葛　熙,趙　枰,周　峰,胡忠圣

(南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科,江蘇南通 226001)

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·臨床研究·

慢性粒細胞白血病患者外周血Bmi1 mRNA的表達水平

葛熙,趙枰,周峰,胡忠圣

(南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科,江蘇南通 226001)

摘要:目的采用實時熒光定量PCR(Rt-PCR)檢測Bmi1基因表達的方法，了解慢性粒細胞白血病(CML)患者外周血Bmi1基因的表達水平。方法采用Rt-PCR方法檢測CML患者41例和10例健康人外周血中Bmi1基因的表達水平。結(jié)果Rt-PCR的結(jié)果顯示，基因Bmi1在健康人、CML患者慢性期、加速期及急變期中的表達相對值分別為0.544±0.233、1.624±0.632、3.021±0.923及3.561±1.005。CML患者中Bmi1的表達水平明顯高于健康人(P<0.05)，加速期及急變期中Bmi1的表達水平明顯高于慢性期，急變期Bmi1的表達水平明顯高于加速期，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論Bmi1基因在CML外周血中有高水平的表達，是監(jiān)測CML患者病情進展及判斷預(yù)后有價值的分子標記物。

關(guān)鍵詞:白血病;Bmi1;實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

慢性粒細胞白血病(CML)是血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一，起源于造血干細胞。臨床上一般分為三期：慢性期、加速期和急變期。CML是臨床治療過程中引起死亡的主要原因。關(guān)于CML 急變的機制仍不明確。Bil1基因是干細胞自我更新的關(guān)鍵調(diào)控因子，在血液腫瘤發(fā)病機制和治療等方面具有較高的潛在價值，Bmi1基因表達增高的病例更易轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙园籽1]。如何準確測定外周血BMI1基因的表達水平以指導(dǎo)臨床治療，是許多臨床工作者關(guān)注的問題，因此，我們采用實時熒光定量PCR(Rt-PCR)技術(shù)檢測了CML患者外周血Bmi1基因的表達水平，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料2010年1月至2014年12月在南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診的門診和住院部CML患者41例納入研究組，其中男29例，女12例，年齡42～79歲。所有患者均經(jīng)臨床、血象、骨髓象及組織化學(xué)染色檢查，符合1981年FAB協(xié)作組提出的分類診斷標準。其中急性變9例，加速期6例，慢性期26例。同期本院體檢健康志愿者10例納入對照組，其中男7例，女3例，年齡48～70歲。

1.2方法

1.2.1RNA的提取及cDNA合成采集2 mL靜脈血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，加于等量的人淋巴細胞分離液上，以2 000 r/min離心15 min，分離單個核細胞，用吸管吸取，提取外周血總RNA(提取總RNA 試劑盒為美國Invitrogen公司提供)，測A260、A280吸光度值，計算出RNA水平，使用Promega逆轉(zhuǎn)錄劑盒，按說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2Bmi1基因表達的檢測Rt-PCR 1 μL 稀釋的模板，2 μL引物對(5 μM)，7 μL 無菌去離子水，反應(yīng)混合溶液共10 μL。每種引物，每種模板，都做3個平行管反應(yīng)。引物設(shè)計 Bmi1 引物對為5′-ATT CTA CCA GTC CCG AGG TTT G-3′，5′-GGT TCA ACT GCT CAT CAT AGC G-3′；內(nèi)參基因GAPDH引物對為，5′-CAT CCA TGA CAA CTT TGG TAT C-3′，5′-CCA TCA CGC CAC AGT TTC-3′。Rt-PCR 反應(yīng)程序：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。循環(huán)40次。取3個平行孔Ct比值的平均數(shù)，計算同一個樣品Bmi1的Ct值與GAPDH的Ct值比值，作圖時將正常對照的Ct比值平均數(shù)設(shè)為1.0，計算出所有樣品的相對值后制圖。儀器為Applied Biosystems，ABI7500 型Rt-PCR儀。

2結(jié)果

41例CML患者Bmi1基因的表達水平顯示，Bmi1基因表達水平在急變期時高于加速期，慢性期時表達水平最低，3組間的表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　　41例CML患者Bmi1基因的表達水平

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與研究組慢性期比較；△：P<0.05，與研究組加速期比較。

3討論

1991年荷蘭癌癥中心的學(xué)者們在對小鼠淋巴瘤進行研究時，發(fā)現(xiàn)了癌基因——Bmi1基因，開始被認為是癌基因C-myc的協(xié)同基因，把它歸屬于多梳基因PcG家族；進一步研究發(fā)現(xiàn)人類的Bmi1基因定位于10號染色體的短臂1區(qū)3帶(10p13)，該區(qū)域與惡性淋巴瘤和兒童白血病的染色體移位有關(guān)，研究還發(fā)現(xiàn)Bmi1基因與干細胞成長調(diào)控，細胞分化及惡性病變密切相關(guān)[2-7]。此外，Bmi1基因在細胞周期的調(diào)節(jié)、細胞的永生化和衰老方面也發(fā)揮著重要作用[8-9]。Bmi1基因還可通過作用于PcG 家族中的某些靶位，使靶基因轉(zhuǎn)錄沉默。動物實驗表明，首先Bmi1表達陽性的小鼠其外周血中白血病細胞的數(shù)量明顯高于Bmi1表達陰性的小鼠[10]；其次，將Bmi1缺失小鼠的骨髓細胞移植給受者小鼠，這些小鼠不發(fā)生急性髓系白血病，然而將Bmi1轉(zhuǎn)染給原本Bmi1缺失的小鼠骨髓細胞中，然后再移植給受者小鼠，受者小鼠則可發(fā)生急性髓系白血病，上述研究表明Bmi1對白血病干細胞的增殖和其致白血病的能力具有決定性作用。研究還發(fā)現(xiàn)[11-12]，急性白血病患者的骨髓中Bmi1的表達水平明顯高于健康人，尤其是在急性髓細胞白血病微分化型的患者骨髓中，Bmi1的表達水平更高。通過實時R-PCR的方法檢測，發(fā)現(xiàn)CML患者外周血中Bmi1基因的表達具有一定的規(guī)律性：急性變患者表達相對值在5的數(shù)量級，加速期患者其表達相對值在2的數(shù)量級，經(jīng)化療后轉(zhuǎn)入慢性期的患者其表達的相對值僅小于1的數(shù)量級，3者之間依次相差1～2個數(shù)量級，表明Bmi1基因在CML患者外周血中的表達相對值是隨其白血病細胞數(shù)的減少而降低的。在CMI治療過程的不同時期，Bmi1基因的表達相對值存在明顯差異，因而外周血中Bmi1基因檢測可作為監(jiān)測CML病情進展及判斷預(yù)后的有價值的分子標記物。

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(收稿日期：2015-11-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.041

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)03-0382-02