蘇會(huì)玲　蘇紅慧　陳雪霽　藺　強(qiáng)　陳　坤　劉風(fēng)玲

作者單位:062552 河北醫(yī)科大學(xué)附屬華北石油管理局總醫(yī)院(蘇會(huì)玲，蘇紅慧，陳雪霽，藺　強(qiáng)，陳　坤)；050011 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院(劉風(fēng)玲)

c-Met和p-Akt與胃癌血管生成擬態(tài)的關(guān)系

蘇會(huì)玲蘇紅慧陳雪霽藺強(qiáng)陳坤劉風(fēng)玲

作者單位:062552 河北醫(yī)科大學(xué)附屬華北石油管理局總醫(yī)院(蘇會(huì)玲，蘇紅慧，陳雪霽，藺強(qiáng)，陳坤)；050011 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院(劉風(fēng)玲)

【摘要】目的探討p-Akt蛋白與HGF/c-Met通路是否參與胃癌VM的形成及其可能的分子機(jī)制。方法按照入組標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)，收集胃癌患者共74例，正常對(duì)照患者16例。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法，檢測(cè)腫瘤組織及正常對(duì)照組中c-Met受體、p-Akt蛋白的表達(dá)情況，應(yīng)用CD-34和PAS雙染法測(cè)定VM。結(jié)果c-Met受體與VM表達(dá)呈顯著正相關(guān)(γ=0.277，P<0.05)，p-Akt蛋白和VM的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(γ=0.409，P<0.05)，表明c-Met受體、p-Akt蛋白與胃癌VM的生成存在顯著相關(guān)性。結(jié)論胃癌組織中存在血管生成擬態(tài)。c-Met受體、p-Akt蛋白在胃癌VM發(fā)生中可能起重要作用。

【關(guān)鍵詞】胃癌；c-Met；p-Akt；VM；血管生成；通路

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:043～046)

目前，由于胃癌缺乏明確的危險(xiǎn)因素、特異性的早期癥狀等原因，胃癌常常到晚期才得以診斷。對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)理及治療模式的研究將有助于我們?cè)缛崭芜@一頑疾。

血管生成擬態(tài)是指快速增長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞本身可以形成類(lèi)似血管樣的管道結(jié)構(gòu)。血管生成擬態(tài)已在多種實(shí)體瘤中得到發(fā)現(xiàn)，并且存在血管生成擬態(tài)的患者預(yù)后往往不佳。

失控性的細(xì)胞生存、生長(zhǎng)，血管生成及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移都是腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志性特征。最新研究表明，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和它的受體酪氨酸激酶c-Met和這些過(guò)程密切相關(guān)，同時(shí)針對(duì)這些小分子的靶向治療取得了初步的成效。同時(shí)c-Met受體與p-Akt蛋白的表達(dá)相關(guān)，而c-Met受體與p-Akt蛋白在VM的形成過(guò)程中是否起作用，還不是十分明確。本文探討p-Akt蛋白與HGF/c-Met通路是否參與胃癌VM的形成及其可能的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1　臨床資料

入組標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前檢查資料完善、手術(shù)記錄及術(shù)后病理資料完整、胃癌原發(fā)灶位于食管齒狀線以下至幽門(mén)部位及術(shù)前未行新輔助放化療，排除胃部良性腫瘤、殘胃癌及既往患有其他惡性腫瘤的患者，最終本研究共收集華北石油總醫(yī)院普外科2003年9月1日至2008年8月18日行手術(shù)治療的74例患者的胃癌組織及相應(yīng)的癌旁組織(距癌灶2~5 cm)。74例患者的臨床病理特征見(jiàn)表1。年齡23~81歲，平均年齡：(58.92±11.212)歲；其中男性56例，平均年齡(60.66±10.590)歲；女性18例，平均年齡(54.72±13.024)歲。按原發(fā)灶部位，賁門(mén)+胃底部共16例，胃竇部38例，胃體部20例。按組織學(xué)分型，胃管狀腺癌18例，胃低-未分化腺癌34例，胃印戒細(xì)胞癌13例，胃粘液腺癌7例，胃乳頭狀腺癌1例，胃肝樣腺癌1例。按腫瘤分化程度，高分化5例，中分化17例，低分化及未分化52例。按照AJCC第六版TNM分期，T18例，T28例，T341例，T417例；N023例，N123例，N221例，N37例；M065例，M19例；Ⅰ期10例，Ⅱ期13例，Ⅲ期26例，Ⅳ期25例。無(wú)脈管瘤栓患者59例，存在脈管瘤栓患者15例。

1.2　實(shí)驗(yàn)試劑

兔抗人c-Met多克隆抗體工作液、兔抗人磷酸化蛋白激酶AKT1,2,3抗體原液(bs-5193R)、兔抗人CD34單克隆抗體工作液、兔抗人原始造血細(xì)胞、單克隆抗體工作液、二步法免疫組化檢測(cè)試劑(PV-6001/PV-6002)及DAB試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，其他試劑由華北石油總醫(yī)院病理科提供。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

本研究采用免疫組織化學(xué)SP法，蠟塊切成厚約4 μm放入60 ℃烘箱內(nèi)烤片過(guò)夜；脫蠟；抗原微波熱修復(fù)；內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活；滴加山羊血清封閉液；滴加兔抗人c-Met或p-Akt特異性單克隆抗體或兔抗人CD34單克隆抗體工作液，37 ℃孵育2 h；滴加山羊抗兔IgG/HRP多聚體，溫育30 min；滴加DAB顯色劑；蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。

CD34和PAS套染 CD34染色，DAB顯色后，流水沖洗1 min終止顯色反應(yīng)，PAS染色按照《臨床技術(shù)操作規(guī)范-病理學(xué)分冊(cè)》說(shuō)明進(jìn)行。

1.4　陽(yáng)性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1c-Met和p-Akt陽(yáng)性判定c-Met陽(yáng)性染色為細(xì)胞胞質(zhì)著色呈黃色或棕黃色顆粒。p-Akt陽(yáng)性染色以胞質(zhì)內(nèi)著色呈黃色或棕黃色顆粒。應(yīng)用Mattern積分法，即由染色陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估。每例標(biāo)本選擇含有陽(yáng)性細(xì)胞的5個(gè)高倍鏡視野(×400)，并計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，最后取其平均值作為陽(yáng)性細(xì)胞百分率，0分：陽(yáng)性細(xì)胞為0，1分：陽(yáng)性細(xì)胞率≤10%，2分：陽(yáng)性細(xì)胞率≤50%，3分：陽(yáng)性細(xì)胞>50%；染色強(qiáng)度評(píng)估，0分：陰性，1分：淺黃色，2分：深黃色，3分：棕黃色。最終將上述兩值相加，積分≤1視為c-Met和p-Akt陰性表達(dá)，積分≥2判定為免疫組化陽(yáng)性表達(dá)。

1.4.2VM(血管生成擬態(tài))判定標(biāo)準(zhǔn)腫瘤細(xì)胞構(gòu)成VM的管壁結(jié)構(gòu)，中央有紅細(xì)胞存在，VM周?chē)蠵AS陽(yáng)性物質(zhì)，VM周?chē)鷽](méi)有壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)紅細(xì)胞滲漏。 以上均由病理科兩名醫(yī)師采用單盲法進(jìn)行閱片。

1.5　隨訪

所有患者隨訪日期自手術(shù)之日起至2014年12月31日。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p-Akt、c-Met受體與各臨床病理參數(shù)之間采用χ2檢驗(yàn)；兩變量相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)進(jìn)行分析。以上均以P<0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果

2.1　胃癌患者VM

胃癌患者中存在VM，陽(yáng)性率為29.73%(22/74)，而在對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)VM的存在，兩組間差異顯著(P<0.05)。

2.2　胃癌患者VM與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系

胃癌患者VM與患者性別、年齡、原發(fā)灶部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)密切相關(guān)性(P>0.05)，而與組織學(xué)分型、腫瘤分化程度、脈管瘤栓、腫瘤浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分期密切相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3　胃癌患者c-Met受體、p-Akt蛋白表達(dá)間的相關(guān)性

c-Met受體與p-Akt蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)性(γ=0.501，P<0.05)，表明c-Met受體與p-Akt蛋白表達(dá)存在一定的相關(guān)性，見(jiàn)表2。

2.4　c-Met受體、p-Akt蛋白表達(dá)與胃癌患者VM的關(guān)系

c-Met受體、p-Akt蛋白高表達(dá)患者VM顯著高于低表達(dá)患者(P<0.05)，表明c-Met受體、p-Akt蛋白與腫瘤VM顯著相關(guān)，見(jiàn)表3。

2.5　胃癌患者c-Met受體、p-Akt蛋白與VM表達(dá)的相關(guān)性

c-Met受體與VM表達(dá)呈顯著正相關(guān)(γ=0.277，P<0.05)，p-Akt蛋白與VM表達(dá)呈顯著正相關(guān)(γ=0.409，P<0.05)，表明c-Met受體、p-Akt蛋白與胃癌VM的生成存在顯著相關(guān)性，見(jiàn)表3。

表1　血管生成擬態(tài)表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系/例

表2　胃癌c-Met受體和p-Akt蛋白表達(dá)的關(guān)系/例

表3　胃癌血管生成擬態(tài)與c-Met受體和p-Akt蛋白

3　討論

3.1　VM的產(chǎn)生機(jī)制

Hess等[1]研究顯示在存在VM的黑色素瘤中VE-cadherin與EphA2共同存在于細(xì)胞間接觸部位，并且兩者共同調(diào)節(jié)VM的生成，而EphA2的過(guò)表達(dá)又可以引起MMP2的表達(dá)上調(diào)[2]，而MMP2在腫瘤的侵潤(rùn)過(guò)程中起重要作用。Duxbury等[2]認(rèn)為EphA2引起MMP2的表達(dá)上調(diào)是通過(guò)FAK調(diào)節(jié)的。Hess等[3]的研究又顯示激活的FAK通過(guò)引起ERK1/2的磷酸化而存進(jìn)MMP-2和MT1-MMP的活化。而之前的研究又顯示laminin5γ2可以被MMP-2和MT1-MMP分解為5γ2'和5γ2x的片段[4]。因此該過(guò)程正如Paulis等[5]所總結(jié)的那樣，乏氧誘導(dǎo)因子2α(HIF-2α)上調(diào)血管上皮鈣黏素(VE-cadherin)的轉(zhuǎn)錄，VE-cadherin隨后引起EphA2在細(xì)胞膜上的重新定位，定位在細(xì)胞膜上的EphA2緊接著發(fā)生磷酸化使EphA2激活。激活的EphA2受體磷酸化局部粘著斑激酶(FAK)，活化的FAK再引起細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1/2)和磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)的激活，此外PI3K還可以不依賴(lài)FAK而被VE-cadherin/EphA2直接活化?；罨腜I3K又引起前膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1(pro-MT1-MMP)向活化的MT-MMP間轉(zhuǎn)化，隨后MT-MMP引起前基質(zhì)金屬蛋白酶2(pro-MMP2)的活化，活化的MT1-MMP和MMP-2共同促進(jìn)層黏連蛋白5γ2(laminin5γ2)斷裂成5γ2'和5γ2x片段，這些片段最終引起腫瘤組織內(nèi)VM的形成。

此外，包括環(huán)磷腺苷信號(hào)通路、乏氧誘導(dǎo)的信號(hào)通路、環(huán)氧合酶-2信號(hào)通路在內(nèi)的多種信號(hào)通路也可能參與VM的形成。

3.2　c-Met受體與p-Akt蛋白與胃癌VM生成的關(guān)系及可能的分子機(jī)制

本研究顯示，胃癌患者中存在VM，陽(yáng)性率為29.73%(22/74)，而在對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)VM的存在，兩組間差異顯著(P<0.05)。并且胃癌患者VM與組織學(xué)分型、腫瘤分化程度、脈管瘤栓、腫瘤浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分期密切相關(guān)(P<0.05)。這與劉文斌[6]、李熳[7]等的研究基本一致。劉文斌研究顯示肝細(xì)胞癌中存在基質(zhì)型VM，其表達(dá)與腫瘤大小、分級(jí)、分期、血管侵犯有關(guān)，是肝癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。李熳的研究顯示胃腺癌中存在VM，且與分化程度有關(guān)，VM是胃腺癌不良預(yù)后的指標(biāo)之一。

c-Met受體、p-Akt蛋白高表達(dá)患者VM顯著高于低表達(dá)患者(P<0.05)，c-Met受體和VM的表達(dá)顯著正相關(guān)(γ=0.277，P<0.05)，p-Akt蛋白和VM的表達(dá)顯著正相關(guān)(γ=0.409，P<0.05)，表明c-Met受體、p-Akt蛋白與胃癌VM的生成存在顯著相關(guān)性。而目前未見(jiàn)到這方面的相關(guān)報(bào)道，對(duì)于HGF/SF-Met信號(hào)通路與血管生成的關(guān)系，目前認(rèn)為c-Met受體被配體激活后，羧基末端磷酸化為下游信號(hào)Src、Gab1、Grb2等提供停泊位點(diǎn)。HGF/SF-Met信號(hào)通路又可以激活多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，例如SRC-FAK通路、PI3K-AKT通路、RAS-RAF-MAPK通路等。其中，SRC-FAK通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附與遷徙，PI3K-AKT通路激活細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和抗凋亡作用，RAS-RAF-MAPK通路可以引起細(xì)胞播散及增值。這些下游信號(hào)通路直接或間接刺激血管的生成，此外HGF還可以引起VEGF的表達(dá)上調(diào)引起腫瘤的血管生成。

關(guān)于本研究中VM發(fā)生的分子機(jī)制，可能與下列通路有關(guān)。c-Met受體表達(dá)的上調(diào)引起PI3K-Akt信號(hào)通路的激活?；罨腜I3K可以直接激活MT1-MMP，隨后激活的MT1-MMP引起MMP-2蛋白的活化，進(jìn)而分解細(xì)胞周?chē)鷏aminin5γ2。p-Akt蛋白的活化，可以誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)的上調(diào)。Pez等[8]的研究表明，PI3K-Akt信號(hào)通路的激活可以使p-Akt蛋白促進(jìn)下游靶蛋白糖原合成酶激酶3(GSK-3)磷酸化，從而抑制HIF-1α降解，使HIF-1α表達(dá)增加，同時(shí)p-Akt蛋白又可以促進(jìn)mTOR的表達(dá)，這也促進(jìn)HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄。HIF-1α表達(dá)的上調(diào)可以促進(jìn)VEGF的表達(dá)。VEGF作為血管生成的主要調(diào)控因子，Vartanian等[9]的研究顯示，抑制VEGF的表達(dá)可以顯著抑制骨肉瘤VM的形成。5、VEGF還可以直接刺激VE-cadherin與EphA2的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)VM的形成。Li等[10]研究顯示，在存在VM的胃癌患者中HIF-1α和VEGF的表達(dá)顯著高于無(wú)VM的胃癌患者。

胃癌組織中存在血管生成擬態(tài)，VM是腫瘤細(xì)胞為適應(yīng)環(huán)境而產(chǎn)生的1種獨(dú)特的血液供應(yīng)模式，與內(nèi)皮依賴(lài)性血管并存于胃癌組織內(nèi)。

胃癌患者存在VM組與無(wú)VM組c-Met受體、p-Akt蛋白的表達(dá)存在顯著差異，表面c-Met受體、p-Akt蛋白在胃癌VM發(fā)生中可能起重要作用。

參考文獻(xiàn)

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(編輯：吳小紅)

Relationship between Expression of c-Met and p-Akt and Vasculogenic Mimicry in

Gastric Cancer

SUHuiling,SUHonghui,CHENXueji,etal.HuabeiOilfieldGeneralHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity,Cangzhou,062552.

【Abstract】ObjectiveTo explore the correlation between p-Akt protein and HGF/c-Met pathway in gastric cancer and their association with vasculogenic mimicry (VM).MethodsAccording to the inclusion criteria and the exclusion criteria,a total of 74 cases of gastric cancer patients,and 16 cases of normal control patients were collected.The expression of c-Met receptor and p-Akt protein in the tumor tissues and the normal control group were detected by immunohistochemical method,CD-34 and PAS double staining were used to detect VM.ResultsThe expression of c-Met receptor and VM was significantly positively correlated(γ=0.277，P<0.05)，the p-Akt protein and VM was significantly positively correlated (γ=0.409，P<0.05)，indicated that the expression of c-Met receptor and p-Akt protein were significantly positively correlated with VM.ConclusionVM exists in gastric carcinoma.C-Met receptor and p-Akt protein may play important role in the occurrence of VM in gastric cancer.

【Key words】Gastric carcinoma;c-Met；p-Akt；Vasculogenic mimicry (VM)；Angiogenesis；Pathway

收稿日期(2015-06-12修回日期 2015-11-20)

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)01-0043-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.013

通訊作者：蘇紅慧