王　霞，許曉絢，吳桂丹，曾勁峰，杜　鵬，莊乃保

(深圳市血液中心，廣東深圳 518035)

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·論著·

深圳地區(qū)2003～2014年獻(xiàn)血者HIV血液篩查結(jié)果及其窗口期確認(rèn)*

王霞，許曉絢，吳桂丹，曾勁峰，杜鵬，莊乃保

(深圳市血液中心，廣東深圳 518035)

摘要:目的分析深圳地區(qū)2003～2014年無償獻(xiàn)血者HIV感染率變化趨勢(shì)，以及研究HIV感染窗口期確認(rèn)過程。方法2003～2014年共584 111例獻(xiàn)血者經(jīng)進(jìn)口與國(guó)產(chǎn)2種ELISA試劑及血液病毒核酸(NAT)檢測(cè)方法(2006年開始使用)篩查HIV項(xiàng)目，抗-HIV陽(yáng)性樣品送疾病預(yù)防控制中心(CDC)確證，統(tǒng)計(jì)分析12年來獻(xiàn)血者HIV感染流行趨勢(shì)。另外，使用高靈敏度的熒光定量-PCR(Rt-PCR)方法對(duì)抗-HIV陰性/NAT陽(yáng)性樣品確認(rèn)HIV RNA的存在并隨訪跟蹤復(fù)查，以判定是否為HIV感染窗口期。結(jié)果深圳地區(qū)2003～2014年獻(xiàn)血人數(shù)逐年增長(zhǎng)，抗-HIV篩查陽(yáng)性率呈平穩(wěn)下降趨勢(shì)，但經(jīng)CDC確認(rèn)為HIV感染的獻(xiàn)血者流行率則急劇升高，2014年的獻(xiàn)血者HIV感染率為2003年的26.61倍；感染HIV的獻(xiàn)血者中由同性性行為傳播的比例逐年升高。通過跟蹤復(fù)查、Rt-PCR檢測(cè)，4例抗-HIV陰性/NAT陽(yáng)性樣品為HIV感染窗口期，深圳地區(qū)無償獻(xiàn)血者的HIV感染窗口期檢出率為1/117 995(4/471 978)。無償獻(xiàn)血者HIV感染率在男性組、18～<39歲組、已婚組、初次獻(xiàn)血組分別明顯高于女性組、39～<60歲組、未婚組、重復(fù)獻(xiàn)血組(P<0.05)，而非該地與該地戶籍組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論深圳地區(qū)的血液篩查機(jī)制與手段能較好地杜絕HIV感染窗口期帶來的輸血風(fēng)險(xiǎn)，有效保障輸血安全。

關(guān)鍵詞:無償獻(xiàn)血者；人類免疫缺陷病毒；病毒核酸檢測(cè)；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)；窗口期

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及其在血液篩查檢測(cè)方面的應(yīng)用，血液病毒核酸檢測(cè)(NAT)技術(shù)已能大大降低經(jīng)輸血傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。相關(guān)研究顯示，乙型肝炎、丙型肝炎、HIV病毒的血清學(xué)標(biāo)志物檢出時(shí)間上限分別為第30、65、19天，使用NAT技術(shù)能縮短至第10、2、3天[3-4]，可見NAT技術(shù)在乙型肝炎、丙型肝炎、HIV病毒感染的感染窗口期對(duì)血液篩查具有不可替代的作用，能最大限度地保障輸血安全。深圳市血液中心于2006年正式把NAT檢測(cè)作為血液篩查常規(guī)手段，作為全國(guó)第一批引進(jìn)NAT檢測(cè)的城市，經(jīng)過8年的應(yīng)用，已經(jīng)獲得詳細(xì)的獻(xiàn)血者血篩數(shù)據(jù)，本研究主要分析2003～2014年無償獻(xiàn)血者血液HIV的ELISA及NAT檢測(cè)結(jié)果，并對(duì)抗-HIV陰性，NAT陽(yáng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行感染窗口期確認(rèn)，以提供真實(shí)的獻(xiàn)血者HIV感染流行率及HIV輸血風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為深圳地區(qū)的HIV傳染防控提供數(shù)據(jù)參考。

1資料與方法

1.1一般資料深圳市2003年1月至2014年12月無償獻(xiàn)血者584 111例，年齡18～55歲。獻(xiàn)血者在獻(xiàn)血前經(jīng)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)快速試紙條、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)干化學(xué)檢測(cè)初篩，合格者進(jìn)行獻(xiàn)血并留樣送至檢驗(yàn)科，使用ELISA及NAT方法篩查血站常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。

1.2儀器與試劑ELISA檢測(cè)儀器：Microlab STAR全自動(dòng)加樣儀、Xantus-200全自動(dòng)加樣儀、Microlab FAME全自動(dòng)ELISA分析系統(tǒng)、BEHRING(Ⅲ)ELISA處理系統(tǒng)、美國(guó)Biorad洗板機(jī)和Zenyth340rt恒溫酶標(biāo)儀等。NAT檢測(cè)儀器：瑞士HIMILTON自動(dòng)核酸提取儀、美國(guó)ABI核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀、瑞士HIMILTON STAR2000全自動(dòng)匯集儀、美國(guó)TIGRIS全自動(dòng)血液NAT系統(tǒng)。HBsAg膠體金試紙由杭州艾博生物醫(yī)藥有限公司提供；ALT干化學(xué)初篩試紙條由美國(guó)羅氏公司提供；ALT速率法檢測(cè)試劑盒由上海科華公司及澳斯邦生物公司提供；2003～2014年檢測(cè)抗-HIV的ELISA試劑來自多個(gè)公司及廠家，包括北京萬泰公司、珠海麗珠公司、荷蘭梅里埃公司及美國(guó)Bio-Rad公司。2003～2012年的ELISA檢測(cè)一直都是國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口2種試劑檢測(cè)，到2013年初開始使用1次進(jìn)口ELISA加NAT試劑檢測(cè)。NAT試劑使用上海科華公司與美國(guó)諾華Procleix Ultrio assay NAT試劑。逆轉(zhuǎn)錄步驟使用TAKARA公司生產(chǎn)的PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，由大連寶生物工程公司提供，批號(hào)D6110A；實(shí)時(shí)熒光定量-PCR(Rt-PCR)使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒，由大連寶生物工程公司提供，批號(hào)DRR820A。Rt-PCR儀為美國(guó)安捷倫公司MX3005P型號(hào)。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1NAT檢測(cè)2006～2009年使用上海科華公司生產(chǎn)的NAT檢測(cè)產(chǎn)品，按照產(chǎn)品要求，為“8人匯集池+再拆分”的混檢模式；2010年至今使用美國(guó)諾華公司的Procleix TIGRISNAT系統(tǒng)，為“三聯(lián)病毒檢測(cè)+可疑陽(yáng)性鑒別”的單檢模式。所有試驗(yàn)的操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書和《中國(guó)輸血技術(shù)操作規(guī)程》相關(guān)要求進(jìn)行，以上試劑均批檢合格，不同批號(hào)試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3.2血樣HIV RNA提取使用羅氏診斷公司的High Pure Viral Nucleic Acid核酸提取試劑盒(德國(guó)曼海姆羅氏診斷公司，批號(hào)14765344)提取1 mL血漿RNA，按說明操作進(jìn)行,使用去RNA酶的實(shí)驗(yàn)耗材，防止HIV RNA提取過程中降解。

1.3.3Rt-PCRRt-PCR定量鑒定HIV RNA采用兩步法：RNA逆轉(zhuǎn)錄與cDNA定量PCR。上下游引物分別為：HIV-F 5′-TAA AGC TTG CCT TGA GTG CT-3′/HIV-R 5′-GTC TGA GGG ATC TCT AGT TAC CAG-3′,探針HIV-Probe 5′-(Hex) AGT AGT GTG TGC CCG TCT GTT GTG-(BHQ2)-3′。

1.3.4獻(xiàn)血者HIV陽(yáng)性確認(rèn)本中心實(shí)驗(yàn)室篩查抗-HIV陽(yáng)性和抗-HIV陽(yáng)性/NAT陽(yáng)性的標(biāo)本送至深圳市疾病預(yù)防控制中心(CDC)進(jìn)行確認(rèn)。

1.3.5HIV窗口期獻(xiàn)血者追蹤對(duì)于抗-HIV陰性/NAT陽(yáng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行規(guī)律地追蹤復(fù)查，復(fù)檢項(xiàng)目包括抗-HIV、常規(guī)NAT及手工Rt-PCR確認(rèn)。追蹤數(shù)據(jù)理論上需要有1個(gè)月后的數(shù)據(jù)，但實(shí)際情況因獻(xiàn)血者的流動(dòng)性大等因素，可能存在缺少部分?jǐn)?shù)據(jù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)中的Fisher確切概率法，采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.12003～2014年獻(xiàn)血者抗-HIV篩查結(jié)果深圳市血液中心從2003年開始獻(xiàn)血人數(shù)呈逐年上升，直到2014年獻(xiàn)血者數(shù)量比2003年增加將近1倍，達(dá)到68 423例。而2003～2014年抗-HIV的篩查陽(yáng)性率總體呈下降趨勢(shì)。2003～2006年抗-HIV陽(yáng)性率為緩慢增長(zhǎng)期，于2007年明顯下降后，至2009年檢測(cè)抗-HIV陽(yáng)性率達(dá)到最高，為0.36%(161/44 413)，此后至2014年逐年降至最低，為0.19%(132/68 423)。2003～2014年抗-HIV檢測(cè)總陽(yáng)性率為0.25%(1 450/584 111)。見圖1。

圖1　　2003～2014年獻(xiàn)血者抗-HIV初篩陽(yáng)性率

2.22003～2014年確認(rèn)感染HIV獻(xiàn)血者情況本中心篩查結(jié)果為抗-HIV陽(yáng)性的獻(xiàn)血者標(biāo)本通過本市CDC確認(rèn)，結(jié)果顯示與2003年相比，2014年的獻(xiàn)血者HIV感染率呈急劇上升趨勢(shì)(感染率由2003年的0.28/10 000上升到2014年的7.45/10 000，升高約26.61倍)；2003～2009年獻(xiàn)血者HIV感染率平穩(wěn)升高，于2010年急劇升高至4.77/10 000，在2010～2013年又處于平穩(wěn)感染狀態(tài)，最后至2014年出現(xiàn)新的HIV感染率飛躍，達(dá)到7.45/10 000。見圖2。

圖2　　2003～2014年獻(xiàn)血者確認(rèn)HIV感染率

2.32006～2014年獻(xiàn)血者HIV感染窗口期情況及確認(rèn)本中心從2006年正式把NAT檢測(cè)作為血液篩查常規(guī)技術(shù)，通過統(tǒng)計(jì)完整的ELISA及NAT數(shù)據(jù)，2006～2014年共篩查出4例抗-HIV陰性/NAT陽(yáng)性獻(xiàn)血者，均為男性，25～40歲，成功追蹤復(fù)查3例獻(xiàn)血者，有2例仍處于抗-HIV陰性/HIV RNA陽(yáng)性的窗口期感染狀態(tài)，1例已經(jīng)出現(xiàn)抗-HIV陽(yáng)轉(zhuǎn)/HIV RNA陽(yáng)性，成為HIV顯性感染狀態(tài)；另有1例(4號(hào))獻(xiàn)血者因不配合追蹤程序，通過本市CDC接受隨訪復(fù)查確認(rèn)為HIV感染。故4例初篩為抗-HIV陰性/NAT陽(yáng)性的獻(xiàn)血者通過追蹤及Rt-PCR確證HIV RNA存在，確認(rèn)為HIV感染窗口期。見表1。

2.4不同特征獻(xiàn)血者的HIV感染率比較無償獻(xiàn)血者HIV感染率在男性組、18～<39歲組、已婚組、初次獻(xiàn)血組分別明顯高于女性組、39～<60歲組、未婚組、重復(fù)獻(xiàn)血組(P<0.05)，而非本地與本地戶籍組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1　　4例抗-HIV陰性/NAT陽(yáng)性獻(xiàn)血者基本信息及追蹤結(jié)果

*：CDC接受隨訪，確認(rèn)感染。

表2　　2003～2014年總獻(xiàn)血者HIV感染率在

3討論

本文統(tǒng)計(jì)分析了深圳市血液中心2003～2014年無償獻(xiàn)血者HIV篩查及CDC確證HIV感染者的數(shù)據(jù)，旨在了解本市獻(xiàn)血者人群12年來的HIV感染流行趨勢(shì)，為無償獻(xiàn)血者招募提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本中心使用ELISA方法初篩獻(xiàn)血者抗-HIV的陽(yáng)性率，在2003～2014年總體呈平穩(wěn)下降趨勢(shì)，只在2007年及2009年出現(xiàn)較大的變化波動(dòng)，而在2012～2014年抗-HIV陽(yáng)性率更趨于平穩(wěn)。但實(shí)際上，經(jīng)過CDC對(duì)抗-HIV陽(yáng)性樣品的確證，2003～2014年無償獻(xiàn)血者HIV感染率從0.28/10 000上升到7.45/10 000，增長(zhǎng)26.61倍，與本中心實(shí)驗(yàn)室篩查抗-HIV陽(yáng)性率總體下降的方向相反，這可能與本中心近年來所用篩查抗-HIV的試劑靈敏度與特異度增高，而抗-HIV假陽(yáng)性率降低有關(guān)[5]。

圖2示深圳地區(qū)2012～2014年的獻(xiàn)血者確證HIV感染率為4.78/10 000～7.45/10 000，高于同期南京地區(qū)的1.10/10 000～2.10/10 000[6],2010～2013年的4.77/10 000～5.63/10 000高于同期廣州地區(qū)的2.00/10 000～3.50/10 000[7],2010～2012年的4.77/10 000～5.63/10 000高于同期北京地區(qū)的2.11/10 000～3.94/10 000[8]，而在2003～2009年深圳地區(qū)獻(xiàn)血人群HIV感染率為0.28/10 000～1.43/10 000，低于同期北京的0.54/10 000～1.74/10 000[8]，甚至低于其他地區(qū)[9]，可見深圳地區(qū)在2010年開始獻(xiàn)血者人群的HIV流行率明顯升高，是2009年的3.53倍(4.77∶1.35，圖2)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，2010年深圳地區(qū)CDC新確認(rèn)HIV感染者及男男性行為獻(xiàn)血者HIV相比上1年出現(xiàn)明顯升高[10-12]，而獻(xiàn)血者作為普通人群的組成部分，這可能為2010年開始獻(xiàn)血者人群HIV感染率突然增長(zhǎng)的原因之一。同樣圖2可見，2014年的獻(xiàn)血者HIV感染率又一次出現(xiàn)飛躍性升高，是2013年的1.56倍(7.45∶4.78，圖2)，查詢本中心對(duì)HIV感染獻(xiàn)血者的傳播途徑背景數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，2009年HIV感染獻(xiàn)血者有33.30%為同性傳播，到2014年這一比例上升至65.30%，顯示傳染HIV的途徑已偏向同性性行為，異性行為及吸毒注射傳播比例逐漸下降，應(yīng)引起有關(guān)部門的重視。無償獻(xiàn)血者是社會(huì)普通人群的組成部分，HIV感染獻(xiàn)血者群體的病毒傳播途徑多數(shù)為同性性行為，也提示普通人群的主要HIV感染途徑可能與之類似，故本數(shù)據(jù)可為CDC對(duì)HIV的預(yù)防策略提供借鑒。本中心通過酶免及核酸檢測(cè)技術(shù)篩查出4例抗-HIV陰性/NAT陽(yáng)性獻(xiàn)血者，回訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)其中2例存在同性性行為，充分說明帶著檢測(cè)HIV動(dòng)機(jī)的獻(xiàn)血者風(fēng)險(xiǎn)性極高。通過隨訪跟蹤、Rt-PCR技術(shù)確認(rèn)HIV RNA存在及CDC進(jìn)一步流調(diào)，可判定4例抗-HIV陰性/NAT陽(yáng)性獻(xiàn)血者是否為HIV感染窗口期，表1示樣品1、2、3均成功追蹤隨訪，使用血站常規(guī)NAT檢測(cè)及Rt-PCR兩種方法、不同擴(kuò)增引物檢測(cè)核酸，可確證HIV RNA的存在[13]，排除常規(guī)核酸檢測(cè)假陽(yáng)性結(jié)果。樣品1、3完成1次追蹤，結(jié)果仍為抗-HIV陰性/HIV RNA陽(yáng)性，血清學(xué)抗體未轉(zhuǎn)陽(yáng)，仍處于感染窗口期；樣品2于第2次追蹤出現(xiàn)抗-HIV陽(yáng)轉(zhuǎn)/HIV RNA陽(yáng)性，成為顯性HIV感染者；樣品4因獻(xiàn)血者不配合追蹤程序，CDC隨訪跟蹤，后來確認(rèn)為HIV感染者。故該4例獻(xiàn)血者均判定為HIV感染窗口期，深圳地區(qū)2006～2014年無償獻(xiàn)血者HIV感染窗口期檢出率為1/117 995(4/471 978)，高于韓國(guó)地區(qū)的1/1 080 244[14]及加拿大地區(qū)的1/8 000 000[15]。4例窗口期獻(xiàn)血者均為男性，學(xué)歷分布高低級(jí)階段，3/4例未婚，本研究通過成熟的追蹤回訪機(jī)制，科學(xué)完成HIV窗口期的確認(rèn)及獻(xiàn)血者資料信息獲得，充分體現(xiàn)本中心的NAT篩查手段與手工核酸擴(kuò)增技術(shù)的重要作用，為降低血液潛在風(fēng)險(xiǎn)起到不可或缺作用，保障了輸血安全。

表2分析了193例確認(rèn)感染HIV的獻(xiàn)血者在不同特征信息上的分布情況，可發(fā)現(xiàn)男性、18～<39歲、已婚及初次獻(xiàn)血者組的HIV感染率高于其對(duì)立組(P<0.05)，這為獻(xiàn)血前咨詢預(yù)防HIV高危獻(xiàn)血者提供基礎(chǔ)依據(jù)。本研究主要價(jià)值在于，一是獲得長(zhǎng)達(dá)12年來的獻(xiàn)血者HIV感染趨勢(shì)，2014年獻(xiàn)血者HIV感染率是2003年的26.61倍，有關(guān)部門應(yīng)高度重視HIV傳播問題，本數(shù)據(jù)對(duì)深圳地區(qū)人群HIV防控具有重要意義；二是建立手工擴(kuò)增HIV RNA的高靈敏度Rt-PCR方法，同時(shí)展示了4例抗-HIV陰性/NAT陽(yáng)性獻(xiàn)血者的窗口期確認(rèn)過程，為血液篩查中HCV、HBV窗口期的確證提供借鑒方法；另外，窗口期樣品檢出為后期輸血風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供支撐數(shù)據(jù)，充分肯定了NAT技術(shù)在血篩中保障輸血安全的貢獻(xiàn)。

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HIV blood screening results and its window period confirmation in blood donors in Shenzhen area during 2003-2014*

WangXia,XuXiaoxuan,WuGuidan,ZengJinfeng,DuPeng,ZhuangNaibao

(ShenzhenMunicipalBloodCenter,Shenzhen，Guangdong518035,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the change trend of HIV infection rate among volunteer donors in Shenzhen area during 2003-2014 and investigate the confirmation process of HIV window infection period.MethodsThe HIV screening items in 584 111 blood donors samples were performed by ELISA with both domestic and imported reagents and the viral nucleic acid (NAT) detection method (starting from 2006).The samples with anti-HIV positive were submitted to the center for disease control(CDC) for conducting the confirmation of HIV infection.The prevalent trend of HIV infection rate in blood donors was statistically analyzed.Moreover,the highly sensitive fluorescent quantitative method(Rt-PCR) was used to confirm the existence of HIV RNA in the samples with anti-HIV negative/ NAT test positive and the follow up was performed to conduct the retest for judging whether being the HIV window infection period.ResultsThe number of blood donors was increased year by year during 2003-2014 and the positive rate of anti-HIV screening demonstrated the steadily declining trend,but the prevalence rate of HIV infected donors confirmed by CDC was sharply increased,the HIV infection rate of blood donors in 2014 was 26.61 times of that in 2003,among them,the transmission proportion by homosexual behavior was elevated year by year.Through following up retest and Rt-PCR detection,4 samples of anti-HIV negative /NAT positive were finally identified as the window infection period,the detection rate of HIV window infection period in Shenzhen area was 1/117 995(4/471 978).The infection rate of HIV in the male group,18-<39 years old group,married group and first-time donor group among voluntary donors were significant higher than that in the female group,39-<60 years old group,unmarried group and re-donation group(P<0.05).However,there was no statistically significant difference between the locality census register group and local household registration group(P>0.05).ConclusionThe blood screening system and measures in Shenzhen area could better eradicate the blood transfusion risk brought by the HIV window infection period and effectively ensure the blood transfusion safety.

Key words:blood donors;human immunodeficiency virus;virus nucleic acid detection;fluorescence quantitative polymerase chain reaction;window period

(收稿日期：2015-10-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.005

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)03-0299-04

作者簡(jiǎn)介：王霞，女，主管護(hù)師，主要從事血液采集、質(zhì)量控制與血液安全研究。

*基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目(B2014358)。