張 歡，肖文婕，曾 哲，朱心宇，董 楠，彭貴青

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢430070；2. 華中師范大學(xué)第一附屬中學(xué)，武漢 430223）

·研究論文·

豬δ冠狀病毒Nsp5的體外表達及其蛋白酶活性分析

張 歡1，肖文婕2，曾 哲1，朱心宇1，董 楠1，彭貴青1

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢430070；2. 華中師范大學(xué)第一附屬中學(xué)，武漢 430223）

豬δ冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus, PDCoV）是一種新發(fā)現(xiàn)的腸道冠狀病毒，可引起仔豬的腹瀉。冠狀病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp5是一種3C樣蛋白酶，在病毒多聚前體蛋白加工以及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本研究以PDCoV CHN-HN-2014株為模板，通過RT-PCR擴增Nsp5基因并將其克隆到原核表達載體pET-28a（+）中，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明Nsp5可在大腸桿菌中高效、可溶性表達。采用鎳親和層析對表達的Nsp5蛋白進行純化，并通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法檢測了其蛋白酶活性，結(jié)果表明純化的Nsp5蛋白能夠有效切割含有PDCoV Nsp5氨基端自切割位點的十二肽底物，證實體外表達的Nsp5重組蛋白具有良好的蛋白酶切割活性。豬δ冠狀病毒Nsp5蛋白的克隆、表達及其蛋白酶活性檢測，為深入研究該蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

豬δ冠狀病毒；Nsp5；蛋白酶活性

冠狀病毒（Coronavirus）是一類具有囊膜的單股正鏈R N A病毒，分為4個屬：α冠狀病毒屬（Alphacoronavirus）、β冠狀病毒屬（B e t a c o r o n a v i r u s）、γ冠狀病毒屬（Gammacoronavirus）以及新確定的δ冠狀病毒屬（Deltacoronavirus）[1]。豬δ冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus, PDCoV）最早于2012年由香港的研究人員在鑒定哺乳動物與禽類的新冠狀病毒時發(fā)現(xiàn)[2]。2014年美國多個州的豬場爆發(fā)豬δ冠狀病毒感染，引起母豬和仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水，嚴(yán)重者甚至致死，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[3,4]。隨后，韓國、加拿大、泰國以及中國大陸也先后報道了豬δ冠狀病毒的存在[5-8]。

冠狀病毒編碼多種蛋白酶，其中非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp5是一種與微RNA病毒3C蛋白酶類似的蛋白酶，稱為3C樣蛋白酶[9]。該蛋白酶具有切割活性，可以將多聚前體蛋白切割為成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白。除了具有切割活性外，還發(fā)現(xiàn)冠狀病毒的Nsp5是一種干擾素的拮抗分子，在病毒的免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用[10]。目前，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARSCoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV）等冠狀病毒的Nsp5的蛋白酶切割活性已經(jīng)被證實，并作為潛在的藥物靶標(biāo)受到廣泛關(guān)注[11]。作為新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒，PDCoV的Nsp5是否具有同樣的蛋白酶切割活性尚不清楚。本研究將PDCoV的Nsp5在大腸桿菌中進行了高效表達，并對其蛋白酶切割活性進行了檢測分析。

1 材料與方法

1.1 材料 豬腎上皮細胞（LLC-PK）購自國家實驗細胞資源共享平臺；PDCoV CHN-HN-2014株為本實驗室從臨床發(fā)病豬中分離[5]；原核表達載體pET-28a（+）購自Novagen公司；感受態(tài)細胞E. coli DH5α、E. coli BL21（DE3）由本實驗室保存；限制性內(nèi)切酶Nco I、Sal I、高保真酶Prime STARTM、dNTPs、DNA Marker等均為大連寶生物公司（TakaRa）產(chǎn)品；T4 DNA連接酶、蛋白質(zhì)Marker為Fermentas公司產(chǎn)品；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母浸出物購自O(shè)XOID公司；Trizol試劑為Omega公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastStart DNA Master SYBR Green I Mix reagent kit）購自羅氏公司（ROCHE）；三羥甲基氨基甲烷（Tris base）、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、卡那霉素購自BIOSHARP公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)PDCoV CHN-HN-2014株的基因組序列（GenBank 登錄號∶ KT336560），設(shè)計一對可擴增Nsp5 基因的特異性引物，并分別在引物上下游引入Nco I、Sal I酶切位點，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。上游引物：5'-GCACCATGGCAGCAGGTATCAAAATCC TC-3'，下游引物：5'-GCAGTCGACCTGCAATGA AATTGGAGCC-3'，加粗傾斜部分為酶切位點。

1.3 Nsp5基因的擴增 取-80℃冰箱內(nèi)保存的PDCoV CHN-HN-2014，以0.01MOI接種于長滿單層的LLC-PK細胞，培養(yǎng)24 h后提取細胞內(nèi)RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA。建立50 μL擴增體系：5×PrimeSTAR buffer（Mg2+plus）10 μL、dNTP Mixture（2.5 m mol/L each）4 μL、上下游引物各1 μL、模板cDNA 2 μL、PrimestarTMHS DNA polymerase 0.5 μL、ddH2O 31.5 μL。按照如下條件進行擴增：94℃預(yù)變性5 min；98℃ 變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min。34個循環(huán)之后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠中電泳觀察拍照并用凝膠DNA回收試劑盒進行回收。

1.4 重組表達質(zhì)粒pET-28a-Nsp5的構(gòu)建及鑒定 將回收的PCR產(chǎn)物與pET-28a(+)載體同時用Nco I、Sal I雙酶切后進行膠回收，用T4 DNA連接酶于22℃溫箱中過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。挑取單個菌落至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。陽性克隆經(jīng)DNA測序進一步證實，命名為pET-28a-Nsp5。

1.5 重組蛋白的表達及SDS-PAGE凝膠電泳分析 分別將pET-28a-Nsp5和空載體pET-28a(+) 轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3) 感受態(tài)細胞，挑取單個菌落于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。按照1∶100的比例接種菌液到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)約2 h，加入終濃度為1 mmol/L的無菌IPTG誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)。分別在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后3、4、5、6 h取樣1 mL，10 800×g 離心1 min，收集菌體，加入100 μL ddH2O 重懸菌體，再加入25 μL的5×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水煮10 min，樣品經(jīng)12%的SDS-PAGE膠電泳分離并用考馬斯亮藍染色。

1.6 重組蛋白的大量表達與純化 確定原核重組Nsp5蛋白可以穩(wěn)定表達后，再次誘導(dǎo)100 mL重組菌液，離心去除上清后加入PBS重懸菌體，通過壓力破碎儀破碎后，10 800×g 離心20 min，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，確定重組蛋白的表達形式。重組蛋白的純化采用鎳親和層析方法，按照GE Healthcare公司的操作手冊進行。

1.7 重組表達蛋白的Western blot鑒定 吸取含陽性重組質(zhì)粒pET-28a-Nsp5或者空載體pET-28a（+）的大腸桿菌BL21（DE3）菌液接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，加入IPTG誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)，分別取未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)5 h后的菌液進行破碎處理，吸取上清樣品進行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用10%脫脂乳搖床上室溫封閉2 h，TBST洗滌3次；用1∶2000稀釋的His標(biāo)簽鼠源單抗作為一抗搖床上室溫孵育4 h，TBST洗滌3次；加入1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗搖床上室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，用化學(xué)發(fā)光底物進行顯色。

1.8 Nsp5蛋白酶切割活性檢測 本研究中采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法（FRET）檢測蛋白酶活性。根據(jù)PDCoV Nsp4/Nsp5蛋白酶識別和剪切位點的特異性，在南京金斯瑞生物科技有限公司合成一個十二肽底物，從N端到C端依次為Dabcyl-LKTKLQ↓AGIKIL-E-Edan，Dabcyl（4-（4-Dimethylaminophenylazo）benzoyl，4'-（4'-二甲氨基氮苯）苯甲酸為淬滅基團連接在N 端的氨基酸殘基L上，Edans（5-[（2-aminoethyl）amino] naphthalene-1-sulfonic acid，5'-（2'-氨基乙胺基萘）-1-磺酸）為熒光基團連接在 C 端氨基酸殘基上。用340 nm 波長光激發(fā)，檢測 485 nm 波長下熒光值的變化。該多肽完整時，熒光基團和淬滅基團之間的距離很小，熒光基團的能量被特異性淬滅。經(jīng)蛋白酶在特異性位點識別剪切后多肽底物斷裂，熒光基團和淬滅基團分離間距變大，熒光基團恢復(fù)自身熒光。每個實驗組設(shè)置3個重復(fù)，在黑色96孔板中依次加入40 μL緩沖液（20 mmol HEPES, 50 mmol Nacl、0.4 mmol EDTA、30% glycerol、4 mmol DTT, pH 8.0），10 μL 終濃度50 nmol/μL 的Nsp5純化蛋白，50 μL 終濃度50 μmol/mL 的熒光底物。37℃，每隔1 min測定1次340 nm激發(fā)光下的發(fā)射光（485 nm），進行23個循環(huán)，以不加Nsp5蛋白酶的樣品為空白對照，將所得數(shù)據(jù)繪制酶反應(yīng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 Nsp5基因的PCR擴增 利用特異性引物擴增PDCoV CHN-HN-2014株 Nsp5基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到1條1.0 kb左右的特異性條帶（圖1），與預(yù)期大小（923 bp）相符。

圖1 PDCoV CHN-HN-2014株Nsp5基因的PCR擴增Fig. 1 Amplif cation of PDCoV CHN-HN-2014 Nsp5 gene by PCR

2.2 pET-28a-Nsp5重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將PCR擴增產(chǎn)物純化后用Nco I和Sal I雙酶切，插入經(jīng)同樣酶切的pET-28a（+）載體，獲得重組質(zhì)粒pET-28a-Nsp5。重組質(zhì)粒經(jīng)Nco I和Sal I雙酶切鑒定正確（圖2），表明Nsp5基因已經(jīng)成功插入pET-28a（+）中。進一步通過測序證實插入基因的位置、方向以及讀碼框均正確。

圖2 pET-28a-Nsp5質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 2 Identif cation of pET-28a-Nsp5 digested with restriction enzyme

2.3 重組Nsp5蛋白的誘導(dǎo)表達、可溶性分析及純化將pET-28a-Nsp5轉(zhuǎn)化BL21（DE3）后通過IPTG誘導(dǎo)表達，收集的樣品經(jīng)SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pET-28a-Nsp5經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可穩(wěn)定表達分子量大約為34 kDa的特異性蛋白，而空載體pET-28a（+）則沒有出現(xiàn)相應(yīng)的目的蛋白條帶。蛋白表達量隨著誘導(dǎo)時間延長逐漸增加，5 h后蛋白表達量基本不再增加（圖3）。

為了進一步驗證表達蛋白的特異性，將IPTG誘導(dǎo)5 h的細胞裂解液進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印PVDF膜，通過His標(biāo)簽抗體進行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)重組Nsp5蛋白的泳道在34 kDa處有特異性反應(yīng)條帶，而空載體轉(zhuǎn)化菌及未誘導(dǎo)的菌液在相應(yīng)位置則沒有反應(yīng)條帶（圖4），表明Nsp5蛋白正確表達并且具有良好的反應(yīng)活性。

將誘導(dǎo)后收集的菌體重懸后進行液壓破碎，離心后分別收取上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)重組Nsp5蛋白主要以可溶性蛋白進行表達（圖5）。將收集的可溶性蛋白經(jīng)Ni-NTA柱進行純化，SDS-PAGE分析證實純化的蛋白純度在90% 以上（圖5）。

2.4 Nsp5蛋白酶的酶反應(yīng)曲線 將純化的Nsp5蛋白與合成的底物混合后，置于多功能酶標(biāo)儀中，將溫度設(shè)置為37℃進行反應(yīng)，每隔1 min測定體系的熒光強度，共測定23次。從測定的結(jié)果可以看出，體系中的熒光強度隨著酶反應(yīng)時間的進行而不斷增加（圖6），表明Nsp5存在著切割活性。

圖3 重組質(zhì)粒pET-28a-Nsp5的原核表達Fig. 3 Prokaryotic expression of the recombinant plasmid pET-28a-Nsp5

圖4 重組Nsp5蛋白的Western blot檢測Fig. 4 Identif cation of recombinant Nsp5 protein by Western blot

圖5 重組Nsp5蛋白的可溶性分析及純化Fig. 5 Solubility analysis and purif cation of the recombinant Nsp5 protein

圖6 Nsp5蛋白酶反應(yīng)曲線Fig. 6 Reaction curve of Nsp5 protease

3 討論

自2014年P(guān)DCoV在美國大規(guī)模爆發(fā)以來[3]，對養(yǎng)豬業(yè)的危害逐漸引起人們的重視。同時，PDCoV是目前唯一成功被分離的δ冠狀病毒，已成為研究δ冠狀病毒致病與免疫機理的良好模型，對其進行深入研究具有重要的基礎(chǔ)研究意義。

冠狀病毒在基因組轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中，位于基因組5' 端的第一個開放閱讀框架所編碼的多聚蛋白pp1a和pp1b首先被翻譯出來，隨后被病毒編碼的木瓜樣蛋白酶與3C樣蛋白酶切割加工成為成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白[9]。木瓜樣蛋白酶由Nsp3編碼，主要負責(zé)Nsp1～Nsp4（α、β冠狀病毒）以及Nsp2～Nsp4（γ、δ冠狀病毒）的切割，而3C樣蛋白酶由Nsp5編碼，負責(zé)對Nsp4～Nsp16進行切割，因此Nsp5也被稱為冠狀病毒的主蛋白酶[9]。冠狀病毒3C樣蛋白酶的切割位點非常保守，而且對底物識別具有很強的特異性。根據(jù)這一特性，我們預(yù)測了PDCoV 非結(jié)構(gòu)蛋白的切割位點，并據(jù)此合成了含有PDCoV Nsp4/Nsp5切割位點的十二肽底物（LKTKLQ↓AGIKIL）。采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法證實體外表達純化的PDCoV Nsp5具有切割活性，通過生物化學(xué)實驗證實了預(yù)測的切割位點正確。

研究發(fā)現(xiàn)，在體外表達SARS-CoV Nsp5時，蛋白酶的兩端是否帶有標(biāo)簽以及標(biāo)簽的長度對其蛋白酶活性有非常重要的影響[12,13]。在本研究中，曾將6xHis標(biāo)簽置于Nsp5的N端，發(fā)現(xiàn)其蛋白酶活性不強，于是將6xHis標(biāo)簽置于Nsp5的C端，結(jié)果顯示純化的重組蛋白的蛋白酶活性顯著增強，推測6xHis標(biāo)簽在N端時影響了PDCoV Nsp5的結(jié)構(gòu)，從而降低了其蛋白酶活性。

作為冠狀病毒的主蛋白酶，Nsp5不僅在病毒非結(jié)構(gòu)蛋白加工方面發(fā)揮重要作用，而且還參與酶解宿主蛋白、RNA結(jié)合以及病毒復(fù)制等過程[14]，因此一直被認為是開發(fā)抗冠狀病毒藥物的最好靶標(biāo)。本研究通過基因工程方法獲得了具有活性的PDCoV 3C樣蛋白酶，為抗PDCoV抑制劑及3C蛋白酶檢測方法的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。另外，以前的研究發(fā)現(xiàn)SARSCoV的Nsp5具有拮抗干擾素產(chǎn)生的特性，但其作用機制不清楚。2015年本課題組研究證實豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）Nsp5通過切割干擾素信號通路中的關(guān)鍵分子NEMO負調(diào)控干擾素產(chǎn)生[15]。目前關(guān)于PDCoV調(diào)控干擾素產(chǎn)生的信號通路還未見報道，但我們的初步研究證實PDCoV感染能夠抑制雙鏈RNA類似物poly（I∶C）誘導(dǎo)的干擾素產(chǎn)生（待發(fā)表）。PDCoV的Nsp5是否與PEDV的Nsp5一樣通過切割免疫通路中的關(guān)鍵分子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，值得進一步深入研究。

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PROKARYOTIC EXPRESSION AND PROTEASE ACTIVITY OF PORCINE DELTACORONAVIRUS NSP5

ZHANG Huan1, XIAO Wen-jie2, ZENG Zhe1, ZHU Xin-yu1, DONG Nan1, PENG Gui-qing1

(1. College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. No.1 Middle School Affiliated to Central China Normal University, Wuhan 430223, China)

Porcine deltacoronavirus (PDCoV) is a newly identif ed enteropathogenic coronavirus, causing diarrhea in suckling piglets. The nonstructural protein 5 (Nsp5) encoded by coronavirus is a 3C-like protease, and plays a key role in the process of viral polyproteins and immune regulation. In this study, the Nsp5 gene of PDCoV CHN-HN-2014 strain was amplified and subcloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+), generating the recombinant expressing plasmid. After induction with IPTG, the fusion protein Nsp5-His was eff ciently expressed in E. coli BL21 (DE3) in soluble form. The recombinant protein was further purif ed with Ni-NTA aff nity column and its protease activity was detected by f uorescence resonance energy transfer (FRET) method. The results showed that the purif ed recombinant protein eff ciently cut the chemosynthetic 12 peptide that contained the N-terminal cleavage site of PDCoV Nsp5, indicating that Nsp5 possessed protease activity. The progress in cloning, expression and analysis of protease activity of Nsp5 will lay the foundation for the future functional research of PDCoV.

Porcine deltacoronavirus; Nsp5; protease activity

S852.659.6

A

1674-6422（2016）06-0006-6

2016-04-19

國家科技支撐計劃（2015BAD12B02）

張歡，女，博士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

彭貴青，E-mail∶ penggq@mail.hzau.edu.cn