高秀霞，侯海燕，孔祥玲，劉傳麗

(武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津　300162)

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苯并芘對孕早期小鼠胎盤絨毛組織的影響及槲皮素的防護(hù)作用機制

高秀霞，侯海燕，孔祥玲，劉傳麗

(武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津300162)

摘要：目的研究苯并芘(BaP)損傷小鼠胎盤絨毛組織細(xì)胞作用機制及探討槲皮素(ME)的防護(hù)機制。方法選取性成熟ICR小鼠150只(100只雌鼠、50只雄鼠)，隨機分為5組，每組30只(20只雌鼠、10只雄鼠)，雌雄分開飼養(yǎng)，A組予BaP(2 mg·kg-1·d-1)；B、C、D組予BaP(2 mg·kg-1·d-1)的同時分別灌胃ME(0.5、1、2 g·kg-1·d-1)；E組灌胃相同體積的0.9%氯化鈉注射液與橄欖油。連續(xù)灌胃15 d后雌雄鼠同籠，第2天發(fā)現(xiàn)精液栓者為受孕，挑出受孕小鼠繼續(xù)灌胃7 d后處死，取胎盤組織測定Bax與Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)、細(xì)胞色素P450(CYP450)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)活性。結(jié)果總共45只小鼠受孕，各組間受孕率無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=0.808，P=0.937)，B、C、D組Bax基因mRNA水平表達(dá)高于E組(P<0.05)，低于A組(P<0.05)，且隨著ME的劑量增加表達(dá)量逐漸降低(P<0.05)；B、C、D組Bcl-2基因mRNA水平表達(dá)低于E組(P<0.05)，高于A組(P<0.05)，且隨著ME的劑量增加表達(dá)量逐漸升高(P<0.05)；B、C、D組中細(xì)胞色素P450酶活性明顯高于E組(P<0.05)，低于A組(P<0.05)，且隨著ME的劑量增加活性逐漸降低(P<0.05)；B、C、D組中GSH-PX、SOD活性明顯低于E組(P<0.05)，高于A組(P<0.05)，且隨著劑量的增加活性逐漸升高(P<0.05)。結(jié)論ME能通過提高抗氧化酶活力與抑制凋亡基因表達(dá)來保護(hù)苯并芘所致的胎盤絨毛組織細(xì)胞損傷，提高生育能力。

關(guān)鍵詞：苯并芘；槲皮素；胎盤絨毛組織；凋亡

苯并芘(Benzo[a]pyrene,BaP)是多環(huán)芳烴類化合物(polycyclic aromatic hydrocarbon compounds，PAHs)中的代表，形成于能源物質(zhì)與肉類食物的不完全燃燒，近年來隨著城市汽車數(shù)量逐年提高、燒烤類食物的大量使用，BaP能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡，其致凋亡機制是通過肝臟代謝過程中經(jīng)細(xì)胞色素P450酶作用而產(chǎn)生大量氧化性極強的中間產(chǎn)物二氫二醇環(huán)氧苯并芘(BaP-7,8-Dihydrodiol-9,10-Epoxide，BPDE)與大量的氧自由基[1]。胎盤是母體與胚胎進(jìn)行物質(zhì)交換的場所，功能降低后影響胚胎發(fā)育，Detmar等[2]通過大鼠暴露于低濃度的BaP研究顯示，BaP誘發(fā)凋亡是通過增加胎盤與胎膜內(nèi)皮細(xì)胞上的凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來實現(xiàn)的。其致凋亡具體路徑是其與DNA形成加合物后作用于芳香烴受體(Ary1 hydrocarbon receptor，AhR)，進(jìn)一步活化Bax基因發(fā)達(dá)而發(fā)揮作用[3]。

槲皮素(meletin，ME)屬于黃酮類物質(zhì)中的一種，微溶于水，易溶于熱乙醇、乙醚等有機溶劑，是黃酮類化合物中的代表物質(zhì)，抗氧化能力強，長期服用降低惡性腫瘤的發(fā)生率[4]。本實驗組已經(jīng)證實維生素E能抑制BaP所誘導(dǎo)的胎盤絨毛組織凋亡[5]，而ME是否能抑制BaP所誘導(dǎo)的胎盤絨毛組織凋亡及其保護(hù)作用機制，需要我們?nèi)ド钊胙芯俊?/p>

1實驗方法

1.1實驗動物的選擇、分組及處理將150只ICR性成熟小鼠[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，周齡6～8周，體質(zhì)量30～34 g，合格證號SCXK-(京)2012-0002]用隨機數(shù)字法分為A、B、C、D、E 5組，每組均為30只(雌鼠20只、雄鼠10只)，雌、雄鼠分開飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度控制在20～26℃，12 h光照，12 h黑暗，顆粒飼料喂養(yǎng)(雌鼠給予高蛋白飼料)，自由飲水飲食。A組：BaP(2 mg·kg-1·d-1)；B組：ME(0.5 g·kg-1·d-1)+BaP(2 mg·kg-1·d-1)；C組：ME(1.0 g·kg-1·d-1)+BaP(2 mg·kg-1·d-1)；D組：ME(2.0 g·kg-1·d-1)+BaP(2 mg·kg-1·d-1)；E組：相同體積的0.9%氯化鈉注射液與橄欖油(初榨橄欖油為西班牙品利公司產(chǎn)品)。BaP(美國Sigma公司產(chǎn)品)用橄欖油配成混懸液、ME(美國Sigma公司產(chǎn)品)用0.9%的生理鹽水配成混懸液，兩種制劑均配好后避光4℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。將100只雌鼠連續(xù)灌胃15 d后與雄鼠同籠，第2天發(fā)現(xiàn)有精液栓為懷孕第1天(見圖1)[6]，將已受孕的小鼠按上述方法再連續(xù)灌胃7 d(ICR小鼠孕周期為20 d，早孕為7 d[6])，最后一次灌胃后處死(頸椎脫臼法)小鼠立即放于冰臺(-4～0 ℃)上，無菌條件下取出胎盤組織，檢測相關(guān)指標(biāo)。

圖1　小鼠精液栓圖片

1.4GSH-PX、SOD酶活性測定將取出的胎盤組織用勻漿機以(10 000～15 000 r·min-1)在4 ℃下勻漿(每次勻漿時間10 s、間隙30 s、連續(xù)3～4次)，按試劑盒說明稱取組織后先測定蛋白含量(雙縮脲法)再按試劑盒說明測定GSH-PX、SOD活性(試劑盒為南京建成生物技術(shù)公司產(chǎn)品)，測定時采用生物分光光度計(BioPhotometer型為德國Eppendorf公司產(chǎn)品)測定并按照公式計算出活性值，均在1周內(nèi)測定。

1.5HE染色觀察胎盤絨毛組織細(xì)胞將取出的新鮮胎盤組織用0.9%的NaCl溶液沖洗干凈后浸泡于10%的多聚甲醛中(美國Sigma公司)，石蠟包埋后制成石蠟切片(德國Leica公司)，將石蠟塊按5 μm的厚度切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，每隔10張切片染色一張。將切片在40℃水中展平，平鋪于載玻片上。將載玻片放入60℃烤箱中烤片，按照試劑盒(天津灝洋生物制品科技公司)說明進(jìn)行進(jìn)行染色，封片后在顯微鏡下進(jìn)行觀察，進(jìn)行400×的顯微照相。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行資料分析。計數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗；計量資料則采用單因素方差分析+兩兩多重比較。以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1各組受孕例數(shù)統(tǒng)計A組成功受孕8只(40%)、B組成功受孕8只(40%)，C組成功受孕9只(45%)、D組成功受孕10只(50%)、E組成功受孕10只(50%)，總受孕45只(45%)，A、B2組受孕率低于C、D、E 3組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=0.808，P=0.937)，結(jié)果見表1。

2.2ICR小鼠胎盤絨毛組織凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2基因mRNA水平表達(dá)BaP(2 mg·kg-1·d-1)能導(dǎo)致小鼠胎盤絨毛組織的Bax基因mRNA水平升高，使Bcl-2基因mRNA水平降低，A組小鼠胎盤絨毛組織Bax基因mRNA水平表達(dá)明顯高于E組(P<0.05)，B、C、D組Bax基因mRNA水平表達(dá)高于E組(P<0.05)，低于A組(P<0.05)，且隨著ME的劑量增加表達(dá)量逐漸降低(P<0.05)；A組胎盤絨毛組織的Bcl-2基因mRNA水平表達(dá)量明顯低于E組(P<0.05)，B、C、D組Bcl-2基因mRNA水平表達(dá)低于E組(P<0.05)，高于A組(P<0.05)，且隨著ME的劑量增加表達(dá)量逐漸升高(P<0.05)；A組小鼠胎盤絨毛組織Bax/Bcl-2比值明顯高于E組(P<0.05)，B、C、D組Bax/Bcl-2比值高于E組(P<0.05)，低于A組(P<0.05)，且隨著ME的劑量增加比值逐漸降低(P<0.05)，兩基因mRNA水平表達(dá)量間呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.825，P=0.021<0.05)，結(jié)果見圖2、表2。

表1　ICR小鼠受孕情況比較

圖2　Bax、Bcl-2基因相對GAPDH基因的

分組數(shù)量/只IODBaxBcl-2Bax/Bcl-2A81.12±0.170.39±0.062.87±0.22B80.98±0.12a0.51±0.07a1.92±0.06aC90.88±0.09ab0.58±0.07ab1.52±0.12abD100.60±0.08abc0.64±0.08abc0.94±0.06abcE100.42±0.07abcd0.75±0.09abcd0.56±0.06abcdF10.5489.53917.564P0.0040.0010.002

注: 與A組比較，aP<0.05；與B組比較,bP<0.05；與C組比較,cP<0.05；與D組比較,dP<0.05。

2.3HE染色觀察壞死細(xì)胞與凋亡細(xì)胞情況HE染色400倍光鏡下法觀察出現(xiàn)核固縮、核碎裂、核溶解、細(xì)胞膜皺縮、破裂的細(xì)胞，從圖3中可以看出，A組中發(fā)生細(xì)胞核固縮與溶解、細(xì)胞形態(tài)異常的細(xì)胞數(shù)量明顯高于其他四組，其中E組發(fā)生上述改變的細(xì)胞數(shù)量較少，明顯少于其他四組。

圖3　胎盤絨毛組織細(xì)胞凋亡情況(HE×400)

2.4P450、GSH-PX、SOD酶活性B、C、D組中細(xì)胞色素P450酶活性明顯高于E組(P<0.05)，低于A組(P<0.05)，且隨著ME的劑量增加活性逐漸降低(P<0.05)；B、C、D組中GSH-PX、SOD活性明顯低于E組(P<0.05)，高于A組(P<0.05)，且隨著劑量的增加活性逐漸升高(P<0.05)，結(jié)果見表3。

表3　ICR小鼠胎盤絨毛組織CYP450、

注: 與A組比較，aP<0.05；與B組比較,bP<0.05；與C組比較,cP<0.05；與D組比較,dP<0.05。

3討論

ME主要來源于姜科植物山奈的根莖，有些水果、蔬菜中也含有山奈酚，目前很多實驗室已從茶葉、蜂膠、柚子等植物中提取到它的純品，銀杏黃酮的有效成分為槲皮和素山奈酚，中老年人常服用一些以銀杏提取物為活性成分藥物，有一定的抑癌功效[8]。因黃酮類物質(zhì)除了有較強的抗氧化能力外還能降低BaP所有誘導(dǎo)的CYP450活性增強是其他抗氧化劑所沒有的，這樣就可以降低代謝產(chǎn)物BPDE的產(chǎn)生，降低氧化損傷[9]，因此選擇ME對抗BaP氧化損傷。

Bax基因本身發(fā)揮凋亡作用必須與Bcl-2基因配合才能完成，當(dāng)Bax形成同源二聚體時發(fā)揮促進(jìn)凋亡作用，當(dāng)Bcl-2基因表達(dá)量升高，而與Bcl-2基因結(jié)合形成異源二聚體，發(fā)揮抑制凋亡作用[10]。本實驗通過RT-PCR法對胎盤絨毛組織Bax與Bcl-2兩基因的mRNA水平進(jìn)行半定量測定。結(jié)果進(jìn)一步證實BaP能通過升高胎盤絨毛組織Bax基因mRNA表達(dá)量與降低Bcl-2基因mRNA表達(dá)量而誘導(dǎo)胎盤絨毛組織細(xì)胞發(fā)生凋亡(從圖 3中可以看出，A組中發(fā)生細(xì)胞核固縮與溶解，細(xì)胞形態(tài)異常的細(xì)胞明顯高于其他四組，其中E組發(fā)生上述改變的細(xì)胞數(shù)量較少，明顯少于其他四組)，BaP可使Bax/Bcl-2 mRNA水平比值升高，而ME (0.5、1、2 g·kg-1·d-1)可通過降低Bax基因蛋白與mRNA表達(dá)量并升高Bcl-2基因蛋白與mRNA表達(dá)量而抑制細(xì)胞凋亡，且ME2 g·kg-1·d-1抑制效果最強，且兩基因mRNA水平表達(dá)量間呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.825，P=0.021<0.05)。

其中CYP450酶是一個大家族，CYP450家族成員目前已知有14個，人體內(nèi)有30個同功酶，主要分布于肝臟，參與藥物與毒物的代謝，一般發(fā)揮解毒效應(yīng)，但在有些條件下代謝產(chǎn)物毒性較強，代謝BaP過程就主要發(fā)揮增毒效應(yīng)，BaP在肝臟中的CYP450酶作用過程中產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)造成過氧化損傷，該酶活性強弱在染毒早期反應(yīng)其染毒程度強弱，染毒程度越高活性越強，而晚期該酶耗盡，活力降低[11]。結(jié)果顯示：B、C、D組中細(xì)胞色素P450酶活性明顯高于E組(P<0.05)，低于A組(P<0.05)，且隨著ME的劑量增加活性逐漸降低(P<0.05)，朱淑萍等[12]通過妊娠早期大鼠BaP灌胃致畸胎動物模型證實大鼠孕早期經(jīng)BaP毒染能使胎盤絨毛組織中CYP450活性升高，而晚期活性降低，本實驗結(jié)果與朱淑萍等[12]研究結(jié)果相同。而針對抗氧化酶系統(tǒng)(GSH-PX與SOD)結(jié)果顯示：B、C、D組中GSH-PX、SOD活性明顯低于E組(P<0.05)，高于A組(P<0.05)，且隨著劑量的增加活性逐漸升高(P<0.05)，此外也有研究顯示：GSH-PX與CYP450兩酶的活性反應(yīng)了機體抗氧化與氧化之間是否平衡。PAHs是經(jīng)過Ⅰ相酶(CYP1A1)與細(xì)胞大分子反應(yīng)而增強活性或通過Ⅱ相酶(GSTM1)代謝作用而形成解毒效應(yīng)，經(jīng)Ⅰ相酶代謝后對機體有氧化損傷作用，而經(jīng)Ⅱ相酶代謝后對機體有益處，兩基因表達(dá)量大小直接影響CYP450、GSH-PX酶活性[9,13]。本實驗結(jié)果顯示：經(jīng)BaP染毒后小鼠胎盤組織的GSH-PX活力降低，CYP450活性升高，而給予槲皮素干預(yù)后GSH-PX活力升高，CYP450活性降低，與以往結(jié)果相同[9,13]。本實驗僅僅針對妊娠期間胚胎對外界環(huán)境污染物最為敏感的早期進(jìn)行了研究，針對中期及其晚期還未研究，本實驗組將在今后的實驗去進(jìn)一步論證。

關(guān)于苯并芘對ICR小鼠受孕率的結(jié)果顯示：總受孕率45%，且A、B兩組受孕率低于C、D、E三組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=0.808，P=0.937)，可能與本實驗所選用的小鼠數(shù)量較少有關(guān)。

本實驗證實了ME能升高胎盤絨毛組織抗氧化酶活性并且降低細(xì)胞色素P450酶活性，很好的糾正氧化與抗氧化失衡，并能很好的降低Bax基因mRNA水平的表達(dá)，升高Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)來抑制凋亡，而ME是否能像維生素E一樣應(yīng)用于妊娠前期與妊娠期婦女的日常保健而預(yù)防不良妊娠結(jié)局的發(fā)生，值得我們?nèi)ミM(jìn)一步臨床研究，本實驗結(jié)果為今后的妊娠期保健提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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Effect of BaP on placental villus injury in early pregnant mice and

the protective mechanism of meletin against BaP

GAO Xiu-xia，HOU Hai-yan, KONG Xiang-ling, et al

(DepartmentofObstetricsandGynecology,TheAffiliatedHospitalofArmed

PoliceLogisticsInstitute,Tianjin300162,China)

Abstract：ObjectiveTo study the action of injury that BaP acts on placental villus of early pregnant mice and the mechanism of meletin opposing BaP. MethodsTotally 150 viripotent ICR mice(100 female mice, 50 male mice) were randomized into five groups, every group including 30 mice(20 female mice,10 male mice). Female and male mice were raised respectively, mice in group A were lavaged with BaP (2 mg·kg-1·d-1) , mice in group B, C, D lavaged with BaP(2 mg·kg-1·d-1) and ME(0.5,1.0,2.0 g·kg-1·d-1respectively), mice in group E lavaged with normal saline(0.9%) plusolive oil. After 15days, male mice were mated with female mice. Pregnancy was determined the next day based on the presence of a vaginal plug, then lavaging continued for another 7 days. The mice were euthanized for the detection of Bax and Bcl-2 mRNA levels and the activity of cytochrome 450,GSH-PX and SOD in placental villus. ResultsThe total pregnancy rate was 45%, and the pregnancy rate had no statistical difference(χ2=0.808,P=0.937).Bax mRNA levels were higher in group B, C, D than in group E (P<0.05), while lower than in group A (P<0.05). With the increase of ME dose, the expression of Bax mRNA decreased (P<0.05);Bcl-2 mRNA levels were lower in group B, C, D than in group E (P<0.05), while higher than in group A (P<0.05). With the increase of ME dose, the expression of Bcl-2 mRNA increased (P<0.05). The activity of cytochrome P450 in group B,C,D was greater than in group E , while lower than in group A(P<0.05). With the increase of ME dose, the activity of cytochrome P450 decreased(P<0.05). The activity of GSH-PX,SOD in group B,C,D was lower than in group E , while greater than in group A(P<0.05). With the increase of ME dose, the activity ofGSH-PX,SOD increased(P<0.05). ConclusionMeletin can protect the mice against placental villus injury by raising the activity of antioxidase and suppressing the cell apoptosis in the placental villus .

Key words：BaP; meletin; placental villus; apoptosis

收稿日期：(2015-07-28，修回日期：2015-09-18)

基金項目:天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃(No 15JCQNJC 2300)；天津市自然科學(xué)基金資助項目(No 07J CZDJC07400)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.005