王永濤　李波清

作者單位:255400 濱州醫(yī)學(xué)院附屬臨淄區(qū)人民醫(yī)院(王永濤)；264003 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室(李波清)

IGF信號(hào)通路與肺腺癌EGFR-TKI治療獲得性耐藥的關(guān)系

王永濤李波清

作者單位:255400 濱州醫(yī)學(xué)院附屬臨淄區(qū)人民醫(yī)院(王永濤)；264003 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室(李波清)

【摘要】目的探究胰島素樣生長因子信號(hào)通路在肺腺癌EGFR-TKI治療獲得性耐藥中的作用。方法采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)64例肺腺癌組織和16例正常肺組織中IGF1R和EGFR的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)晚期肺腺癌患者血清中IGF1的含量。結(jié)果IGF1R在肺腺癌組織中的表達(dá)與對(duì)照組無顯著差異，IGF1R的表達(dá)與患者各臨床病理參數(shù)無顯著相關(guān)性(P>0.05)。EGFR在肺腺癌組織中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，且EGFR的表達(dá)受腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期的影響(P<0.05)。IGF1R與EGFR在肺腺癌患者中的表達(dá)顯著相關(guān)(P<0.05)；在晚期接受EGFR-TKI治療的肺腺癌患者中，病情進(jìn)展后血清中IGF1的含量較治療前顯著增高(P<0.05)。結(jié)論胰島素樣生長因子信號(hào)通路在肺腺癌患者EGFR-TKI治療獲得性耐藥中起一定作用。

【關(guān)鍵詞】肺腺癌；IGF1R；EGFR；IGF1；EGFR-TKI；耐藥

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:029～032)

肺癌是包括中國及美國在內(nèi)的世界許多國家癌癥的頭號(hào)死亡原因。2014年美國肺癌的新發(fā)病例數(shù)估計(jì)為224210例，死于肺癌的患者估計(jì)將達(dá)159260例[1]。盡管在過去的10年中，在肺癌的篩查、微創(chuàng)性診斷及治療以及靶向治療等領(lǐng)域的研究取得了重要的進(jìn)展，但目前僅有16.6%的患者能夠在確診后存活5年及以上[2]。由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性及基因組的不穩(wěn)定性，靶向治療的患者仍不可避免的出現(xiàn)耐藥。因此，通過對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究將有助于我們進(jìn)一步明確靶向治療耐藥機(jī)制，為聯(lián)合多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物及逆轉(zhuǎn)耐藥提供理論依據(jù)。本研究首先檢測(cè)EGFR與IGF1R在肺腺癌患者中的表達(dá)情況，進(jìn)一步分析二者表達(dá)的相關(guān)性并探討可能的分子機(jī)制；然后研究晚期肺腺癌患者口服EGFR-TKI治療前與口服EGFR-TKI病情進(jìn)展后血液中IGF1含量的變化，進(jìn)一步分析IGF1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在國人EGFR-TKI治療獲得性耐藥中的作用，為靶向EGFR與聯(lián)合IGF1R治療肺腺癌患者提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1　研究對(duì)象

按照患者術(shù)前檢查資料完善、手術(shù)記錄及術(shù)后病理資料完整、術(shù)后病理證實(shí)為肺腺癌及術(shù)前未行新輔助放化療的入組標(biāo)準(zhǔn)，除外既往患有其他惡性腫瘤的患者、肺良性腫瘤及糖尿病等代謝性疾病的患者。最終本研究首先收集淄博市臨淄區(qū)人民醫(yī)院2002年10月1日至2010年12月31日之間行手術(shù)治療的64例肺腺癌患者的肺癌組織及16例正常肺組織。64例患者中男性28例，平均年齡57歲；女性36例，平均年齡59歲；按腫瘤分化程度：高分化11例，中分化19例，低分化34例；按照AJCC第六版肺癌TNM分期：T122例，T232例，T310例；N022例，N135例，N27例；Ⅰ期16例，Ⅱ期38例，Ⅲ期10例。之后收集淄博市臨淄區(qū)人民醫(yī)院腫瘤血液科2012年5月1日至2014年8月31日之間收治的晚期肺腺癌患者共20例，患者滿足病理證實(shí)為肺腺癌且存在EGFR突變、體力狀態(tài)評(píng)分(performance status，PS)0～2分及按實(shí)體腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST 1.0版)具有至少1個(gè)可測(cè)量的病灶用于后續(xù)療效評(píng)定的入選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2　實(shí)驗(yàn)試劑

IGF-1ELISA試劑盒及免疫組化所需兔抗人IGF1R和EGFR單克隆抗體、山羊抗兔IgG/HRP多聚體及DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，其他試劑由淄博市臨淄區(qū)人民醫(yī)院病理科提供。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1免疫組化本研究采用免疫組織化學(xué)SP法，蠟塊切成厚約4 μm放入60 ℃烘箱內(nèi)烤片過夜；脫蠟；抗原微波熱修復(fù)；內(nèi)源性過氧化物酶滅活；滴加山羊血清封閉液；滴加兔抗人IGF1R或兔抗人EGFR單克隆抗體工作液，37 ℃孵育2 h；滴加山羊抗兔IgG/HRP多聚體，溫育30 min；滴加DAB顯色劑；蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。

1.3.2ELISA實(shí)驗(yàn)于應(yīng)用EGFR-TKI治療前及EGFR-TKI治療進(jìn)展后取入組患者靜脈血，清晨空腹采集靜脈血5 mL，離心后取血清于-20 ℃保存，之后按ELISA試劑盒說明檢測(cè)患者血清中IGF-1含量。所有患者均簽署知情同意書。

1.4　結(jié)果判定

IGF1R和EGFR陽性染色為細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)著色呈黃色或棕黃色顆粒。應(yīng)用Mattern積分法，即由染色陽性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估。每例標(biāo)本選擇含有陽性細(xì)胞的5個(gè)高倍鏡視野(×400)，并計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，最后取其平均值作為陽性細(xì)胞百分率，0：陽性細(xì)胞=0%，1：陽性細(xì)胞≤10%，2：陽性細(xì)胞≤50%，3：陽性細(xì)胞>50%。染色強(qiáng)度評(píng)估，0：陰性，1：淺黃色，2：深黃色，3：棕黃。最終將上述兩值相加，積分≤1視為陰性表達(dá)結(jié)果，積分2～6判定為免疫組化陽性表達(dá)結(jié)果，并進(jìn)一步將2～3分判定為弱陽性，4～6分為強(qiáng)陽性。

以上均由病理科2名醫(yī)師采用單盲法進(jìn)行閱片。

1.5　統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，IGF1R和EGFR受體與各臨床病理參數(shù)之間采用χ2檢驗(yàn)；兩變量相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)進(jìn)行分析，肺腺癌患者應(yīng)用EGFR-TKI治療前及疾病進(jìn)展后血清中IGF1的變化應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)。以上均以P<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果

2.1　癌組織與癌旁組織中IGF1R及EGFR的表達(dá)情況

IGF1R及EGFR陽性表達(dá)主要位于肺癌細(xì)胞胞質(zhì)中。如表1所示，在肺腺癌患者中，IGF1R強(qiáng)陽性表達(dá)率為51.56%(33/64)，正常肺組織中的強(qiáng)陽性表達(dá)率為43.75%(7/16)，二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；肺腺癌組織EGFR的強(qiáng)陽性表達(dá)率為40.63%(26/64)，而在正常肺組織中強(qiáng)陽性表達(dá)率為0.00%(0/16)，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2　肺腺癌組織中IGF1R和EGFR的表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

如表1所示，IGF1R在肺腺癌患者癌組織中的表達(dá)與患者各臨床病理參數(shù)無顯著相關(guān)性(P>0.05)；而EGFR的表達(dá)受腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期的影響(P<0.05)。

2.3　肺腺癌組織中IGF1R與EGFR表達(dá)之間的關(guān)系

64例肺腺癌患者中，IGF1R與EGFR的表達(dá)同為陽性者為22例，同為陰性者為27例，二者的表達(dá)呈顯著相關(guān)性(γ=0.547，P<0.05)。見表2。

表2　IGF1R與EGFR在肺腺癌中表達(dá)的相關(guān)性分析/例

2.4　EGFR-TKI治療前及EGFR-TKI治療進(jìn)展后患者血清中IGF1含量的變化

入組的晚期肺腺癌EGFR突變患者接受EGFR-TKI治療前IGF1血清含量為(152.375±11.426)μg/l，EGFR-TKI治療進(jìn)展后為(192.125±14.952)μg/l，應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)，EGFR-TKI治療耐藥前后IGF1血清含量顯著升高(t=7.342,P<0.05)。

表1　IGF1R、EGFR的表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征間的關(guān)系/例

3　討論

EGFR-TKI耐藥主要有兩種情況：一是原發(fā)性耐藥；二是獲得性耐藥。目前原發(fā)性耐藥的準(zhǔn)確分子機(jī)制尚不清楚，一些學(xué)者認(rèn)為不同患者間EGFR基因突變位點(diǎn)存在差異，因而造成了患者對(duì)酪氨酸激酶抑制劑的敏感性不同。例如，典型的EGFR突變?yōu)?9外顯子L858R點(diǎn)突變，該突變類型的患者對(duì)TKI治療高度敏感[3]，然而EGFR基因20外顯子插入突變的患者對(duì)EGFR-TKI的治療無效[4]。而對(duì)于獲得性耐藥的研究主要有兩種機(jī)制，一種為EGFR基因的二次突變使得下游通路再次激活[5]，另一種情況為下游信號(hào)分子通過不同通路間交叉對(duì)話而激活[6]，目前了解較多的是肝細(xì)胞樣生長因子(c-MET)受體的擴(kuò)增，進(jìn)而激活下游PI3K-AKT信號(hào)分子造成耐藥[7]。

胰島素受體及胰島素樣生長因子受體是受體酪氨酸激酶(RTK)家族的一員。胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)及胰島素受體在人體正常組織中存在廣泛表達(dá)，這些受體均為四聚體結(jié)構(gòu)，其中胞外結(jié)構(gòu)域與配體結(jié)合，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域含有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域[8]。IGF1R的激活可進(jìn)一步引起下游通路中PI3K、AKT、RAS等的活化[9]，影響細(xì)胞的代謝、促進(jìn)細(xì)胞的存活。目前已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGF1R在腫瘤細(xì)胞系及腫瘤組織中廣泛表達(dá)，并且IGF對(duì)腫瘤細(xì)胞系具有促有絲分裂作用[10]。

我們應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)了64例肺腺癌患者和16例正常對(duì)照組之間IGF1R的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IGF1R在肺腺癌中的強(qiáng)陽性表達(dá)率為51.56%，而在正常肺組織中的表達(dá)也達(dá)到43.75%，二者間無顯著差異(P>0.05)。本研究的結(jié)果與Cappuzzo等[11]的研究結(jié)果相似，Cappuzzo檢測(cè)了369例非小細(xì)胞肺癌患者，最后證實(shí)IGF1R在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)率為76.4%。本研究進(jìn)一步的分析顯示IGF1R在肺腺癌患者不同性別、年齡、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，這一結(jié)果與Gately等[12]的結(jié)果相一致，Gately的實(shí)驗(yàn)證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌患者中IGF1R的表達(dá)與性別、年齡、是否吸煙、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期無關(guān)。

EGFR屬于受體酪氨酸激酶(RTK)中的HER/erbB家族，該家族成員包括HER1(EGFR/erbB1)、HER2(neu/erbB2)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)[13]。EGFR通過胞外結(jié)構(gòu)域與配體結(jié)合，通過跨膜細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而激活RAS-RAF-MEK-MAPK、PI3K-AKT等胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[14]。EGFR下游信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞抗凋亡、促存活、遷移及血管生成過程中發(fā)揮重要作用[15]。目前研究顯示，EGFR胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的活性可受EGFR基因突變、EGFR基因拷貝數(shù)增加及EGFR過表達(dá)等多種方式而異?；罨痆16]。本研究發(fā)現(xiàn)EGFR在肺腺癌中的強(qiáng)陽性表達(dá)率為40.63%(26/64)，顯著高于正常肺組織(P<0.05)。進(jìn)一步分析顯示，EGFR在肺腺癌中的表達(dá)受不同分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期的影響(P<0.05)。

目前，已有基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGF1R作為RTK家族的一員，同EGFR通路間存在廣泛的交叉對(duì)話，并共同激活下游PI3K/AKT及MAPK信號(hào)通路[17]。Gong等[18]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了聯(lián)合IGF1R及EGFR靶向藥物可以引起非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的凋亡，而單一靶點(diǎn)的抑制僅引起細(xì)胞周期停滯。本研究發(fā)現(xiàn)在應(yīng)用EGFR-TKI治療進(jìn)展后，患者血清中IGF1的含量明顯增高，對(duì)此可能的解釋是：血清中增高的IGF1激活I(lǐng)GF1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路因與EGFR信號(hào)通路間存在交叉對(duì)話進(jìn)而激活共同的下游PI3K/AKT及MAPK信號(hào)通路，從而造成耐藥。因此，聯(lián)合IGF1R及EGFR靶向藥物可能在逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI獲得性耐藥中產(chǎn)生較好的臨床療效，最終使患者受益。

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(編輯：吳小紅)

Relationship between Insulin-Like Growth Factor Signaling Pathway and Drug Resistance of EGFR-TKI Therapy in Lung Adenocarcinoma

WANGYongtao,LIBoqing.LinziDistrictPeople'sHospitalAffiliatedtoBinzhouMedicalCollege,Zibo,255400

【Abstract】ObjectiveTo explore the relationship between insulin-like growth factor(IGF) signaling pathway drug resistance of EGFR-TKI therapy in lung adenocarcinoma.MethodsThe expression of IGF1R and EGFR were detected by streptavidin perotridase in 64 cases of lung adenocarcinoma tissues and 16 cases of normal lung tissues.The content of IGF1 in serum of patients with advanced lung adenocarcinoma were detected by ELISA.ResultsThere were no significant differences in IGF1R expression between the 2 groups and the expression of IGF1R also had no significant correlation with clinicopathologic parameters(P>0.05).The expression of EGFR in the lung adenocarcinoma was significantly higher than that of the control group and was associated with degrees of differentiation,depth of invasion,lymph nodes metastasis and stages (P<0.05).The expression of IGF1R in patients with lung adenocarcinoma was significantly associated with EGFR (P<0.05).The serum level of IGF1 in patients with advanced lung adenocarcinoma significantly increased after resistance to EGFR-TKI therapy (P<0.05).Conclusion

IGF signaling pathway plays a certain role in acquired resistance to EGFR-targeted therapy in lung adenocarcinoma.

【Key words】Lung adenocarcinoma;IGF1R;EGFR;IGF1;EGFR-TKI;Resistance

中圖分類號(hào)：R734.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)01-0029-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.009

通訊作者：李波清

收稿日期(2015-04-21修回日期 2015-09-29)