魯義++++++姚嘉茵++++++堯新華++++++卿朝暉++++++童輝4++++劉玲

[摘要] 目的 探討Toll樣受體4（TLR4）抑制劑TAK-242對糖尿病周圍神經(jīng)痛（DPN）模型大鼠的治療效果及其可能的作用機(jī)制。 方法 SPF級雄性SD大鼠60只，隨機(jī)均分為3組，分別為正常對照組（NC組）、DPN模型組（DPN組）、TAK-242治療組（TAK組）。采用鏈脲佐菌素（STZ）方法建立DPN大鼠模型，采用ELISA及RT-PCR方法檢測DPN模型大鼠腰膨大脊髓組織的高遷移率族蛋白B1（HMGB1）-TLR4軸上下游基因（HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB、IL-6）的變化，分析上述細(xì)胞因子表達(dá)水平與大鼠疼痛行為的相關(guān)性。使用TLR4抑制劑TAK-242對DPN模型大鼠進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察其治療效果及對HMGB1-TLR4軸基因表達(dá)的影響。 結(jié)果 ELISA檢測顯示，DPN組大鼠的血清HMGB1、TLR4、IL-6表達(dá)水平均較NC組升高（P<0.05）；TAK組大鼠的TLR4及IL-6表達(dá)水平較DPN組下降（P<0.05）。RT-PCR檢測顯示，DPN組大鼠的HMGB1、TLR4、NF-κB、IL-6 mRNA表達(dá)水平較NC組升高（P<0.05）；TAK組大鼠的TLR4、NF-κB、IL-6 mRNA表達(dá)水平較DPN組下降（P<0.05）。 結(jié)論 TLR4抑制劑TAK-242通過阻斷HMGB1-TLR4軸對DPN模型動物起治療作用。

[關(guān)鍵詞] TLR4；TAK-242；HMGB1-TLR4；糖尿病周圍神經(jīng)痛

[中圖分類號] R587.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）02（a）-0009-04

Therapeutic effect of TAK-242 on diabetic peripheral neuropathic pain rats

LU Yi1 YAO Jia-yin2 YAO Xin-hua1▲ QING Zhao-hui1 TONG Hui1 LIU Ling1

1.Department of Anesthesiology，Guangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510130，China；2.Department of Gastroenterology，the Sixth Hospital Affiliated to Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510655，China

[Abstract] Objective To investigate the therapeutic effect and possible mechanisms of TLR4 inhibitor named TAK-242 on the diabetic peripheral neuropathic （DPN） rat model. Methods 60 male SD rats with SPF level were randomly divided into 3 groups， such as normal control group （NC group）， DPN model group （DPN group），TAK-242 treatment group （TAK group）.DPN rat models were established by using the method of streptozocin （STZ），and behavior analysis were made.Expressions of HMGB1-TLR4 related genes such as HMGB1，TLR4，MAPK，NF-κB and interleukin-6 （IL-6） were determined by RT-PCR.Correlations of genes mentioned above and the pain behavior of rats were analyzed.TLR4 inhibitor named TAK-242 was used for drug intervention.Its therapeutic effect and the effect on the expressions of HMGB1-TLR4 axis were observed. Results There was a significant increase in the spontaneous behavior and decrease in the pain threshold of rats in DNP group compared with NC group （P<0.05）.The serum expression of TLR4 and IL-6 in DNP group was significantly higher than those in NC group （P<0.05），and the expression of IL-6 and TLR4 in the TAK group was decreased compared with the model group as detected by ELISA （P<0.05）.The expressions of HMGB1，TLR4，NF-κB and IL-6 mRNA in DNP group was significantly higher than those in NC group （P<0.05），and the mRNA expression of TLR4，NF-κB and IL-6 in TAK group was decreased compared with DNP group as detected by RT-PCR （P<0.05）. Conclusion By blocking the HMGB1-TLR4 axis，TLR4 inhibitor TAK-242 plays a role of therapeutic effect in the treatment on DPN rats.

[Key words] TLR4；TAK-242；HMGB1-TLR4；Diabetic peripheral neuropathic

在糖尿病患者中約20%的患者合并有糖尿病周圍神經(jīng)病變，占糖尿病神經(jīng)病變的50%[1-2]，其中糖尿病周圍神經(jīng)痛（diabetic peripheral neuropathy，DPN）發(fā)病率為13%～26%[3-4]。最新研究認(rèn)為DPN的發(fā)生、發(fā)展與全身慢性炎性反應(yīng)密切相關(guān)，尤其周圍神經(jīng)局部免疫功能失常、細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)軸異常相關(guān)[5]。其中，高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）-Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）軸可能是神經(jīng)免疫性損傷的核心病因[6]。本研究擬探討HMGB1-TLR4軸在DPN發(fā)病機(jī)制中的作用，使用TLR4抑制劑TAK-242阻斷HMGB1-TLR4軸，觀察其對DPN的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性SD大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，由中山大學(xué)疼痛治療中心提供；安排專人采用專用飼料和水進(jìn)行喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證：SCXK（粵）2009-0011。實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施使用證：編號0044336。

1.2動物分組

60只大鼠隨機(jī)均分為3組，分別設(shè)為正常對照組（normal control group，NC組）、DPN模型組（DPN model group，DPN組）、TAK-242治療組（TAK-242 treatment group，TAK組）。

1.3動物模型的建立

采用鏈脲佐菌素（STZ）法建立模型。大鼠自動物實(shí)驗(yàn)中心取回，禁食不禁水24 h。大鼠禁食12 h后稱重，按照55 mg/kg一次性腹腔注射STZ溶液（美國Sigma公司）。腹腔注射48 h后用血糖分析儀測定大鼠尾靜脈血糖，空腹血糖>16.7 mmol/L的大鼠為成功的DPN模型大鼠，共得到40只（其中DPN組20只，TAK組20只）。正常對照組則腹腔注射相同劑量枸櫞酸/枸櫞酸鈉緩沖液，共得到20只。

1.4 干預(yù)措施

TAK組大鼠，在造模前1天，造模后第1、7天分別按大鼠體重給予腹腔注射3 mg/kg TAK-242[4]（購自美國Takeda公司）。NC組與DPN組分別在相同時(shí)間腹腔注射3 mg/kg的生理鹽水。造模后第14天結(jié)束實(shí)驗(yàn)，所有大鼠均麻醉下處死，心臟注射取血，離心后取血清至-4℃冰箱儲存；快速取出腰膨大，使用4%多聚甲醛固定，準(zhǔn)備行免疫組化檢測。留取腰膨大組織2～3 g，置于去RNA酶的Eppendorf管中，經(jīng)液氮后轉(zhuǎn)至-70℃冰箱，用于RT-PCR檢測。

1.5行為學(xué)分析

觀察大鼠有無自發(fā)性疼痛行為。造模后第1、7、14天，在室溫（24±1）℃的舒適、安靜環(huán)境下觀察大鼠的歩態(tài)和后肢的抬腳、護(hù)衛(wèi)姿勢、舔腳、腿的著地性或抗重力行為，以及是否有自殘形為。

1.6 ELISA檢測

根據(jù)試劑盒說明書操作（HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB及IL-6的ELISA試劑盒，均購自美國Invitrogen公司）。檢測各組大鼠血清HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB及IL-6的含量水平。

1.7 RT-PCR

取大鼠腰膨大脊髓組織，按Trizol試劑說明書提取肝臟總RNA。采用紫外分光光度計(jì)測定總RNA樣品的濃度和純度。取2 g總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 5 min，變性94℃ 30 s，退火59℃ 30 s。延伸72℃ 1 min。30個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸10 min。再取5 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳拍照。采用Quantity One軟件計(jì)算待測蛋白的基因和β-actin擴(kuò)增片斷的掃描密度比值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般狀態(tài)

NC組大鼠毛色有光澤，精神好，愛活動，食量、糞便均正常。DPN組大鼠自實(shí)驗(yàn)造模后，活動量減少，精神萎靡不振。TAK組大鼠活動稍差，毛色稍暗，大小便無異常，均無死亡。

2.2各組大鼠行為學(xué)的改變

DPN組大鼠自造模第2天開始出現(xiàn)痛覺步態(tài)，采取護(hù)衛(wèi)姿勢、舔腳等自發(fā)行為，造模第14天達(dá)到高峰。TAK組大鼠自發(fā)行為較DPN組少，第3次注射干預(yù)藥物后自發(fā)行為明顯減少。各組大鼠實(shí)驗(yàn)過程沒有觀察到大鼠有自殘行為。

2.3 各組大鼠血清中HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB、IL-6的表達(dá)量測定

DPN組大鼠血清中的HMGB1、TLR4、IL-6 mRNA表達(dá)均較NC組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TAK組的TLR4、IL-6 mRNA表達(dá)較DPN組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 三組大鼠的MAPK、NF-κB mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)（P>0.05）（圖1）。

2.4 各組大鼠腰膨大脊髓組織中HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB、IL-6 mRNA的表達(dá)量測定

DPN組的HMGB1、TLR4、NF-κB、IL-6 mRNA表達(dá)均較NC組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TAK組的TLR4、NF-κB、IL-6 mRNA表達(dá)較DPN組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組大鼠的MAPK mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖2）。

3 討論

目前普遍認(rèn)為DPN的發(fā)病與高血糖及由此帶來的一系列代謝紊亂關(guān)系密切。國內(nèi)外研究也表明該病的發(fā)生、發(fā)展與全身慢性炎性反應(yīng)密切相關(guān)，尤其與周圍神經(jīng)局部免疫功能失常、細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)軸異常相關(guān)[7-8]。

HMGB1是關(guān)節(jié)炎、癌癥、自身免疫性疾病和糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵性中間物質(zhì)。研究表明，HMGB1在糖尿病患者血漿中水平較高，且HMGB1表達(dá)水平與血糖水平高低呈正相關(guān)[9-10]。TLR是宿主抵抗病原菌入侵的主要識別和信號傳遞受體，而TLR4基因缺失小鼠，其神經(jīng)超敏性降低、脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活性和促炎性因子表達(dá)也降低[11-12]。在核內(nèi)，HMGB1與DNA結(jié)合，活化下游兩種不同信號通路激活——MAPK，NF-κB通路。NF-κB的活化引起IL-6等促炎癥因子的合成和釋放，如TNF-α和IL-1β，而MAPK通路激活在調(diào)節(jié)神經(jīng)元重塑方面有重要作用[13-15]。本研究顯示，DPN模型大鼠中血清中的HMGB1、TLR4、IL-6表達(dá)量及mRNA表達(dá)水平均較NC組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明HMGB1-TLR4在DNP的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

現(xiàn)階段，DPN的治療手段非常有限，在控制血糖的基礎(chǔ)上，傳統(tǒng)治療藥物包括抗抑郁藥、抗驚厥藥、抗痙攣藥及其他改善局部血流的藥物聯(lián)合運(yùn)用[16-18]。近年來，比較受關(guān)注的是靶向治療[19-20]。筆者采用TLR4抑制劑TAK-242對大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示TAK組的大鼠體內(nèi)TLR4、IL-6 mRNA較DPN組下降，提示TLR4抑制劑TAK-242可以有效阻斷HMGB1-TLR4，中斷促炎因子的釋放及其對機(jī)體的損傷，推測可將其作為一種有效的分子靶向治療方法，為臨床治療藥物的研究與拓展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2015-10-30 本文編輯：衛(wèi) 軻）