唐 娟，張惠箴，蔣智銘

（上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院病理科，上海 200233）

骨的纖維結構不良克隆性分析

唐 娟，張惠箴，蔣智銘

（上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院病理科，上海 200233）

目的：檢測FD病變的克隆性起源，探討其病變的性質(zhì)。方法：采用基因組DNA抽提、PCR擴增及基因掃描的方法分析FD的克隆性。結果：在80例FD中，其中30例FD的HUMARA基因DNA擴增成功?；驋呙璺治龀晒Φ?0例FD中，2例FD為純合子，5例FD為單克隆，3例FD為多克隆。結論：FD是一種單克隆性的病變。結合我們前期的實驗研究（2例FD的GNAS1基因突變及1例FD惡變）提示FD是由于多種因素共同作用導致的骨發(fā)育成熟障礙的良性腫瘤性病變。

骨腫瘤；骨的纖維結構不良；克隆性；X染色體連鎖雄激素受體基因

骨的纖維結構不良（FD）為臨床中一種良性纖維性骨病，具有發(fā)病機制不明、病情進展緩慢以及非遺傳性的特點，也被稱作骨纖維異常增殖癥。以往研究指出，F(xiàn)D屬于一種非腫瘤性瘤樣病變，近年來隨著臨床分子生物學的不斷發(fā)展，人們對該疾病的認知有了更多的認識，對其發(fā)病本質(zhì)、機制有了更多認知：（1）FD病變發(fā)生染色體克隆性畸變、異常［1，2］；（2）FD病變發(fā)生GNAS1基因激活性突變［3，5］；（3）FD中存在C-fos與c-myc原癌基因的過度表達［6，7］。本組研究主要對基于女性X染色體失活嵌合性雄激素受體基因位點的克隆性檢測方法進行研究，分析80例女性患者FD的克隆性，以提供其腫瘤性增生的直接證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料收集上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院病理科2002年1月～2008年1月存檔中女性FD石蠟組織80例，選取10例骨肉瘤和10例骨折后骨痂作為對照組。

1.2 方法石蠟組織切片經(jīng)8 μm厚連續(xù)切片后，按QIAGEN 公司DNA 提取試劑盒說明書進行基因組DNA抽提。HpaII內(nèi)切酶酶切提取的基因組DNA后，進行2次PCR擴增，HUMARA第一外顯子的閱讀框架內(nèi) CAG重復序列約100bp的上游位置的甲基化位點上游與短串聯(lián)重復序列下游設計出上下游兩對引物，其中，外側上游引物序列如下：5'-GCT GTG AAG GTT GCT GTT CCT CAT-3'；外側下游引物序列如下：5'-CGT CCA AGA CCT ACC GAG GAG CTT-3'，內(nèi)側上游引物：5'-TCC AGA ATC TGT TCC AGA GCG TGC-3'，內(nèi)側下游游引物：5'-ATG GGC TTG GGG AGA ACC ATC CTC-3'；在內(nèi)側上游引物5'末端應用上海生工生物技術公司合成的6-羧基熒光素進行標記。PCR反應條件詳細如下：第一次反應條件：首先在95℃環(huán)境下預變性10min；然后在95℃環(huán)境下預變性45s，在63℃環(huán)境下退火60s，在72℃環(huán)境下延伸1min，共循環(huán)25次；其次在72℃環(huán)境下延伸10min，并放置于4℃狀態(tài)保存。第二次反應條件：首先在95℃環(huán)境下預變性10min；然后在95℃環(huán)境下預變性45s，在63℃環(huán)境下退火60s，在72℃環(huán)境下延伸1min，共循環(huán)28次；其次在2℃環(huán)境下延伸10min，于4℃狀態(tài)保存。第一次PCR使用外側上、下游引物，第二次PCR使用內(nèi)側上、下游引物。第二次PCR反應體系中的模板是第一次PCR反應的反應產(chǎn)物。反應結束后，吸取PCR擴增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳，檢測擴增片斷。將電泳后未純化的PCR產(chǎn)物（250～300bp的條帶）用無菌去離子水稀釋，稀釋比例為1∶20，使用DNA分析儀對PCR產(chǎn)物進行基因掃描。判定克隆性分析結果：（低分子量等位基因峰的面積/ 高分子量等位基因峰的面積）HpaII酶切前/（低分子量等位基因峰的面積/ 高分子量等位基因峰的面積）HpaII酶切后。認為腫瘤為單克隆性時，其比值＞4或者＜0.25。該腫瘤為單克隆性。

2 結果

2.1 臨床資料80例女性隨訪未發(fā)生惡變的FD患者年齡7～74歲，平均年齡28歲。71例為單骨性FD，9例為多骨性FD。其中8例發(fā)生病理性骨折，9例合并動脈瘤樣骨囊腫，1例為MAS即多骨性FD伴內(nèi)分泌失調(diào)（圖1A-F）。1例為60歲女性的Mazabraud綜合癥，大腿見一腫塊，入院術前作影像學檢查時偶爾發(fā)現(xiàn)同側股骨上段髓內(nèi)病變。

圖1 A-F 多骨型FD。A-E：雙側骨盆、脛骨、股骨和頭顱骨平片，顯示髓腔內(nèi)毛玻璃樣、均質(zhì)改變。F：鏡下為梭形細胞及字母狀不規(guī)則編織骨組織（HE染色，中倍放大）。

2.2 基因掃描結果80例FD基因組DNA，其中30例經(jīng)PCR擴增雄激素受體基因成功，產(chǎn)生200～250bp的片斷?；蚪MDNA經(jīng)HapII酶切作用后，PCR擴增雄激素受體基因后進行電泳（用2% 瓊脂糖凝膠），1～6號條帶是HapII酶切前PCR產(chǎn)物電泳圖，7～12條帶是HapII酶切后PCR產(chǎn)物電泳圖，HapII酶切后條帶的紫外吸光度值比酶切前有所降低（圖3）。30例擴增成功的PCR產(chǎn)物，經(jīng)DNA分析儀得出結果：5例FD顯示為單克隆性腫瘤，3例FD為多克隆性，2例FD為純合子（表2）。其余20例FD中3例由于峰值太低，不能分出主、次峰，17例峰值太高，因此均不能用于判定腫瘤的克隆性。

圖3 PCR產(chǎn)物以及Marker的電泳圖。1-6條帶為HapII酶切前的PCR產(chǎn)物，7-12條帶為HapII酶切后的PCR產(chǎn)物

表2 FD克隆性分析的結果

圖4 A-C圖A正常人血標本基因分析掃描結果：A1為正常人血標本內(nèi)切酶（HpaII酶）酶切前，A2為正常人血標本內(nèi)切酶（HpaII酶）酶切后，基因分析結果為3.330，屬多克隆性。圖B病例1基因分析掃描結果：B1為內(nèi)切酶（HpaII酶）酶切前，B2為內(nèi)切酶（HpaII酶）酶切后，基因分析結果為0.020，屬單克隆性。圖C病例6基因掃描：圖C1為內(nèi)切酶（HpaII酶）酶切前，圖C2為內(nèi)切酶（HpaII酶）酶切后，基因分析結果為3.370，為多克隆性。

3 討論

3.1 臨床中根據(jù)FD患者的臨床特征將其分成兩種類型

分別為單骨型和多骨型，其中單骨型為其中比較常見的類型，多骨型具有病變范圍廣的特點，對患者功能產(chǎn)生嚴重影響。國外文獻報道單骨型FD占85%，多骨型FD占15%［5］，好發(fā)于年輕人，平均確診年齡為30歲［8］，女性略多。通過對FD疾病發(fā)病機制進行分析研究發(fā)現(xiàn)，其生物學行為主要受到骨類型因素的影響，單骨型FD會隨著骨骼的不斷生長，病灶比例逐漸增大，直到骨骼停止發(fā)育，病變會逐漸靜止；多骨型FD病灶會隨著患者年齡的不斷增長，病灶逐漸擴大，且合并MAS或MS的發(fā)病率較高。一般情況下，F(xiàn)D惡變率較低，骨肉瘤變是最常見的惡變組織學類型。Hoshi等［9］研究128例FD有4例發(fā)生惡變。Ruggieri等［10］統(tǒng)計1122例FD，其中28例發(fā)生肉瘤變。FD一般預后良好，少數(shù)病例術后有復發(fā)，但再次手術仍然有效，一般不考慮放療，以免誘發(fā)肉瘤變。

通常采取手術療法可有效矯正畸形，并預防病理性骨折，且還可將有臨床癥狀的病灶徹底根除。但如行自體松質(zhì)骨移植術或者病灶刮除術治療時，由于自體松質(zhì)骨在術后骨骼重建過程中易被發(fā)育不良結構的骨組織取代。

3.2 對FD克隆性分析反應性增生與腫瘤性增生進行準確鑒別一直給人們帶來困擾。近年來，克隆性分析技術可較好解決該類難題，由于腫瘤具備的最顯著特征為其均來自單克隆性細胞群體［11-13］，即為同一個病變細胞，但正常、反應性增生組織具有多克隆性的特點。本次研究，通過對女性體細胞構成組織X染體失活嵌合性的分析結果進行顯示，結果顯示，可將病變克隆性準確顯示出來，幫助鑒別病變是反應性或腫瘤性增生。Koizumi 和Mikami等［5］研究11例FD發(fā)現(xiàn)其中8例FD是單克隆性，2例FD為純合子，1例擴增失敗。張偉和鞏麗［4］等研究21例FD發(fā)現(xiàn)其中19例是單克隆，其余2例是純合子，實驗結果未發(fā)現(xiàn)多克隆性FD。我們10例基因分析成功的FD中，5例FD是單克隆性，3例FD是多克隆性，其余2例FD為純合子。以下分析3例多克隆性FD可能存在的原因：因FD是一種良性纖維骨性病變，治療以病變刮除為主。本研究中病例均為病變刮除標本，在提取石蠟包埋標本中的基因組DNA時均未使用顯微切割技術選取病變組織。重新回閱此3例多克隆性FD的HE切片發(fā)現(xiàn)：其中1例FD病變中含有骨折后骨痂成分，另外2例病變周邊有部分橫紋肌及脂肪組織的成分。因此我們推測這3例FD抽提的基因組DNA中混雜有周邊正常的橫紋肌及脂肪組織或反應骨痂組織而影響了結果的分析，導致基因分析出現(xiàn)假多克隆。本實驗30例擴增成功標本中，只有10例進行基因掃描分析后出現(xiàn)HpaII酶切前及酶切后的掃描圖，3例發(fā)現(xiàn)峰值過于低，不能分辨出主峰和次峰，17例峰值過于高，不能進行克隆性的分析?；驋呙柚蟹逯颠^于低或者過于高的原因可能是：提取石蠟標本中的基因組DNA時，每例病變標本的編制骨組織與梭形細胞兩者比例不同。編織骨組織較多而梭形細胞的量較少時，提取出的基因組DNA的濃度就偏低，反之則濃度偏高。我們進行基因掃描分析時均用無菌去離子水以1：20比例稀釋，因而出現(xiàn)峰過于低或者過于高的情況而無法分析。本研究中有50例FD病變擴增失敗，可能出現(xiàn)的原因可如下：第一，對骨組織病變?nèi)〔臅r，根據(jù)病變骨的硬度，用強酸對病變骨進行脫鈣的時間長短不一。由于DNA在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定，易導致病變的DNA出現(xiàn)變性、斷裂和降解等情況，因此使用酸性脫鈣液對病變骨組織的處理時間長短影響各個病例中DNA的降解程度。第二，脫鈣液中福爾馬林及甲酸均可影響DNA質(zhì)量。Koshiba［14］等發(fā)現(xiàn)病理標本在福爾馬林固定過程中的DNA降解是由于固定溫度高、PH值低和甲酸的存在引起。在標本固定液中加鹽或者適量降低溫度可穩(wěn)定氫鍵，可以防止DNA在酸性條件下變性。然而，即便加入氫氧化鈉中和福爾馬林，在室溫下標本DNA仍然發(fā)生降解，提示福爾馬林固定液本身會降解標本DNA。福爾馬林降解DNA的機制及其預防措施有待深入研究。第三，病理標本的浸蠟時間過長和包埋溫度過高，均可導致標本DNA變性產(chǎn)生單鏈的DNA片段。Pollandt［1］和Lumbroso［2］均檢測到FD中GNAS1基因的突變，及我們前期研究的35例FD中檢測到2例GNAS1基因的突變；Dal Cin和Sciot等［15］報道的11例FD中8例有克隆性染色體的變異；目前國內(nèi)外均有研究證實在FD中存在原癌基因c-fos，c-myc的過度表達［17，18］；Mikami和Koizumi［11］等研究11例FD發(fā)現(xiàn)其中8例為單克隆性，我們實驗研究中檢測到5例FD為單克隆性；以及FD偶可發(fā)生惡變，單骨型FD的惡變率約為0.5%，麥-奧綜合癥（MAS）中惡變率約4%［16，17］，我們的前期實驗研究中也發(fā)現(xiàn)1例FD發(fā)生肉瘤變。結合文獻報道以及我們的實驗研究結果，提示FD是一種良性腫瘤性的病變。

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Clone origins of fibrous dysplasia

Tang Juan, Zhang Hui-zhen, Jiang Zhi-ming
(Department of Pathology, The Sixth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China)

bone tumor； fibrous dysplasia of bone； clonality； X-inactivation HUMARA

R738.1

A

1673-016X（2016）06-0010-04

2016-10-15

上海市衛(wèi)生局科技發(fā)展基金資助項目（No.034042）

張惠箴，E-mail：liuyuanblzg@aliyun.com

[Abctract]ObjectiveTo investigate clonal origins of fibrous dysplasia.MethodsGenomic DNA extraction, PCR amplification and gene scanning were used to to investigate clonal origins of fibrous dysplasia.ResultsPCR amplification was successful in 30 of 80 FD cases. Gene sanning succssfull In 10 cases of FD, 2 cases were homozygote, 5 cases monoclonal, the other 3 cases were polyclonal.ConclusionFibrous dysplasia is a clona1, neoplastic process. Combined with our protophase experiment(two case of FD GNAS1 gene mutation and one case of FD with malignancy), prompted FD could be neoplasia disease which was caused by multiple factors leading to a failure of bone development disease.