施春煜

（鄭州市第十一中學(xué)，河南鄭州 450002）

牛奶中β-內(nèi)酰胺酶半定量快速檢測(cè)試紙的研究

施春煜

（鄭州市第十一中學(xué)，河南鄭州 450002）

青霉素經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶分解得到的產(chǎn)物青霉噻唑酸具有還原性，與亞銅試劑發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)生成紫紅色絡(luò)合物，在一定范圍內(nèi)絡(luò)合物的顏色深淺與β-內(nèi)酰胺酶的量呈線(xiàn)性關(guān)系。將醋酸纖維素膜（CA）作為顯色層放在亞銅試劑（2.5%2,2'-聯(lián)喹啉乙醇溶液與0.2 mol/L CuSO4溶液均勻混合）中浸泡10 min，進(jìn)行顯色反應(yīng)，45℃下真空干燥30 min，制得β-內(nèi)酰胺酶半定量快速檢測(cè)試紙；配制β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液0～250 U/mL（0，6，12，25，50，100，150，200，250 U/mL），在顯色層進(jìn)行顯色反應(yīng)后，利用分光測(cè)色儀測(cè)定不同梯度下的顏色，得到L*值，a*值和b*值，并應(yīng)用色彩模塊軟件進(jìn)行模擬，按照β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)液的濃度梯度進(jìn)行排列、粘貼，制成β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)比色卡。通過(guò)試驗(yàn)得出β-內(nèi)酰胺酶在牛奶樣品中最低檢出限為6 U/mL，相對(duì)誤差范圍7.51%～15.38%。β-內(nèi)酰胺酶半定量快速檢測(cè)試紙具有快速、操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、易于普及和現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)。

β-內(nèi)酰胺酶；快速檢測(cè)試紙；牛奶

革蘭氏陽(yáng)性菌分泌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶（βlactamase），具有可選擇性酶解牛奶中殘留的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的能力，通過(guò)破壞7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）和6-氨基青霉烷酸（6-APA） 等結(jié)構(gòu)，進(jìn)而破壞抗生素并且使酶解后的物質(zhì)進(jìn)入奶制品中，酶聯(lián)免疫法、微生物法等常規(guī)檢測(cè)方法在檢測(cè)中失效，從而常規(guī)方法無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)出是否含有抗生素，掩蓋抗生素超標(biāo)的事實(shí)[1-2]。在堿性條件下，β-內(nèi)酰胺酶與青霉素發(fā)生反應(yīng)，親核性基團(tuán)向青霉素內(nèi)的β-內(nèi)酰胺環(huán)進(jìn)攻，破壞7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）和6-氨基青霉烷酸（6-APA）等結(jié)構(gòu)，β-內(nèi)酰胺環(huán)開(kāi)環(huán)后脫羧重排形成中間體青霉噻唑 酸[3-4]。實(shí)際生產(chǎn)中，有些微生物雖然可以產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，但由于牛奶組分、采奶方式、滅菌方法、包裝方法和儲(chǔ)存條件的影響，使產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的微生物無(wú)法生存，只有在人為條件下添加β-內(nèi)酰胺酶才能夠檢測(cè)到微生物分泌的β-內(nèi)酰胺酶[5]。因中間產(chǎn)物青霉噻唑酸具備將二價(jià)銅離子還原為一價(jià)銅離子的還原性。在Baker WL的報(bào)告中[6]，在2,9-二甲基-1,10-菲啰啉、2,2'-聯(lián)喹啉與一價(jià)銅的反應(yīng)中，前者的反應(yīng)環(huán)境要求pH值為3.2～6.5，生成黃色絡(luò)合物，于波長(zhǎng)460 nm處有最大吸收峰；后者的反應(yīng)環(huán)境要求pH值為3.5～7.0，生成紫紅色絡(luò)合物，于波長(zhǎng)520 nm處有最大吸收峰。牛奶的顏色為乳白色，pH值為6.8，在2,2'-聯(lián)喹啉反應(yīng)環(huán)境之間，且肉眼容易觀察到牛奶中出現(xiàn)紫紅色的顏色變化，故在2,9-二甲基-1,10-菲啰啉試劑與2,2'-聯(lián)喹啉試劑的選擇中，選擇2,2'-聯(lián)喹啉作為顯色劑，故以雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度法為基礎(chǔ)，建立一種快速、操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、易于普及和現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定的乳制品中β-內(nèi)酰胺酶半定量快速檢測(cè)方法。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

標(biāo)準(zhǔn)品β-內(nèi)酰胺酶、標(biāo)準(zhǔn)品青霉素鉀，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；2,2'-聯(lián)喹啉，購(gòu)自上海晶純?cè)噭┯邢薰?；三氯乙酸（TCA）、硫酸銅、冰醋酸，均為分析純，購(gòu)自洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠。

2.2 試驗(yàn)儀器

UV-6100型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；DZF-6090型真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SMY-2000型全自動(dòng)測(cè)色色差儀，北京盛名揚(yáng)科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；AUY220型電子天平，日本島津公司產(chǎn)品。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 檢測(cè)試紙的制備

亞銅試劑的配制：0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%的2,2'-聯(lián)喹啉乙醇溶液（B）；0.05，0.1，0.2，0.3，0.4 mol/L CuSO4的硫酸銅溶液（C），將B液和C液進(jìn)行梯度混合均勻后即得顯色液。將顯色層醋酸纖維素膜浸入上述顯色液中，顯色反應(yīng)10 min后，置于玻璃板上真空干燥箱中45℃下干燥30 min，制成顯色層，裁剪成10 cm×1.0 cm，將過(guò)濾層、顯色層和吸收材料層粘貼在基板上，得到β-內(nèi)酰胺酶半定量快速檢測(cè)試紙。

2.3.2 β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)比色卡的制備

（1）配制9份濃度為5 000 U/mL的青霉素底物溶液，分別加入濃度為0，6，12，25，50，100，150，200，250 U/mL β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻后于37℃下水浴60 min。

（2）取出后加入5 mL添加15%TCA，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，然后將上述制備β-內(nèi)酰胺酶半定量快速檢測(cè)試紙浸入上清液5～10 min后取出，進(jìn)行顯色反應(yīng)。

（3）使用測(cè)色儀測(cè)定顏色反應(yīng)的L*值，a*值和b*值，并利用計(jì)算機(jī)中的色彩模塊軟件對(duì)顏色反應(yīng)的數(shù)值進(jìn)行模擬，制作標(biāo)準(zhǔn)比色塊。按照β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)液的濃度梯度進(jìn)行排列、粘貼，制成β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)比色卡。

2.3.3 實(shí)際最低檢出限和精確度

（1）試紙實(shí)際最低檢出限。用市售牛奶配制含有0，4，6，12，25，50，100，150，200 U/mL β-內(nèi)酰胺酶，青霉素鉀底物濃度皆為5 000 U/mL的 9個(gè)樣品，于37℃下水浴1 h，按1∶1比例添加15%的TCA溶液，倒入離心管，混合均勻，放入離心機(jī)，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，取上清液，制備出不同濃度的待測(cè)樣品。取β-內(nèi)酰胺酶測(cè)定試紙，浸入待測(cè)樣品溶液10 min，取出后與標(biāo)準(zhǔn)比色卡對(duì)照，即得到β-內(nèi)酰胺酶的最低檢測(cè)限[7]。

（2）試紙檢測(cè)的準(zhǔn)確度。配置β-內(nèi)酰胺酶濃度梯度溶液，0，4，6，12，25，50，100，150，200 U/mL，在試紙顯色層上做顯色反應(yīng)，觀察顯色結(jié)果，與分光光度法進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算相對(duì)誤差表示準(zhǔn)確度[8]。

3 結(jié)果與討論

3.1 亞銅試劑的濃度對(duì)試紙顯色的影響

樣品添加量0.2 mL，底物濃度50 000 U/mL，反應(yīng)時(shí)間10 min，隨著亞銅試劑的濃度逐步升高，試紙顯色紫紅色逐漸變淺，其中2.5%2,2'-聯(lián)喹啉乙醇溶液和0.2 mol/L CuSO4的硫酸銅溶混合組成的亞銅試劑，試紙顯色為深紫紅色。

亞銅試劑的濃度對(duì)試紙顯色的影響見(jiàn)圖1。

圖1 亞銅試劑的濃度對(duì)試紙顯色的影響

3.2 標(biāo)準(zhǔn)比色卡的制備

取2.3.2中9個(gè)發(fā)生顏色反應(yīng)的試紙，使用分光測(cè)色儀測(cè)定試紙L*值，a*值和b*值等顏色反應(yīng)數(shù)值，利用計(jì)算機(jī)中顏色模塊軟件對(duì)顏色反應(yīng)的數(shù)值進(jìn)行模擬后制作標(biāo)準(zhǔn)比色塊。制作β-內(nèi)酰胺酶的標(biāo)準(zhǔn)比色卡，可以看出顏色梯度的變化，隨著β-內(nèi)酰胺酶濃度增加紅色漸漸加深。

β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)比色卡見(jiàn)圖2，色卡的L*值、a*值、b*值見(jiàn)表1。

3.3 最低檢出限

將β-內(nèi)酰胺酶測(cè)定試紙浸在待測(cè)牛奶樣品中5 min后取出與標(biāo)準(zhǔn)比色卡比照。由表2可知，當(dāng)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的濃度達(dá)到6 U/mL時(shí)，5 min內(nèi)試紙就出現(xiàn)很淺的淡粉色，而低于6 U/mL時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)顯色反應(yīng)，即得出試紙對(duì)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的最低檢出限為6 U/mL。

圖2 β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)比色卡

表2 試紙檢出限的確定

表3 β-內(nèi)酰胺酶試紙準(zhǔn)確度

試紙檢出限的確定見(jiàn)表2。 9個(gè)色塊，分別對(duì)應(yīng)β-內(nèi)酰胺酶的9個(gè)濃度：0，6，12，25，50，100，150，200，250 U/mL，顏色從淺粉色漸變至深紫色，色階梯度明顯；檢測(cè)試紙檢測(cè)最低檢出限為6 U/mL，相對(duì)誤差范圍為7.51%～15.38%。

3.4 試紙檢測(cè)方法的精確度

β-內(nèi)酰胺酶試紙準(zhǔn)確度見(jiàn)表3。

由表3可知試紙檢測(cè)與的準(zhǔn)確度范圍為7.51%～15.38%。

4 結(jié)論

檢測(cè)試紙的制備條件為醋酸纖維素膜（CA）為載體制備顯色層，在亞銅試劑（0.2 mol/L CuSO4溶液和2.5%2,2'-聯(lián)喹啉乙醇溶液）中浸泡10 min進(jìn)行顯色反應(yīng)，于45℃下真空干燥30 min，制備出β-內(nèi)酰胺酶半定量快速檢測(cè)試紙；標(biāo)準(zhǔn)比色卡含有

[1]崔生輝，李景云，馬越，等.“生鮮牛乳抗生素分解劑”的鑒定與檢測(cè) [J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2007，19（2）：113-116.

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[3]趙靜玫，都絳瑛.青霉素裂解液的高效液相色譜分析[J].色譜，2001，19（1）：88-89.

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[5]黃曉蓉，于竸，鄭晶，等.牛奶中β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素殘留的快速檢測(cè)方法 [J].中國(guó)乳品工業(yè)，2004，32（2）：44-47.

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[7]孫秀蘭，楊婷婷，張銀志.糧食中百草枯殘留的金標(biāo)免疫層析檢測(cè)方法研究 [J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2010，29（5）：507-510.◇

Study on the Semi-quantitative Rapid Test Strip of β-lactamase in Milk

SHI Chunyu
（Zhengzhou No.11 High School，Zhengzhou，He'nan 450002，China）

Penicilloic acid，the decomposer of penicillin G potassium by β-lactamase has the reducibility.The 2,2'-biquinolyl can coupling with Cu+to display purple，which the color depth and the amount of β-lactamase are in linearly within a certain range.The cellulose acetate membrane is used as colourably layer and immersed cuprous reagent of 2.5%2,2'-biquinolyl，0.2 mol/L of CuSO4for 10 min color reaction.The semi-quantitative rapid test for β-lactamase is prepared after vacuum drying for 30 min.The β-lactamase standard solution for gradient concentration 0～250 U/mL（0，6，12，25，50，100，150，200，250 U/mL） for colour reaction is prepared，using spectro-colorimeter to determine the color reaction L*，a*，b*value data，and application the color module software on its for simulation to prepare the standard color card.The detection limit of kit is 6 U/mL and relative error is 7.51%～15.38%.The β-lactamase kit method is rapid，simple，economical and practical，easy to spread and site.

β-lactamase；rapid test strip；milk

TS252.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.12.003

1671-9646（2016）12a-0011-03

2016-11-05

施春煜（1998— ），男，在讀學(xué)生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)及生物技術(shù)。