楊 眉，蔣春樊，哈春芳

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·論著·

雌激素介導(dǎo)骨橋蛋白/基質(zhì)金屬蛋白酶9通路調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞侵襲性的研究

楊 眉，蔣春樊，哈春芳

【摘要】目的探討子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞骨橋蛋白(OPN)與基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞遷移的關(guān)系。方法選取2013年8月—2014年3月于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院因“卵巢巧克力囊腫”行剝除術(shù)或患側(cè)附件切除術(shù)的9例患者異位子宮內(nèi)膜，同期取行輸卵管絕育術(shù)的10例患者的正常子宮內(nèi)膜。子宮內(nèi)膜組織培養(yǎng)，分離子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞。檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥及正常子宮內(nèi)膜OPN、MMP-9蛋白及mRNA表達(dá)水平。加入最適宜濃度的17β-雌二醇，培養(yǎng)最適宜時(shí)間，檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞OPN、MMP-9蛋白表達(dá)水平。子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞分別進(jìn)行無(wú)意義鏈siRNA轉(zhuǎn)染和siRNA-OPN轉(zhuǎn)染，以無(wú)意義鏈siRNA轉(zhuǎn)染作為對(duì)照，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞OPN、MMP-9蛋白表達(dá)水平。原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)，配置成1×106/ml細(xì)胞懸液。侵襲小室下室分別加入500 μl的17β-雌二醇(10.0 nmol/L)、siRNA-OPN及無(wú)意義鏈siRNA，培養(yǎng)后在顯微鏡下取16個(gè)固定位置的視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。結(jié)果通過(guò)原代培養(yǎng)技術(shù)成功分離子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，腺上皮細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)，呈鋪路石樣，均在細(xì)胞胞質(zhì)檢測(cè)到OPN及MMP-9的表達(dá)。子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞OPN、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(2.53±0.57)、(3.12±0.69)，高于正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tOPN=-2.310,tMMP-9=-1.375，P<0.05)。子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞OPN、MMP-9mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(2.91±0.73)和(3.33±0.54)，高于正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tOPN=1.681,tMMP-9=-2.362；P<0.05)。OPN及MMP-9 mRNA均在17β-雌二醇濃度為10.0 nmol/L,培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)達(dá)到高峰。培養(yǎng)48 h后，10.0 nmol/L 17β-雌二醇干預(yù)的子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞OPN及MMP-9蛋白表達(dá)高于未加藥干預(yù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞經(jīng)siRNA-OPN干擾后，OPN、MMP-9蛋白表達(dá)水平低于經(jīng)無(wú)意義siRNA干擾，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同干預(yù)措施處理后，子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中，17β-雌二醇干預(yù)的子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)高于未處理干預(yù)，siRNA-OPN干預(yù)的子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)多于未處理干預(yù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論雌激素誘導(dǎo)的OPN蛋白表達(dá)增加導(dǎo)致MMP-9的表達(dá)上調(diào)，可能與子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的遷移有關(guān)。

子宮內(nèi)膜異位癥是臨床常見的婦科慢性疾病，其具體發(fā)生機(jī)制仍不明確。異位的子宮內(nèi)膜能夠侵襲和轉(zhuǎn)移到不同的器官，使其功能被破壞，表現(xiàn)出與惡性腫瘤相似的特征。骨橋蛋白(OPN)是一種結(jié)合糖蛋白，在骨基質(zhì)中首先被發(fā)現(xiàn)，與腫瘤細(xì)胞的黏附、轉(zhuǎn)移、抗凋亡密切相關(guān)[1]。基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)是一種鋅酯酶，能夠促進(jìn)膠原酶Ⅳ的降解，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。有報(bào)道稱，OPN能夠通過(guò)活化相應(yīng)的分子通路激活MMP-9，促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展[2]，因此，OPN/MMP-9通路可能是一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移分子機(jī)制。目前已明確，OPN及MMP-9均在正常子宮內(nèi)膜晚分泌期表達(dá)[3]，且在子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜中，OPN及MMP-9的表達(dá)水平均明顯高于正常人[4]。因此，筆者推斷，與腫瘤細(xì)胞相似，OPN/MMP-9通路可能在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的遷移中發(fā)揮重要作用，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。

子宮內(nèi)膜異位癥被認(rèn)定是雌激素依賴型疾病，全身或局部合成的雌激素能夠促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展[5]。促性腺激素釋放激素類似物(GnRH-a)等藥物即是通過(guò)抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，降低局部雌激素水平來(lái)加速其凋亡[6]，成為臨床上最常用的治療子宮內(nèi)膜異位癥的藥物。目前，雌激素調(diào)控OPN及MMP-9水平的具體機(jī)制尚不明確。根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)，筆者假設(shè)：局部雌激素水平升高，導(dǎo)致OPN水平升高，進(jìn)而通過(guò)上調(diào)MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移，引起子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。本研究采用雌激素及siRNA-OPN對(duì)原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察OPN、MMP-9 mRNA及蛋白的表達(dá)變化，探討其在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生機(jī)制中的作用。

1材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源選取2013年8月—2014年3月于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院因“卵巢巧克力囊腫”行剝除術(shù)或患側(cè)附件切除術(shù)的患者9例，術(shù)中行診刮術(shù)獲取子宮內(nèi)膜。經(jīng)2位病理科醫(yī)師再次對(duì)其病理切片復(fù)診后明確其子宮內(nèi)膜異位癥診斷?；颊呔幱谠陆?jīng)分泌期，且依據(jù)美國(guó)生育協(xié)會(huì)1985年“修正子宮內(nèi)膜異位癥分期法”[7]，均為子宮內(nèi)膜異位癥Ⅳ期，無(wú)重大內(nèi)科疾病，否認(rèn)激素治療史。另同期選取10例行輸卵管絕育術(shù)患者，術(shù)中排除合并子宮內(nèi)膜異位癥，同為月經(jīng)分泌期，行診刮取得在位內(nèi)膜。本研究獲患者知情同意及本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)取得子宮內(nèi)膜組織在低溫條件下迅速送往實(shí)驗(yàn)室。首先，用無(wú)菌無(wú)酚紅Hank′s平衡鹽緩沖溶液(HBSS)清洗3次，剪刀剪成約1 mm3，再用10 ml 0.03%HBSS溶解的膠原酶Ⅳ在37 ℃條件下消化40 min。然后500 r/min離心1 min，未被消化的組織被沉淀分離出，進(jìn)行下一次消化。懸浮的上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞則被差速離心分離開。經(jīng)過(guò)選擇性接觸再次純化子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞。以無(wú)酚紅的DMEM/Ham′s F12加入10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素及 2 μg/ml的氟康唑組成培養(yǎng)液培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，隔日換液直至細(xì)胞達(dá)到90%融合。

1.3免疫細(xì)胞化學(xué)將胰酶消化并計(jì)數(shù)的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞種植于經(jīng)預(yù)處理的蓋玻片上。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%融合時(shí)，取出爬片，并將其植入4%多聚甲醛中，將細(xì)胞室溫固定30 min。波形蛋白、光譜角蛋白、OPN、MMP-9等抗體(Abcam公司)用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞上的相應(yīng)抗原。各抗體溶解比例如下：波形蛋白(1∶500)、光譜角蛋白(1∶500)、OPN(1∶200)及MMP-9(1∶300)。采用二抗(PV900，Zymed Laboratory,美國(guó))孵育細(xì)胞，DAB顯像，蘇木精染色。

1.4雌激素干預(yù)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞達(dá)到60%融合時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，將細(xì)胞置于無(wú)胎牛血清的DMEM/Ham′s F12培養(yǎng)液中12 h。后將培養(yǎng)液換為含不同濃度的17β-雌二醇及活性炭的DMEM/Ham′s F12培養(yǎng)液，進(jìn)一步去除胎牛血清。17β-雌二醇的濃度分別設(shè)置為0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 nmol/L。48 h后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同濃度17β-雌二醇干預(yù)后OPN及MMP-9的mRNA水平。若OPN和MMP-9的mRNA水平在某一特定濃度的17β-雌二醇刺激后達(dá)到最大值，該濃度即為17β-雌二醇的最適宜濃度。取最適宜濃度的17β-雌二醇對(duì)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，分別培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72 h。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)17β-雌二醇干預(yù)不同時(shí)間后OPN及MMP-9的mRNA表達(dá)水平，若OPN和MMP-9的mRNA表達(dá)水平在某一特定培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到最大值，該培養(yǎng)時(shí)間即為17β-雌二醇干預(yù)的最適宜時(shí)間。

1.5siRNA干擾實(shí)驗(yàn)子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞分別進(jìn)行無(wú)意義鏈siRNA轉(zhuǎn)染和siRNA-OPN轉(zhuǎn)染，以無(wú)意義鏈siRNA轉(zhuǎn)染作為對(duì)照。siRNA-OPN引物序列：正義鏈:5′-GGUCAAAAUCUAAGAAGUUTT-3′,反義鏈：5′-AACUUCUUAGAUUUUGACCTC-3′；無(wú)意義鏈siRNA引物序列：正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。引物序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)。采用羅氏X-tremeGENE轉(zhuǎn)染試劑，將siRNA寡核苷酸轉(zhuǎn)入子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞中,每2×105個(gè)細(xì)胞使用10 μl轉(zhuǎn)染試劑和2.5 μg siRNA。轉(zhuǎn)染步驟均根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行，72 h后采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR在10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入1 ml TRIZOL裂解細(xì)胞,用紫外分光光度計(jì)分別讀取其在波長(zhǎng)260、280 nm處的吸光度值,并計(jì)算出RNA的純度和濃度；RNA凝膠電泳檢測(cè)后行反轉(zhuǎn)錄；通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并由上海生工合成引物。OPN引物序列：正義鏈：5′-ACAGCCGTGGGAAGGACAGTTA-3′，反義鏈：5′- CCTGACTATCAATCACATCGGAATG -3′；MMP-9引物序列：正義鏈：5′-AGTCCACCCTTGTGCTCTTCCC-3′，反義鏈：5′- TCTGCCACCCGAGTGTAACCAT-3′；內(nèi)參β-actin引物序列：正義鏈：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，反義鏈：5′- GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。

PCR反應(yīng)體系的總體積20 μl，包括變性處理的RNA溶液12 μl,dNTP混合物(10 mmol/L)2 μl,RNA酶抑制劑(10 U/μl)1 μl,5×RT Buffer 4 μl,ReverTra Ace 1 μl。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，變性、退火、延伸共循環(huán)40次。結(jié)束前72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。采用2-ΔΔCt法計(jì)算OPN、MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7蛋白免疫印跡法取最適宜濃度的17β-雌二醇干預(yù)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，培養(yǎng)最適宜時(shí)間，以未加藥為對(duì)照。用冷PBS沖洗2次，250 μl RIPA(含10 μl蛋白酶抑制劑混合物)提取蛋白質(zhì)。制備SDS-PAGE膠，上樣后電泳分離蛋白樣本，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗、二抗孵育，ECL法檢測(cè)蛋白，所得膠片采用ImageJ軟件掃描其灰度值，得出OPN、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8穿膜實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)，細(xì)胞撤血清饑餓12～24 h。0.25%胰酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)后用無(wú)血清的DMEM/Ham′s F12培養(yǎng)液配置成1×106/ml細(xì)胞懸液。侵襲小室上室每孔加入細(xì)胞懸液100 μl，下室分別加入500 μl 的17β-雌二醇(10.0 nmol/L)、siRNA-OPN及無(wú)意義鏈siRNA，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h。將侵襲小室從培養(yǎng)板中取出，棄去液體，將基底膜膠用2根棉簽擦拭干凈，PBS洗后加入4%甲醛溶液，固定15～20 min。再用PBS洗5 min。用手術(shù)刀將膜切下，臺(tái)盼藍(lán)染色，貼在玻片上，滴二甲苯，蓋上蓋玻片，使用Leica DC 300F正置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，取16個(gè)固定位置的視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2結(jié)果

2.1子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞鑒定通過(guò)原代培養(yǎng)技術(shù)成功分離子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，腺上皮細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)，呈鋪路石樣。利用上皮來(lái)源細(xì)胞的標(biāo)志物廣譜角蛋白及間葉來(lái)源細(xì)胞的標(biāo)記物波形蛋白，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。結(jié)果顯示多數(shù)細(xì)胞pan-CK染色陽(yáng)性，而VIMITEN染色陰性(見圖1a、1b，本文彩圖詳見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net)，提示得到純度95%以上的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法在原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中檢測(cè)到OPN及MMP-9的表達(dá)，均主要表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)(見圖1c、1d)。

注：圖a、b分別示pan-CK染色陽(yáng)性及VIMITEN染色陰性；圖c、d示OPN、MMP-9位于細(xì)胞胞質(zhì)中

圖1免疫組化檢測(cè)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞OPN、MMP-9的表達(dá)

(×200)

Figure1OPN,MMP-9weredetectedincytoplasmsofendometrialepithelialcellswithimmunohistochemistry

2.2OPN、MMP-9蛋白及mRNA的相對(duì)表達(dá)水平正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞OPN、MMP-9蛋白表達(dá)量設(shè)定為1，子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞OPN、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(2.53±0.57)、(3.12±0.69)，高于正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tOPN=-2.310,tMMP-9=-1.375，P<0.05)。正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞OPN及MMP-9 mRNA表達(dá)量設(shè)定為1，子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞OPN、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(2.91±0.73)和(3.33±0.54)，高于正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tOPN=1.681,tMMP-9=-2.362,P<0.05)。

2.317β-雌二醇干預(yù)OPN及MMP-9 mRNA均在17β-雌二醇濃度為10.0 nmol/L,培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為48 h時(shí)達(dá)到高峰(見圖2、3)。培養(yǎng)48 h后，10.0 nmol/L 17β-雌二醇干預(yù)的子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞OPN及MMP-9蛋白表達(dá)高于未加藥干預(yù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

2.4siRNA干擾實(shí)驗(yàn)子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞經(jīng)siRNA-OPN干擾后，OPN、MMP-9蛋白表達(dá)水平低于經(jīng)無(wú)意義siRNA干擾，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

圖2子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞不同17β-雌二醇干預(yù)濃度OPN及MMP-9 mRNA表達(dá)水平

Figure 217 β-estradiol dose-dependent response of OPN and MMP-9 mRNA expression in EEECs

圖3子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間OPN及MMP-9 mRNA表達(dá)水平

Figure 3Time-dependent response of OPN and MMP-9 mRNA expression in EEECs

Table 1Comparison of OPN and MMP-9 protein expression in EEECs between different treatments

干預(yù)措施OPNMMP-9未加藥2.32±0.463.02±1.2817β-雌二醇48.91±6.2177.35±10.67t值-1.824-2.351P值0.0030.001

2.5穿膜實(shí)驗(yàn)未處理、無(wú)意義鏈siRNA干擾、siRNA-OPN干擾及17β-雌二醇干預(yù)后，子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(65±12)、(62±18)、(25±8)、(250±39)個(gè)。不同干預(yù)措施處理后，子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.927，P<0.05)；其中，17β-雌二醇干預(yù)的子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)多于未處理干預(yù)，siRNA-OPN干擾的子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)少于未處理干預(yù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖4)。

Table 2Comparison of OPN and MMP-9 protein expression in EEECs between various siRNA interventions

干擾序列OPNMMP-9無(wú)意義siRNA8.13±2.436.20±1.61siRNA-OPN3.01±1.212.85±1.67t值-2.281-1.670P值0.0320.028

注：圖a～d依次為未處理、無(wú)意義鏈siRNA干擾、siRNA-OPN干擾及17β-雌二醇干預(yù)的子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞

圖4子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)(臺(tái)盼藍(lán)染色，×100)

Figure 4Transwell assay of the EEECs

3討論

子宮內(nèi)膜異位癥是常見婦科疾病，其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。子宮內(nèi)膜細(xì)胞從正常位置分離，到達(dá)并侵入子宮外器官和組織，與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移方式極為相似。許多與惡性腫瘤病理過(guò)程密切相關(guān)的蛋白如OPN及MMP-9，同樣被報(bào)道與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生密切相關(guān)[8-9]。為進(jìn)一步闡明子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制，本研究采用雌激素及siRNA-OPN對(duì)原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，并檢測(cè)干預(yù)前后子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞OPN、MMP-9 mRNA及蛋白的表達(dá)，以穿膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞侵襲性的變化。

OPN是一種分泌型磷酸糖蛋白，與細(xì)胞黏附、趨化、血管新生、抗凋亡等活動(dòng)密切相關(guān)。有研究證實(shí)，OPN在多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)[1]，其可能是惡性腫瘤早期侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵因子。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，為分子量最大的明膠酶,在腫瘤細(xì)胞膜的表面表達(dá)，能降解細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅳ型、Ⅴ型膠原和明膠，促進(jìn)血管生成，為腫瘤細(xì)胞的侵襲浸潤(rùn)創(chuàng)造條件[10]。有報(bào)道稱，OPN能活化PI3-K/Akt通路，上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)，經(jīng)由v3整合素，通過(guò)尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)和MMP-9降解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[2]。亦有報(bào)道稱，在胃癌的發(fā)病過(guò)程中，OPN通過(guò)NF-κB通路活化MMP-2和MMP-9，促進(jìn)胃癌的進(jìn)展[11]。近年多個(gè)關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥的分子機(jī)制研究顯示，OPN、MMP-9在整個(gè)生殖周期中均可波動(dòng)性的表達(dá)于正常子宮內(nèi)膜腺體，而在同樣月經(jīng)周期的子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位、異位內(nèi)膜腺體中，OPN、MMP-9均呈明顯高表達(dá)[8-9]。上述研究表明，OPN與MMP-9的高表達(dá)可能是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜分離、黏附并遷移至子宮外組織的關(guān)鍵因素。

子宮內(nèi)膜異位癥為性激素依賴性疾病。國(guó)內(nèi)外眾多研究顯示，子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病過(guò)程中，異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)和侵襲首先是細(xì)胞的異位黏附、轉(zhuǎn)移，而子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞被認(rèn)為在該過(guò)程發(fā)揮主要作用[12]，而雌激素水平在此過(guò)程中也發(fā)揮重要調(diào)控作用[13-14]；機(jī)制學(xué)研究顯示，雌激素需要與內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的相應(yīng)受體特異性結(jié)合，啟動(dòng)相應(yīng)的分子信號(hào)通路，對(duì)基因表達(dá)及細(xì)胞的代謝進(jìn)行調(diào)控[15]，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的周期性變化，并通過(guò)某些特定因子的表達(dá)使細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞異位黏附侵襲。

本研究對(duì)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞進(jìn)行分離并原代培養(yǎng)，排除了混雜的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞。通過(guò)不同劑量雌激素的干預(yù)，子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞OPN及MMP-9表達(dá)上調(diào)。表明OPN及MMP-9的水平與局部雌激素水平密切相關(guān)。雌激素是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵激素，其通過(guò)與雌激素受體結(jié)合而發(fā)揮作用，包括ER-α和ER-β[16]。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體在子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞中表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜。長(zhǎng)期局部雌激素刺激可能會(huì)導(dǎo)致雌激素受體的過(guò)表達(dá)[17]，而雌激素與受體的過(guò)度結(jié)合將活化下游基因表達(dá)。本研究印證了雌激素是促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞OPN及MMP-9高表達(dá)的關(guān)鍵因素這一假說(shuō)。

本研究采用穿膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)雌激素及siRNA-OPN干擾后子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞侵襲性的變化，以驗(yàn)證子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞的遷移是否受到雌激素及OPN/MMP-9通路的調(diào)節(jié)，結(jié)果顯示雌激素干擾后子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)增多，而siRNA-OPN干擾則使穿膜細(xì)胞數(shù)減少。說(shuō)明雌激素/OPN/MMP-9通路在子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞的遷移過(guò)程中發(fā)揮作用。

目前，子宮內(nèi)膜異位癥的藥物治療主要是以抑制雌激素合成使異位內(nèi)膜萎縮，阻斷下丘腦-卵巢軸的刺激和出血周期為目的的性激素治療，其僅適用于有慢性盆腔痛、痛經(jīng)癥狀明顯、有生育要求而無(wú)卵巢囊腫形成者，存在依從性差、易復(fù)發(fā)等問(wèn)題。本研究對(duì)雌激素調(diào)控OPN、MMP-9的細(xì)胞信號(hào)途徑和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步研究，力圖推動(dòng)藥物治療子宮內(nèi)膜異位癥的新進(jìn)展，為后續(xù)從機(jī)制上對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥進(jìn)行有效的藥物干預(yù)、指導(dǎo)臨床治療和隨訪提供依據(jù)，降低復(fù)發(fā)率，提高療效。

作者貢獻(xiàn)：楊眉進(jìn)行課題設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；蔣春樊進(jìn)行課題實(shí)施、評(píng)估、資料收集；哈春芳進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

參考文獻(xiàn)

[1]Anborgh PH,Mutrie JC,Tuck AB，et al.Role of the metastasis-promoting protein osteopontin in the tumour microenvironment[J].J Cell Mol Med，2010,14(8):2037-2044.

[2]Song G,Cai QF,Mao YB,et al.Osteopontin promotes ovarian cancer progression and cell survival and increases HIF-1alpha expression through the PI3-K/Akt pathway[J].Cancer Sci,2008,99(10):1901-1907.

[3]Allan G,Campen C,Hodgen G,et al.Identification of genes with differential regulation in primate endometrium during the proliferative and secretory phases of the cycle[J].Endocr Res，2003,29(1):53-65.

[4]Cho S,Ahn YS,Choi YS,et al.Endometrial osteopontin mRNA expression and plasma osteopontin levels are increased in patients with endometriosis[J].Am J Reprod Immunol，2009,61(4):286-293.

[5]Rizner TL.Estrogen metabolism and action in endometriosis[J].Mol Cell Endocrinol，2009,307(1/2)： 8-18.

[6]Meresman GF,Bilotas M,Buquet RA，et al.Gonadotropin-releasing hormone agonist induces apoptosis and reduces cell proliferation in eutopic endometrial cultures from women with endometriosis[J].Fertil Steril，2003，80(S2)：702-707.

[7]Zhang HX.Staging and classification of endometriosis:current systems and the novel yao classification[J].Journal of International Obstetrics and Gynecology,2012,39(5):471-475.(in Chinese)

張煥曉.子宮內(nèi)膜異位癥分型的思考、建議及意義[J].國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志,2012,39(5):471-475.

[8]Ueda M,Yamashita Y,Takehara M,et al.Gene expression of adhesion molecules and matrix metalloproteinases in endometriosis[J].Gynecol Endocrinol，2002，16(5)：391-402.

[9]Han YJ,Kim HN,Yoon JK，et al.Haplotype analysis of the matrix metalloproteinase-9 gene associated with advanced-stage endometriosis[J].Fertil Steril，2009,91(6):2324-2330.

[10]Curry TE Jr,Osteen KG.The matrix metalloproteinase system:changes,regulation,and impact throughout the ovarian and uterine reproductive cycle[J].Endocr Rev，2003，24(4)：428-465.

[11]Liu J,Liu Q,Wan Y，et al.Osteopontin promotes the progression of gastric cancer through the NF-κB pathway regulated by the MAPK and PI3K[J].Int J Oncol，2014,45(1):282-290.

[12]Witz CA,Thomas MR,Montoya-Rodriguez IA,et al.Short-term culture of peritoneum explants confirms attachment of endometrium to intact peritoneal mesothelium[J].Fertil Steril，2001，75(2)：385-390.

[13]Huber A,Keck CC,Hefler LA,et al.Ten estrogen-related polymorphisms and endometriosis:a study of multiple gene-gene in terections[J].Obstet Gynecol,2005,106(5 Pt 1):753-781.

[14]Bulun SE,Cheng YH,Yin P,et al.Progesterone resistance in endometriosis:link to failure to metabolize estradiol[J].Mol Cell Endocrinol,2006,248(1/2):1321-1331.

[15]Pavone ME,Bulun SE.Aromatase inhibitors for the treatment of endometriosis[J].Fertil Steril，2012，98(6)：1370-1379.

[16]Bulun SE,Monsavais D,Pavone ME,et al.Role of estrogen receptor-beta in endometriosis[J].Semin Reprod Med，2012,30(1):39-45.

[17]Huhtinen K,Desai R,Salminen A，et al.Endometrial and endometriotic concentrations of estrone and estradiol are determined by local metabolism rather than circulating levels[J].J Clin Endocrinol Metab，2012，97(11)：4228-4235.

(本文編輯：吳立波)------------------------------------------------------------------------------------------------

【關(guān)鍵詞】子宮內(nèi)膜異位癥；骨橋蛋白質(zhì)；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；雌激素類

楊眉，蔣春樊，哈春芳.雌激素介導(dǎo)骨橋蛋白/基質(zhì)金屬蛋白酶9通路調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞侵襲性的研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(5)：554-559.[www.chinagp.net]

Yang M，Jiang CF,Ha CF.Up-regulation of matrix metalloproteinase-9 via activation of the osteopontin induced by estrogen correlates with migration of endometrial epithelial cells in endometriosis[J].Chinese General Practice，2016，19(5)：554-559.

Up-regulation of Matrix Metalloproteinase-9 via Activation of the Osteopontin Induced by Estrogen Correlates With Migration of Endometrial Epithelial Cells in EndometriosisYANGMei，JIANGChun-fan,HAChun-fang.NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of osteopontin(OPN) and matrix metalloproteinase-9(MMP-9) and endometriotic migration of the endometrial epithelial cells(EECs) from patients with endometriosis.MethodsNine women with ovarian endometriosis cyst were recruited before surgery.All these patients underwent oophorocystectomy or adnexectomy in the General Hospital,Ningxia Medical University from August,2013 to March,2014.Ten women undergoing tubal ligation for sterilization were recruited as controls.The primary culture of EECs were performed to investigated the mRNA and protein expression of OPN and MMP-9 in normal endometrial epithelial cells(NEECs) and in the endometrial epithelial cells from patients with endometriosis(EEECs).The protein expression of OPN and MMP-9 in EEECs were investigated after those cells were treated with 17 β-estradiol at the optimum concentration and time point.The protein expression of OPN and MMP-9 in EEECs were investigated after OPN-specific siRNA or scrambled siRNA interference，the scrambled siRNA interference was used as control.When EEECs had reached 90% confluence,they were made cell suspension at concentration of 1×106/ml.500 μl 17 β-estradiol ，OPN-specific siRNA or scrambled siRNA were respectively added to the lower chamber,the cells in 16 visual fields per insert were counted and photographed after cell culture.ResultsEECs grew clonally in clumps and displayed the typical cobblestone morphology.The expression of OPN and MMP-9 was detected in the cytoplasm of most EECs.The relative protein expression levels of OPN and MMP-9 in EEECs were (2.53±0.57)and(3.12±0.69)，were higher than those in NEECs (tOPN=-2.310,tMMP-9=-1.375，P<0.05).The mRNA expression levels of OPN and MMP-9 in EEECs were (2.91±0.73) and (3.33±0.54)，were higher than those in NEECs(tOPN=1.681,tMMP-9=-2.362;P<0.05).OPN and MMP-9 mRNA expression levels reached their maximum 48 h after the beginning of the intervention at 10.0 nmol/L of 17 β-estradiol.The protein expression levels of OPN and MMP-9 were remarkably increased by 10.0 nmol/L of 17 β-estradiol,48 h after the beginning of the intervention compared with the untreated group or decreased by siRNA-OPN interference compared with the scrambled siRNA interference group in EEECs(P<0.05).There were significant differences after different treatment about the migration abilities of EEECs.The cells counted on the lower surface of the insert membrane were increased after cells were treated with 17 β-estradiol;on the other hand,they were reduced with siRNA-OPN interference(P<0.05).ConclusionThe up-regulation of MMP-9 via activation of OPN induced by estrogen may correlate with the migration of endometrial epithelial cells in endometriosis patients.

【Key words】Endometriosis；Osteopontin；Matrix metalloproteinase 9；Estrogens

(收稿日期：2015-08-29；修回日期：2015-11-20)

【中圖分類號(hào)】R 711.71

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.05.014

通信作者：哈春芳，750004寧夏銀川市，寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科；E-mail：hachunfang@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160078)
作者單位：750004寧夏銀川市，寧夏醫(yī)科大學(xué)(楊眉)；湖北省文理學(xué)院附屬襄陽(yáng)市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科(楊眉)，病理科(蔣春樊)；寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科(哈春芳)