布在各種生物有機(jī)體中。果聚糖是15%的被子植物和冷季型牧草的主要儲(chǔ)存性碳水化合物[2]。積累果聚糖的植物主要分布在干旱和寒冷地區(qū), 在熱帶或水生環(huán)境中分布較少[2]。在植物體內(nèi)果聚糖主要積累在液泡中[3]。果聚糖不僅是重要的儲(chǔ)存性碳水化合物, 也是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。此外, 果聚糖含量的增加能防止膜相變, 進(jìn)而起到穩(wěn)定膜系統(tǒng)的作用[4],在植物適應(yīng)干旱、低溫和高鹽等非生物逆境過程中起著重要的作用[5]。在高等植物中, 以蔗糖為底物進(jìn)行果聚糖的合成, 有4種不同的果糖基轉(zhuǎn)移酶參與果聚糖的合成[6], 其中sucrose:fructan 6-fructosyltransferase (6-SFT)是合成果聚糖的關(guān)鍵酶[7]。自1995年Sprenger等[7]首次從大麥中發(fā)現(xiàn)并克隆到6-SFT基因以來, 已經(jīng)從多種植物中分離克隆該基因, 并且對其進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和功能驗(yàn)證研究, 如冰草[8]、小麥[9]、貓尾草[10]、雀麥草[11]、華山新麥草[12]等。雖然6-SFT基因在進(jìn)化上比較活躍[13], 但是, SDPNG、FRDP和WECIDF活性結(jié)構(gòu)域是高度保守的[11]。大量研究表明, 6-SFT能夠增強(qiáng)植物對干旱[5]和寒冷[11,14]等逆境脅迫的耐受能力; 在非果聚糖植物中, 6-SFT基因的表達(dá)使得轉(zhuǎn)基因植株積累果聚糖[5,15]。在轉(zhuǎn)6-SFT基因的植株中, 隨著果聚糖含量的增加,可溶性糖含量也增加了[5,16-17]。Knipp和Honermeier[18]研究發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)果聚糖酶基因的植株中, 果聚糖的積累對脯氨酸的含量具有多向性效應(yīng)。還有研究證明, 轉(zhuǎn)6-SFT基因的植株中果聚糖的積累增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株抗氧化脅迫的能力, 轉(zhuǎn)基因植株丙二醛含量顯著低于對照植株[15]。在逆境脅迫條件下, 可溶性糖和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累有利于增強(qiáng)植物對非生物逆境脅迫的抵抗能力[19-20]。因此, 植物體內(nèi)果聚糖含量的增加對其抗旱抗寒性的提高具有重要意義。

果聚糖的聚合度具有物種特異性[21]。在冷季型草中, 果聚糖低聚物的數(shù)量[22]和結(jié)構(gòu)[23]差異很大。6-SFT基因在進(jìn)化上比較活躍, 因此, 從不同物種中分離獲取該基因的序列信息有助于分析它們之間的分子關(guān)系, 并有助于闡明不同物種同源基因之間的進(jìn)化關(guān)系[8]; 同時(shí), 將這些基因?qū)胫参镏锌赡軙?huì)提高植物的抗逆性。大賴草(Leymus racemosus, 2n = 4x = 28, NsNsXmXm)又稱巨大冰麥草, 大穗濱麥草,屬于禾本科小麥族賴草屬, 為多年生草本植物, 具有大穗、多花、抗旱、抗寒、耐鹽和抗多種病害等優(yōu)良性狀[24]。該物種分布廣泛, 從中亞到東歐都有分布, 在海岸、沙丘和沙漠中最為常見。前人已成功地將來源于細(xì)菌[25]、真菌[26]及植物[7]的果聚糖合成酶關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)入非果聚糖植物中, 對果聚糖的代謝及積累效應(yīng)進(jìn)行研究, 并且開展了抗旱[25]、抗寒[15]、抗鹽[5]及抗氧化脅迫[15]的研究。但是, 有關(guān)大賴草6-SFT基因在干旱和寒冷脅迫抗性中的作用及其轉(zhuǎn)基因植株在逆境脅迫下的生理生化反應(yīng)的研究尚未見報(bào)道。本研究從大賴草中克隆6-SFT基因, 轉(zhuǎn)化煙草, 通過干旱和寒冷脅迫處理, 旨在了解Lr-6-SFT在干旱和寒冷脅迫下的作用, 以證明轉(zhuǎn)基因煙草是否通過表達(dá)6-SFT基因而增強(qiáng)其抗旱和抗寒性。

1　材料與方法

1.1大賴草果聚糖合成酶基因Lr-6-SFT的克隆

1.1.1cDNA中間保守區(qū)的克隆和序列測定大賴草(Leymus racemosus, 2n = 4x = 28, NsNsXmXm)種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)地(陜西楊凌), 利用總RNA提取試劑盒RNeasy Plant Minikit (Qiagen, Germany)提取大賴草葉片總RNA。使用SuperScript III Reverse Transcriptase cDNA第1鏈合成試劑盒(Invitrogen)合成cDNA第1鏈。參照小麥、西爾斯山羊草、大麥、冰草、雀麥、梯牧草、偏生早熟禾、草地早熟禾、毒麥和黑麥草10種植物的6-SFT蛋白氨基酸保守區(qū)序列設(shè)計(jì)1對簡并引物, 選用LA Taq (TaKaRa)擴(kuò)增大賴草6-SFT基因的cDNA中間保守區(qū)。簡并引物序列, DPsen為5′-AAYGARATGYT NCARTGG-3′, DPantisen為5′-NCCRTCNARNACN GGNAC-3′, N=AcgT; Y=CT; R=Ag。反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性3 min; 94。C變性30 s, 55。C退火30 s, 72。C延伸2 min, 35個(gè)循環(huán); 72。C延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收純化目的片段,目的片段與pMD19-T載體(大連TaKaRa)連接, 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 將菌落PCR和質(zhì)粒單雙酶切鑒定正確的5個(gè)重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.1.2Lr-6-SFT基因3′端和5′端序列的克隆按照3′-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒和5′-Full RACE Kit試劑盒(TaKaRa)說明書分別克隆大賴草Lr-6-SFT基因cDNA的3′端和5′端序列, 特異引物序列為GSOP3′-Lr3: 5′-TGAGGCTGATGTGGGCTA T-3′, GSIP3′-Lr3: 5′-CCTCGTCCTCGCTGCTGG TA-3′; GSOP5′-Lr3: 5′-GGTGACCAGATGACGGG ATT-3′, GSIP5′-Lr3: 5′-TGCACTGGACCTCAACAG

C-3′。大賴草葉片總RNA提取和PCR產(chǎn)物的克隆、測序方法如前所述。

1.2Lr-6-SFT基因cDNA編碼區(qū)的獲得及其編碼產(chǎn)物序列分析

根據(jù)5′和3′-RACE的結(jié)果, 并參考小麥6-SFT基因cDNA序列設(shè)計(jì)克隆Lr-6-SFT基因的引物, 其序列為Lr-6-SFT-F: 5′-TCACAATCTACCAAACTC TCTTA-3′; Lr-6-SFT-R: 5′-CACTCTCCCAAACAAC AATA-3′, 通過PCR法擴(kuò)增Lr-6-SFT基因編碼區(qū)序列, 并測序驗(yàn)證。

采用National Center for Biotechnology Information (NCBI)網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的在線工具DNAMAN 4.0、MegAlign軟件和多序列比對程序ClustalX2進(jìn)行cDNA序列BLAST分析。采用ExPasy proteomics server (http://www.expasy.ch/tools/ dna.html)氨基酸翻譯工具及Conserved Domains數(shù)據(jù)庫分析氨基酸序列的保守區(qū)域; 使用NCBI的ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf. html)分析基因開放閱讀框(ORF), 借助ClustalX2和MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草

1.3.1表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的培育將Lr-6-SFT基因的完整編碼區(qū)序列插入植物表達(dá)載體p1300-35SN的Hind III–BamH I位點(diǎn), 構(gòu)建植物表達(dá)載體p1300-35SN-Lr-6-SFT (圖1), 通過測序確保Lr-6-SFT在載體中的插入方向及完整性。將重組質(zhì)粒p1300-35SN-Lr-6-SFT通過凍融法[27]轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101(本實(shí)驗(yàn)室保存), 再利用葉盤法[28]轉(zhuǎn)化煙草W38, 最后將經(jīng)過10 mg L–1潮霉素篩選的抗性植株移入溫室培養(yǎng)。

1.3.2轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR擴(kuò)增分析采用CTAB法[29]提取推定的轉(zhuǎn)基因煙草葉片的基因組DNA, 以其為模板, 以Lr-6-SFT-F (5′-TCACAATCTACCAAAC TCTCTTA-3′)和Lr-6-SFT-R (5′-CACTCTCCCAAAC AACAATA-3′)為引物, 通過PCR擴(kuò)增法鑒定目的基因在轉(zhuǎn)基因植株基因組中的整合情況。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 60℃退火30 s,

72℃延伸2 min, 35個(gè)循環(huán), 72℃延伸10 min, 擴(kuò)增產(chǎn)物長度約2175 bp, 經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。1.3.3轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR分析為了分析Lr-6-SFT基因在RNA水平的表達(dá)情況, 本研究對PCR陽性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Lr-6-SFT轉(zhuǎn)錄水平分析。煙草總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成方法同1.1.1。以測試煙草的cDNA為模板, 首先以煙草actin基因特異引物(ActF: 5′-TGGCATCATACCTT TTACAA-3′和ActR: 5′-TCCGGGCATCTGAACCTC T-3′)對各樣本進(jìn)行擴(kuò)增, 根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果調(diào)整模板濃度, 以使模板cDNA均一化。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。然后用Lr-6-SFT基因的特異引物(Rp6-SFT-F: 5′-CCGCTGTTGAGGTCCAGT-3′, Rp6-SFT-R: 5′-TCTTCGCCGGATCATAGAA-3′)進(jìn)行半定量RT-PCR分析。Lr6-SFT基因檢測的RT-PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min; 94℃ 45 s, 55℃ 35 s, 72 ℃ 30 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min, 重復(fù)3次。

1.4轉(zhuǎn)基因煙草植株的表型分析

1.4.1抗旱和抗冷性鑒定參考Bie等[5]的方法鑒定轉(zhuǎn)基因植株的抗旱和抗冷性, 方法略有改動(dòng)。選用五、六葉期、大小及長勢一致的煙草轉(zhuǎn)基因植株及對照(轉(zhuǎn)空載體的植株)進(jìn)行脅迫處理, 其中旱脅迫處理為脅迫35 d后(最嫩葉片有明顯萎蔫癥狀)進(jìn)行復(fù)水處理, 1周后觀察其恢復(fù)生長情況; 冷脅迫處理為10℃、14 h光照/10 h黑暗、光照強(qiáng)度25 μmol m–2s–1條件處理10 d, 然后-20℃處理30 min, 室溫條件下培養(yǎng)9 d, 觀察植株生長狀態(tài)。

1.4.2相關(guān)生理指標(biāo)測定選擇RT-PCR鑒定表達(dá)量相對較高的T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株, 采集逆境脅迫前及干旱脅迫(20 d)或冷脅迫(10℃ 10 d, –20℃ 5 min)后T0代轉(zhuǎn)基因植株和對照植株葉片, 用蒽酮比色法測定可溶性糖含量[30], 茚三酮法測定脯氨酸含量[31], 植物丙二醛測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定丙二醛含量, 及Plant Fructan Colorimetric Assay Kit (GenMed Scientifics Inc., USA)測定果聚糖含量。對每個(gè)處理的每個(gè)生理指標(biāo)重復(fù)測定4次。

圖1　植物表達(dá)載體p1300-35SN-Lr-6-SFT示意圖Fig. 1　Structure of transformation vector p1300-35SN-Lr-6-SFT used in the studyRB: T-DNA右邊界; 35S′: CaMV 35S poly A; p35S2: 含雙增強(qiáng)子的CaMV 35S啟動(dòng)子; p35S1: CaMV 35S啟動(dòng)子; Tnos: 終止子; LB: T-DNA左邊界。RB: right border of T-DNA; 35S′: CaMV 35S poly A; p35S2: CaMV 35S promoter with double enhancer sequences; p35S1: CaMV 35S promoter; Tnos: nopaline synthase terminator; LB: left border of T-DNA.

1.4.3統(tǒng)計(jì)分析用SAS V8.1軟件統(tǒng)計(jì)分析測定數(shù)據(jù), t檢驗(yàn)法比較均數(shù)(P<0.05), Originpro 2015軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1Lr-6-SFT基因的獲得和序列分析

采用簡并引物PCR擴(kuò)增和RACE獲得全長大賴草6-SFT基因, 其完整開放閱讀框?yàn)?863 bp, 編碼620個(gè)氨基酸, 含有6個(gè)N端糖基化位點(diǎn)(Asn-Xaa-Ser/Thr), 等電點(diǎn)為5.11, 分子量預(yù)測為68.6 kD。在GenBank上進(jìn)行Blast檢索, 發(fā)現(xiàn)該序列與普通小麥的6-SFT基因序列相似性高達(dá)92%。將該基因的推導(dǎo)氨基酸序列與其他植物的同源序列比對顯示, Lr-6-SFT存在3個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域, 與其他植物的6-SFT一樣, 在蔗糖結(jié)合框S/NDPNG包含一個(gè)活躍的天冬氨酸(D)殘基, 在WECID保守區(qū)包含一個(gè)谷氨酸(E)殘基, 在FRDP框包含一個(gè)天門冬氨酸(D)殘基(圖2)。Lr-6-SFT與華山新麥草、普通小麥、西爾斯山羊草、大麥的6-SFT序列相似性很高, 在進(jìn)化樹上聚為一類(圖3)。比較Lr-6-SFT基因與華山新麥草的6-SFT, 發(fā)現(xiàn)序列相似性高達(dá)97%, 大賴草的6-SFT除了插入12個(gè)連續(xù)的CCGCCGCCGACG核苷酸外, 還存在一些單堿基變異, 但是這些變異均屬同義突變, 突變后仍然編碼相同的氨基酸。在氨基酸水平上, Lr-6-SFT僅比華山新麥草6-SFT在N端多4個(gè)連續(xù)的AAAD氨基酸。因此, 克隆獲得的序列為推定的6-SFT基因, 被命名為Lr-6-SFT, 基因登錄號為KT387273。

2.2轉(zhuǎn)Lr-6-SFT煙草植株的獲得與鑒定

通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因煙草T0代植株,經(jīng)潮霉素篩選后, 首先利用Lr-6-SFT-F/Lr-6-SFT-R引物對進(jìn)行PCR驗(yàn)證, 共獲得PCR陽性植株49株(圖4-a), 再用Rp6-SFT-F/Rp6-SFT-R引物對進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證, 獲得43株陽性植株。RT-PCR分析結(jié)果顯示, Lr-6-SFT在轉(zhuǎn)基因煙草中均能正常表達(dá), 而在對照植株中未檢測到轉(zhuǎn)錄信號(圖4-b)。

2.3轉(zhuǎn)基因煙草逆境脅迫前后表型分析

在正常條件下, 轉(zhuǎn)Lr-6-SFT基因的煙草植株和對照植株35 d后的生長狀態(tài)無明顯差異(圖5-a)。在干旱脅迫35 d后, 對照植株全部干枯, 而轉(zhuǎn)基因植株頂部的葉片仍然保持綠色(圖5-b); 復(fù)水后, 對照植株未能復(fù)活, 而轉(zhuǎn)基因植株在14 d后陸續(xù)有新葉長出。在冷脅迫(10℃ 10 d, –20℃30 min)后, 對照植株全部枯萎, 而轉(zhuǎn)基因植株只有下部的葉片枯萎, 頂部葉片仍然保持正常生長勢(圖5-c); 轉(zhuǎn)移至室溫下恢復(fù)培養(yǎng)7 d后, 轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較低程度的生長發(fā)育遲緩, 而對照植株全部死亡。

2.4轉(zhuǎn)基因煙草逆境脅迫前后生理指標(biāo)分析

在正常生長條件下, 轉(zhuǎn)基因T0植株的果聚糖含量顯著高于對照植株, 轉(zhuǎn)基因植株的果聚糖含量為6.87～9.57 mg g–1, 而在對照植株中沒有檢測到果聚糖; 轉(zhuǎn)基因植株可溶性糖、脯氨酸的含量均略高于對照植株, 丙二醛的含量略低于對照植株, 差異不顯著(圖6)。

干旱脅迫20 d后, 轉(zhuǎn)基因植株的果聚糖含量顯著增加, 為14.97～19.23 mg g–1, 是脅迫前的2.0～2.3 倍, 而在對照植株中沒有檢測到果聚糖; 轉(zhuǎn)基因植株的可溶性糖、脯氨酸含量分別為0.20%～0.23%和26.97～28.67 μg g–1, 均顯著高于對照植株; 轉(zhuǎn)基因植株的丙二醛含量僅為11.14～16.12 nmol g–1, 顯著低于對照植株的29.66～30.17 nmol g–1(圖6)。

與干旱脅迫處理相似, 冷脅迫處理后的轉(zhuǎn)基因植株, 果聚糖含量增加到脅迫前的1.9～2.4倍, 而在對照植株中沒有檢測到果聚糖; 轉(zhuǎn)基因植株的可溶性糖和脯氨酸含量也均顯著高于對照植株, 丙二醛含量卻顯著低于對照植株(圖6)。

總之, 干旱和冷脅迫后, 轉(zhuǎn)基因植株中丙二醛的含量略有提高, 而對照植株中丙二醛的含量顯著增加。在脅迫條件下, 轉(zhuǎn)基因植株中的碳水化合物和脯氨酸含量都顯著高于對照植株。

3　討論

3.1Lr-6-SFT基因的cDNA及其推導(dǎo)氨基酸序列的特征分析

本研究克隆得到了大賴草葉片6-SFT基因全長序列, 將其命名為Lr-6-SFT。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析表明, Lr-6-SFT屬于植物糖基水解酶家族32。Lr-6-SFT核苷酸序列所編碼的氨基酸序列包含SDPNG、RDP 和WECVD保守結(jié)構(gòu)域及DDER模體, 這表明Lr-6-SFT蛋白屬于S型的FT[32]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示, Lr-6-SFT編碼的氨基酸序列與華山新麥草、小麥、大麥、西爾斯山羊草的同源序列親緣關(guān)系較近, 尤其與華山新麥草的親緣關(guān)系最近(圖3)。多序列比對結(jié)果顯示, N-端的氨基酸序列差異較大,功能區(qū)域較保守, 不同物種間6-SFT的相似性較高。推測6-SFT作為果聚糖合成路徑的關(guān)鍵酶基因在進(jìn)化過程中必須保持較高的遺傳穩(wěn)定性。

(圖2)

圖2　推定的大賴草6-SFT和其他物種6-SFT蛋白序列聯(lián)配分析Fig. 2　Alignment of amino acid sequences of 6-SFTs from Leymus racemosus and other plant species方框顯示序列保守區(qū);星號(*)表示相同殘基; 冒號(:)表示保守替換; 點(diǎn)號(.)表示半保守替換。比對物種為大賴草(Lr)、普通小麥(Ta)、西爾斯山羊草(As)、大麥(BA)、冰草(Ac)、金雀花(Bp)、貓尾草(PH)、偏生早熟禾(Ps)、草地早熟禾(Pp)、毒麥(Lt)、華山新麥草(Ph)和多年生黑麥草(Lp)。Conserved regions are boxed. Asterisks (*), colons (:), and periods (.) show the identical residues, conserved substitutions, and semiconserved substitutions, respectively. The 6-SFT sequences were obtained from Leymus racemosus (Lr), Triticum aestivum (Ta), Aegilops searsii (As), Hordeum vulgare subsp. vulgare (BA), Agropyron cristatum (Ac), Bromus pictus (Bp), Phleum pratense (PH), Poa secunda (Ps), Poa pratensis (Pp), Lolium temulentum (Lt), Psathyrostachys huashanica (Ph), and Lolium perenne (Lp).

圖3　推定的大賴草的6-SFT蛋白與其他物種6-SFT蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 3　Phylogenic tree of 6-SFTs proteins from Leymus racemosus and other plant species各節(jié)點(diǎn)處數(shù)值表示Bootstrap值(迭代1000次)。比對物種為大賴草(Lr)、普通小麥(Ta)、西爾斯山羊草(As)、大麥(BA)、冰草(Ac)、金雀花(Bp)、貓尾草(PH)、偏生早熟禾(Ps)、草地早熟禾(Pp)、毒麥(Lt)、華山新麥草(Ph)和多年生黑麥草(Lp)。The bootstrap percentages (>50%) indicate next to the branches (based on 1000 replicates). The 6-SFT sequences were obtained from Leymus racemosus (Lr), Triticum aestivum (Ta), Aegilops searsii (As), Hordeum vulgare subsp. vulgare (BA), Agropyron cristatum (Ac), Bromus pictus (Bp), Phleum pratense (PH), Poa secunda (Ps), Poa pratensis (Pp), Lolium temulentum (Lt), Psathyrostachys huashanica (Ph), and Lolium perenne (Lp).

圖4　轉(zhuǎn)Lr-6-SFT基因煙草分子檢測結(jié)果Fig. 4　PCR assay of Lr-6-SFT transgenic tobacco plantsa: 隨機(jī)挑選的8株轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR檢測, 其中M為DL10000 DNA marker, P為陽性對照(質(zhì)粒), NT為轉(zhuǎn)空載體的陰性對照, 1～8為推定的轉(zhuǎn)基因植株。b: T0代煙草轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR檢測, 以Actin為內(nèi)參, 其中NT為轉(zhuǎn)空載體的陰性對照, 其他泳道為轉(zhuǎn)基因植株。Panel a show the PCR profile of Lr-6-SFT gene in eight individual tobacco plants. M: DL10000 DNA marker; P: positive control (plasmid); NT: negative control (non-transgenic plants); 1–8: putative transgenic plants. Panel b show the RT-PCR result of primary T0transgenic tobacco plants using Actin primers as the internal control. Lane NT is the negative control (non-transgenic plants) and other lanes are the transgenic plants.

圖5　轉(zhuǎn)Lr-6-SFT基因煙草逆境脅迫處理結(jié)果Fig. 5　Phenotypes of tobacco plants transformed with the Leymus racemosus Lr-6-SFT gene under stressesa: 溫室培養(yǎng)35 d的煙草植株; b: 干旱脅迫處理35 d后的煙草植株; c: 冷脅迫(10℃ 10 d, –20℃ 35 min)處理后轉(zhuǎn)移至溫室培養(yǎng)7 d的煙草植株。NT為對照(轉(zhuǎn)空質(zhì)粒), 其他為轉(zhuǎn)基因植株。a: Tobacco plants grown in greenhouse; b: Tobacco plants performance at 35 days after drought stress; c: Tobacco plants recovered under room temperature for seven days after cold stress (10℃for 10 days and –20℃ for 35 min). NT indicates the non-transgenic tobacco plant and others are Lr-6-SFT transgenic plants.

圖6　轉(zhuǎn)Lr-6-SFT基因煙草及對照植株在干旱和冷脅迫前后的果聚糖(a)、可溶性糖(b)、脯氨酸(c)和丙二醛含量(d)的變化Fig. 6　Changes of fructan (a), soluble sugar (b), proline (c), and MDA (d) contents in non-transgenic and Lr-6-SFT transgenic tobacco plants before and after drought or cold stress treatmentsNT: 轉(zhuǎn)空載體對照; L1～L8: T0代轉(zhuǎn)基因植株。*表示同一處理?xiàng)l件下, 轉(zhuǎn)基因植株與NT達(dá)顯著差異(P<0.05)。NT: non-transgenic plant; L1–L8: transgenic T0plants; * indicates significant difference between the transgenic plant and NT under the same growing condition (P<0.05).

Lr-6-SFT基因的cDNA序列長度與岳愛琴等[33]克隆的6份普通小麥和10份二倍體小麥的cDNA序列長度一致, 但與Gao等[34]從小麥族中分離到的多個(gè)6-SFT基因及其Ns基因組的供體華山新麥草6-SFT基因[12]的cDNA序列長度不同。序列比對結(jié)果顯示, Lr-6-SFT除了12 bp的插入突變外, 還與華山新麥草的6-SFT存在多處單堿基變異。因此, 推測大賴草的6-SFT基因來自Xm基因組。Del Viso 等[11]報(bào)道在雀麥屬中6-SFT基因至少存在2個(gè)拷貝。大賴草屬于異源四倍體物種, 存在Ns和Xm基因組,我們推測其6-SFT基因可能至少存在2個(gè)拷貝, 但這一推測還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2Lr-6-SFT表達(dá)對轉(zhuǎn)基因煙草果聚糖含量和抗逆性的影響

在本研究中, 轉(zhuǎn)Lr-6-SFT煙草植株表現(xiàn)出明顯高于對照植株的抗旱和抗寒能力, 轉(zhuǎn)基因植株葉片的平均果聚糖含量為6.87～9.56 mg g–1, 轉(zhuǎn)Lr-6-SFT基因植株在逆境脅迫后, 果聚糖含量顯著增加。這些結(jié)果與前人報(bào)道的結(jié)果相似。Bie等[5]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)3個(gè)小麥果聚糖合成酶基因(Ta6-SFT、Ta1-SST和

Ta1-FFT)單基因的煙草植株的逆境抗性提高了, 并且轉(zhuǎn)基因植株中果聚糖含量為6.1～10.2 mg g–1; 李淑潔等[35]報(bào)道, CaMV35S和rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Ta-6-SFT基因轉(zhuǎn)化煙草, 轉(zhuǎn)基因植株果聚糖含量在逆境脅迫條件下顯著升高。果聚糖在轉(zhuǎn)基因煙草中的積累表明外源果聚糖合成途徑已引入轉(zhuǎn)基因植株中, 這可能也是導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株抗旱和抗寒性提高的原因。果聚糖的含量受溫度、pH、離子強(qiáng)度、底物質(zhì)量濃度等影響[36]。因此, 在逆境脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株果聚糖含量顯著增加, 這可能是逆境條件下植物的底物質(zhì)量濃度增加所致。

無論在逆境脅迫前或逆境脅迫后, 轉(zhuǎn)Lr-6-SFT基因陽性植株葉片的平均可溶性糖含量均高于對照植株, 這與Tamura等[17,37]的研究結(jié)果相一致。轉(zhuǎn)Lr-6-SFT基因的陽性轉(zhuǎn)基因植株可溶性糖含量提高的原因可能是由于在逆境脅迫條件下, 部分果聚糖水解釋放出蔗糖、果糖和葡萄糖, 作為液泡的滲透緩沖劑和低溫保護(hù)劑, 插入細(xì)胞質(zhì)膜防止其滲漏[38]。

在脅迫條件下, 轉(zhuǎn)Lr-6-SFT煙草植株的脯氨酸含量顯著高于對照植株。Knipp和Honermeier[18]也曾報(bào)道, 轉(zhuǎn)果聚糖合成酶基因的馬鈴薯在水分脅迫條件下, 植株中脯氨酸含量提高, 但是果聚糖聚合度較高的轉(zhuǎn)基因植株中脯氨酸含量較低。這表明可溶性碳水化合物代謝的改變可能會(huì)影響水分脅迫誘導(dǎo)的脯氨酸積累, 但是可溶性碳水化合物代謝和脯氨酸積累之間的關(guān)系是復(fù)雜的, 尚需深入探討其機(jī)制。

丙二醛是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物, 與細(xì)胞內(nèi)各種成分發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng), 導(dǎo)致酶和膜系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷, 細(xì)胞結(jié)構(gòu)生理完整性破壞。因此, 其含量與植物抗逆性顯著負(fù)相關(guān)[39]。與Li等[15]的研究結(jié)果一致,本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在逆境脅迫后, 轉(zhuǎn)基因植株丙二醛的含量比對照植株低; 在干旱和冷脅迫后, 轉(zhuǎn)基因植株丙二醛的含量只是略有增加, 而對照植株的丙二醛含量顯著增加。這表明Lr-6-SFT基因合成的果聚糖在煙草的抗旱和抗寒過程中發(fā)揮重要作用。

本研究表明, Lr-6-SFT基因的表達(dá)及果聚糖在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的積累, 使轉(zhuǎn)基因植株中可溶性糖和脯氨酸含量增加。果聚糖、可溶性糖、脯氨酸是植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì), 它們能夠增加細(xì)胞質(zhì)濃度, 降低細(xì)胞的冰點(diǎn), 防止細(xì)胞過度脫水,減少環(huán)境脅迫對細(xì)胞造成的氧化脅迫損傷[19-20]。然而, 積累果聚糖的轉(zhuǎn)基因煙草如何調(diào)控植株的生理響應(yīng), 有待進(jìn)一步研究。

4　結(jié)論

克隆到大賴草果聚糖合成酶關(guān)鍵基因Lr-6-SFT。該基因?qū)儆谔腔饷傅?2家族, 能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱和抗寒性。本研究結(jié)果豐富了作物逆境脅迫抗性基因資源, 對改良作物抗逆性有參考價(jià)值。

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Cloning of 6-SFT Gene from Leymus racemosus and Analysis of Tolerance to Drought and Cold Stresses in Transgenic Tobacco

HE Xiao-Lan1, WANG Jian-Wei2, LI Wen-Xu3, CHEN Zhen-Zhen1, ZHAO Ji-Xin1, WU Jun1, WANG Zhong-Hua1, and CHEN Xin-Hong1,*
1Shaanxi Provincial Key Laboratory of Plant Genetic Engineering Breeding / College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2College of Environment and Life Science, Kaili University, Kaili 556011, China;3Wheat Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China

Abstract:The fructan biosynthesis enzyme (6-SFT) plays an important role in plant in response to abiotic stresses. In this study, a full-length cDNA encoding sucrose:fructan-6-fructosyltransferase, designated as Lr-6-SFT (GenBank accession No. KT387273), was cloned from Leymus racemosus (2n = 4x = 28, NsNsXmXm) using reverse transcriptase PCR (RT-PCR) and rapid- amplification of cDNA ends (RACE) techniques. The full-length open reading frame comprises 1863 bp and encodes 620 amino acids. The predicted protein structure of the gene contains a conserved fructosyltransferase domain. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis showed that the Lr-6-SFT protein shared high similarity with 6-SFT proteins from Psathyrostachys huashanica, Triticum aestivum, Aegilops searsii, and Hordeum vulgare subsp. vulgare. The Lr-6-SFT gene was transferred into tobacco (Nicotiana tabacum L. cv. W38) via Agrobacterium-mediated transformation. The screened plants were tested by PCR and RT-PCR, and the transgenic tobacco plants exhibited much higher tolerance to drought and cold compared with the non-transgenic plants. Under drought and cold stresses, the Lr-6-SFT expressions were associated with the increased accumulation of stored carbohydrate and proline and the decreased malondialdehyde storage. These results suggest that Lr-6-SFT is a typical member of the glycoside hydrolase 32 (GH32) family and may be linked to enhanced tolerance to drought and cold stresses.

Keywords:6-SFT gene; Drought; Freezing; Leymus racemosus; Physiological indices; Transgenic tobacco

收稿日期Received(): 2015-07-22; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2015-12-18.

通訊作者*(Corresponding author): 陳新宏, E-mail: cxh2089@126.com, Tel: 029-87082854

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00389