崔榮花　王美清　彭大為　李建旺　張曙波　謝宗宙　程小珍　毛山山　元建華

rAd-p53聯(lián)合順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)及KAI1/CD82蛋白表達(dá)的影響

崔榮花王美清彭大為李建旺張曙波謝宗宙程小珍毛山山元建華

作者單位:570208 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院

【摘要】目的觀察rAd-p53、順鉑(DDP)單獨(dú)及聯(lián)合作用于人胃癌SGC7901細(xì)胞后，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖凋亡情況、KAI1/CD82蛋白表達(dá)情況的影響。方法rAd-p53、DDP單獨(dú)及聯(lián)合作用于胃癌SGC7901細(xì)胞株24、48、72 h后，CCK-8法測(cè)定SGC7901細(xì)胞體外增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，免疫組化法檢測(cè)KAI1/CD82蛋白表達(dá)情況。結(jié)果rAd-p53、DDP單獨(dú)及聯(lián)合作用于SGC7901細(xì)胞后，細(xì)胞增殖被抑制，并呈劑量和時(shí)間依賴性，且兩藥聯(lián)合組細(xì)胞增殖抑制率明顯高于單用組，與陰性對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；rAd-p53、DDP單獨(dú)及兩藥聯(lián)合作用SGC7901細(xì)胞48h后，細(xì)胞凋亡率為36.94%±0.78%、28.79%±2.37%，69.26%±0.63%；rAd-p53、DDP單獨(dú)及兩藥聯(lián)合均可上調(diào)KAI1/CD82蛋白表達(dá)，且兩藥聯(lián)合組更明顯。結(jié)論rAd-p53、DDP單獨(dú)及兩藥聯(lián)合均可抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡，二者聯(lián)合對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，rAd-p53可能通過(guò)上調(diào)KAI1/CD82的表達(dá)誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡，同時(shí)增強(qiáng)DDP的抗腫瘤作用。

【關(guān)鍵詞】重組人P53腺病毒注射液；SGC7901；KAI1/CD82

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:010～013)

胃癌是世界上威脅人類健康最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，多數(shù)病例確診時(shí)已屬中、晚期，臨床治療效果欠佳。目前針對(duì)其相關(guān)生物靶點(diǎn)的基因治療的研究很少，因此尋找胃癌治療的新策略迫在眉睫。順鉑為臨床上胃腸道腫瘤化療常用藥物，但其藥理作用的發(fā)揮往往需要很高劑量，毒副作用很大，其很多患者出現(xiàn)耐藥，因此無(wú)法通過(guò)進(jìn)一步增加劑量來(lái)提高療效。人類p53基因在惡性腫瘤的激化演變過(guò)程中起著重要作用，有野生型和突變型兩種，突變型p53能促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，研究證實(shí)其在胃癌中突變率達(dá)32℅，它的缺失與突變與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后有密切的關(guān)系[1-2]。重組人p53腺病毒注射液(Recombinant Human adenovirus p53 injection，rAd-p53)-今又生(Gendicine)是世界上第一個(gè)獲準(zhǔn)上市的腫瘤基因治療藥物，由正常人腫瘤抑制基因p53和改構(gòu)的5型腺病毒基因重組而成，其中腺病毒起載體作用，攜帶治療基因p53進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用[3]。KAI1/CD82是近幾年國(guó)內(nèi)外研究比較熱的1種特異性腫瘤抑制基因,最初在研究前列腺癌時(shí)發(fā)現(xiàn)[4],研究證實(shí)其能夠通過(guò)多種通路抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[5]，且其與p53在在惡性腫瘤中的表達(dá)及相關(guān)性國(guó)內(nèi)外研究不一，因此本研究擬觀察rAd-p53、DDP單藥及聯(lián)合對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、凋亡作用，并觀察KAI1/CD82蛋白表達(dá)情況，為rAd-p53治療胃癌提供更多的理論依據(jù)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)胃癌的靶向治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1　材料

人胃癌SGC7901細(xì)胞株由?？谑腥嗣襻t(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存，重組人p53腺病毒注射液購(gòu)于深圳市賽百諾基因技術(shù)公司，順鉑購(gòu)于云南個(gè)舊藥業(yè)股份有限公司，CCK-8為日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品，兔抗人KAI1/CD82單克隆抗體為北京博奧森公司產(chǎn)品，AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒為Biovision公司產(chǎn)品，RPMI1640為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，胰酶、DMSO為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%小牛血清培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)，以0.25%胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為rAd-p53組(濃度分別為5×108vp/ml、 5×109vp/ml、5×1010vp/ml)；DDP組(濃度分別為2.5 mg/L、5mg/L、7.5 mg/L)；兩藥聯(lián)合組(濃度分別為5×108vp/ml +2.5 mg/L，5×109vp/ml +5 mg/L，7.5 mg/L+ 5×1010vp/ml)；同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖抑制情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，置培養(yǎng)箱中待24 h細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后棄上清，按照1.2.2實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)分組，分別加入不同濃度的rAd-p53、DDP單藥及聯(lián)合用藥，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)2板，分別培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h后棄上清，每孔加入CCK-8溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出培養(yǎng)板，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度，計(jì)算抑制率：抑制率=(1-給藥組OD值/空白組OD值)×100%。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC7901細(xì)胞以每孔2×105個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于6孔板，分設(shè)陰性對(duì)照組，DDP 7.5 mg/l組、rAd-p53 5×1010組、DDP 7.5mg/l+ rAd-p53 5×1010組，干預(yù)48 h后收集細(xì)胞，胰酶消化離心細(xì)胞，1 000 rpm/min，4 ℃離心5 min棄上清，PBS洗滌2次后,將細(xì)胞重懸于500 μl Binding Buffer中，加入10 μl AnnexinV-FITC和5 μl碘化丙啶(PI)，輕輕混勻,室溫避光5 min，收集進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.2.5免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)SGC7901細(xì)胞中各蛋白的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC7901細(xì)胞以每孔2×105個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于每孔覆有6張蓋玻片的6孔板，每孔2 ml，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待24 h細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，吸除培養(yǎng)液，加藥干預(yù)，分設(shè)陰性對(duì)照組、DDP 7.5 mg/l組、rAd-p53 5×1010組、DDP 7.5 mg/l+ rAd-p53 5×1010組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每組每孔分別加入含有rAd-p53、DDP及兩者混合液的培養(yǎng)液各2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)48 h取出玻片，PBS沖洗，10%中性甲醛固定20 min，晾干后每組取3張蓋玻片進(jìn)行染色。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPASS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組數(shù)據(jù)以mean±SD表示,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用rAd-p53、DDP對(duì)SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

不同濃度的rAd-p53、DDP單藥及聯(lián)合用藥作用于SGC7901細(xì)胞24、48及72 h后，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其抑制率隨濃度增加和時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，且兩藥聯(lián)合組抑制率均大于rAd-p53和DDP單藥作用抑制率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1、2、3。

表1　不同濃度rAd-p53作用不同時(shí)間對(duì)SGC7901細(xì)胞抑制作用

A為陰性對(duì)照組，B為5×108vp/ml組，C為5×109vp/ml組，D為5×1010vp/ml組；與對(duì)照組比較：*為P<0.05，不同時(shí)間段組間和組內(nèi)各濃度比較：▲為P<0.05。

表2　不同濃度DDP作用不同時(shí)間對(duì)SGC7901細(xì)胞抑制作用

A為陰性對(duì)照組，B為2.5 mg/L組，C為5 mg/L組，D為7.5 mg/L組；與對(duì)照組比較：*為P<0.05；不同時(shí)間段組間和組內(nèi)各濃度比較：▲為P<0.05。

表3　rAd-p53聯(lián)合DDP作用不同時(shí)間對(duì)SGC7901細(xì)胞抑制作用

注：A為陰性對(duì)照組，B 為5×108vp/ml+2.5 mg/L組，C為5×109vp/ml+5 mg/L組，D為7.5 mg/L+ 5×1010組；與陰性對(duì)照組比較：*為P<0.05；不同時(shí)間段組間和組內(nèi)各濃度比較：▲為P<0.05。

2.2　單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用rAd-p53、DDP作用于SGC7901細(xì)胞48 h后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：DDP 7.5 mg/L、rAd-p53 5×1010、DDP 7.5 mg/L+ rAd-p53 5×1010作用于胃癌SGC7901細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為28.79%±2.37%、36.94%±0.78%、69.26%±0.63%，與陰性對(duì)照組(16.72%±1.54%)相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3　單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用rAd-p53、DDP48 h后對(duì)SGC7901細(xì)胞KAI1/CD82蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示,陽(yáng)性細(xì)胞染色為棕黃色，DDP 7.5 mg/L、rAd-p53 5×1010、DDP 7.5 mg/L+rAd-p53 5×1010作用于胃癌SGC7901細(xì)胞48 h后，KAI1/CD82蛋白表達(dá)率增高，與陰性對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且兩藥聯(lián)合組其表達(dá)率增高情況更明顯(52.43±3.42)(表4)。

表4　rAd-p53、DDP作用SGC7901細(xì)胞48 h后KAI1/CD82

注:與陰性對(duì)照組比較，*為P<0.05。

3　討論

人類p53基因定位于17號(hào)染色體的短臂上(17P13.1)，全長(zhǎng)16-20 kb，有11個(gè)外顯子和10內(nèi)含子。它分為野生型和突變型2種，野生型p53被稱為“分子警察”，它具有①抑制細(xì)胞的增殖，為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白；②與病毒蛋白或細(xì)胞蛋白結(jié)合而抑癌；③監(jiān)視損傷和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；④誘導(dǎo)細(xì)胞分化；⑤影響其他基因的表達(dá)[6-7]。

突變型p53具有癌基因的作用，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，p53蛋白的缺失、突變和失活在惡性腫瘤激化演變過(guò)程中起著重要作用，其不僅能夠直接作用于腫瘤細(xì)胞，還能調(diào)控其他癌基因或抑癌基因來(lái)影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[8]。因此通過(guò)導(dǎo)入野生型p53基因來(lái)重建細(xì)胞內(nèi)變異的p53已成為腫瘤治療的新策略[9]，而研究證實(shí)60%的胃癌存在p53的突變，p53基因的突變與缺失不僅與胃癌的發(fā)病與預(yù)后有關(guān)，而且與胃癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性亦有密切關(guān)系[10]。

重組人p53腺病毒注射液(recombinant human adenovirus p53 injection，rAd-p53)-今又生(gendicine)，就是通過(guò)腺病毒起載體作用，攜帶治療基因p53進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用。KAI1/CD82是近幾年研究較熱的腫瘤抑制基因，它參與細(xì)胞間、細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的反應(yīng)，這兩種反應(yīng)在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起相當(dāng)重要的作用，研究證實(shí)它可以通過(guò)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附功能、抑制腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移，參與免疫應(yīng)答、增強(qiáng)抗瘤免疫，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路等抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移[11-12]。目前已有研究證實(shí)它是p53基因的靶基因，p53參與調(diào)控KAI1/CD82在惡性腫瘤中的表達(dá)[13]。但是也有的研究得出了相反的結(jié)論。因此本研究我們以胃癌細(xì)胞系SGC7901為靶細(xì)胞,探討rAd-p53聯(lián)合順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡及對(duì)KAI1/CD82蛋白表達(dá)作用的影響。結(jié)果表明rAd-p53、DDP單藥及兩藥聯(lián)合均能抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)抑制率隨藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，即呈劑量和時(shí)間依賴性，且兩藥聯(lián)合抑制作用更強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)凋亡率檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：rAd-p53和DDP作用后隨藥物濃度的增加凋亡率逐漸升高，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合用藥組較單藥組作用更明顯。同時(shí)通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，rAd-p53單用及聯(lián)合DDP作用后，KAI1/CD82蛋白表達(dá)上調(diào)，且兩藥聯(lián)合后上調(diào)作用更為明顯，據(jù)此我們推測(cè)rAd-p53可增強(qiáng)DDP對(duì)胃癌細(xì)胞化療作用，具體機(jī)制可能與野生型p53重新表達(dá)，從而進(jìn)一步致KAI1/CD82表達(dá)上調(diào)，這也與既往研究證實(shí)p53功能的缺失是KAI1/CD82在進(jìn)展期腫瘤中表達(dá)減少或缺失主要原因之一相一致[14]，因此該研究結(jié)果為胃癌的化療聯(lián)合基因治療提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)胃癌的基因靶向治療提供了新的靶點(diǎn)。

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(編輯：吳小紅)

Effect of rAd-p53 and Cisplatin on the Growth of Gastric Cancer Cells and the

Expression of KAI1/CD82 Protein

CUIRonghua,WANGMeiqing,PENGDawei,etal.HaikouMunicipalHospital(XiangyaHaikouHospitalofCentral-SouthUniversity),Haikou,570208

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect and mechanism of rAd-p53 alone or in combination with DDP on growth and apotosis of human gastric cancer cell SGC7901 and expression of KAI1/CD82.MethodsSGC7901cells were treated with rAd-p53 alone or in combination with DDP for 24、48 and 72 hours.Their proliferation was examined by CCK-8 assay.Analyze the apotosis of the tumor cells by flow cytometry(FCM).KAI1/CD82 protein expression was detected by immunohistochemistry staining.ResultsThe proliferation of SGC7901 cell was significantly inhibited in a time-and concentration-dependent manner after treated with rAd-p53 alone or in combination with DDP,the inhibitory effect was significantly enhanced by the combination compared with the negative control group(P<0.05).After treated the with rAd-p53 alone or in combination with DDP treatment for 48 hours，the apotosis rate of SGC7901 cell was 36.94%±0.78%、28.79%±2.37%、69.26%±0.63%.the KAI1/CD82 protein expression was significantly up-regulated after treated with rAd-p53 alone or in combination with DDP，and the role in combined treatment groups was more significant than monotherapy groups.ConclusionThe proliferation of SGC7901 could be inhibited by rAd-p53 alone or in combination with DDP，while their combination enhances the inhibition of gastric cancer cell.rAd-p53 can induce apotosis and inhibit the proliferation of SGC7901 cells,possibly by regulating KAI1/CD82 protein expression，And the 2 agents have synergistic effect.

【Key words】rAd-p53；SGC7901；KAI1/CD82

中圖分類號(hào)：R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)01-0010-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.004

基金項(xiàng)目：2012年海南省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(瓊衛(wèi)2012LX-16)

收稿日期(2015-04-21修回日期 2015-10-08)