千建峰 蔡麗慧 亓衛(wèi)東* 趙 霞 陳 新

1(復旦大學附屬華山醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，上海 200040)2(聚合物分子工程國家重點實驗室，高分子及其先進復合材料協(xié)同創(chuàng)新中心，復旦大學高分子科學系先進材料實驗室,上海 200433)3(鄭州人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科, 鄭州 450012)

不同孔徑絲素蛋白支架體內(nèi)降解觀察

千建峰1,3蔡麗慧1亓衛(wèi)東1*趙 霞1陳 新2

1(復旦大學附屬華山醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，上海 200040)2(聚合物分子工程國家重點實驗室，高分子及其先進復合材料協(xié)同創(chuàng)新中心，復旦大學高分子科學系先進材料實驗室,上海 200433)3(鄭州人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科, 鄭州 450012)

近年來，絲素蛋白支架因其固有的低免疫原性、良好的生物相容性在組織工程研究中備受關(guān)注。通過觀察不同孔徑絲素蛋白支架在活體Sprague-Dawley(SD)大鼠體內(nèi)不同時間點降解的形態(tài)學特點，了解材料的結(jié)構(gòu)特性對絲素蛋白支架降解的影響。將3種不同孔徑絲素蛋白支架：SF1(平均孔徑 (20±1.5) μm，平均孔隙率 86.8%±0.2%)、SF2(平均孔徑(100±8) μm，平均孔隙率 92.4%±0.1%)、SF3(平均孔徑(200±15) μm，平均孔隙率 96.6%±0.1%)隨機植入12只SD大鼠背部皮下，分別于術(shù)后6、12、18、24周隨機取材，分別進行大體觀察、組織切片HE染色和Masson染色。結(jié)果顯示，不同孔徑絲素蛋白支架在體內(nèi)的降解速率不同：SF1 24周內(nèi)未見明降解，SF2 24周內(nèi)降解約40%，SF3至24周時基本崩解。植入早期絲素蛋白支架主要被炎性細胞及成纖維細胞浸潤，后期主要為成纖維細胞，并可見膠原纖維包繞并生長入材料。孔徑較大的絲素蛋白支架比孔徑較小的降解速度快，可通過改變絲素蛋白支架的孔徑有效干預(yù)絲素蛋白支架在生物體內(nèi)的降解速率，以適應(yīng)不同組織修復的需求。

絲素蛋白；多孔支架；組織工程；降解

引言

組織工程技術(shù)包含3個關(guān)鍵要素：種子細胞、支架材料和細胞因子[1]。支架材料作為組織再生的框架，其特性直接影響細胞的粘附、生長和代謝。多孔絲素蛋白支架能夠支持軟骨細胞、骨細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、膠質(zhì)細胞、角質(zhì)化細胞、成纖維細胞、血管、脂肪、神經(jīng)等的黏附、增殖與分化，成為目前組織工程研究的熱點[2-8]。我們已在多孔徑絲素蛋白支架上成功培養(yǎng)了成纖維細胞、許旺細胞[9]，初步觀察了多孔絲素蛋白支架原位修復兔下

頜骨臨界性骨缺損效果[10]。理想的組織工程支架材料不僅要具備良好的生物相容性，還應(yīng)具有與修復區(qū)組織細胞生長速率相匹配的降解速率，這樣才能為新生組織提供相應(yīng)的力學支撐。由于對絲素蛋白材料體內(nèi)降解的控制尚缺乏深入的了解[11-13]，本研究通過對活體動物體內(nèi)埋植不同孔徑絲素蛋白降解行為進行觀察，了解不同孔徑絲素蛋白支架在體內(nèi)降解速率、降解過程中材料的形態(tài)學改變以及宿主的組織學反應(yīng)，為進一步研究絲素蛋白材料體內(nèi)降解的可控提供參考。

1 材料與方法

1.1 多孔絲素蛋白支架的制備

由復旦大學高分子科學系制備3種不同孔徑的絲素蛋白支架，3種支架的規(guī)格均為直徑1.5 cm、厚0.5 cm圓柱體，圓柱體外周為薄致密層，內(nèi)為多孔結(jié)構(gòu)，孔徑平均大小分別為20、100、200 μm，依次以SF1、SF2、SF3命名。

1.2 多孔絲素蛋白支架的基本參數(shù)檢測

1.2.1 孔隙率的測定

采用密度法測量，有

式中，WS為絲素蛋白支架的質(zhì)量，VS為支架的表觀體積，ρ為絲素蛋白密度。

隨機取5個絲素蛋白支架樣品，其中絲素蛋白密度ρ=1.355 g/cm3，計算3種絲素蛋白支架的孔隙率(n=5)。

1.2.2 孔徑的測定

在3種多孔絲素蛋白支架中分別隨機抽取20個樣本，切成小片后冷凍干燥，然后在液氮中脆斷，并用導電膠固定在樣品臺上，噴金后在TS 5136MM型可變真空掃描電子顯微鏡上(500×)對多孔支架斷面的形貌進行觀察，測試電壓為20 kV。多孔支架的孔徑大小和分布由圖像處理軟件隨機選擇50個孔測量并統(tǒng)計平均求得，以Mean±SD表示。

1.3 動物實驗

1.3.1 實驗動物的購買與飼養(yǎng)

健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠12只，體重150～200 g，由復旦大學上海醫(yī)學院實驗動物部提供[許可證:SCXK(滬)2007-0 007]。在復旦大學上海醫(yī)學院實驗動物中心同環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.3.2 支架植入手術(shù)

術(shù)區(qū)備皮，動物用鹽酸氯胺酮注射液(2 mL/0.1 g)與咪達唑侖注射液(2 mL/2 mg)按1∶2比例混合后腹腔麻醉。仰臥位，碘伏于術(shù)區(qū)及周圍5 cm的皮膚常規(guī)消毒、鋪巾。在其脊柱兩側(cè)共作3個長約1 cm切口，潛行分離形成3個皮下囊狀間隙，分別將SF1、SF2、SF3植入左上、右上及左下3個囊狀間隙，絲線分層縫合皮膚切口。

1.3.3 實驗分組及取材

根據(jù)國家標準[14]《醫(yī)療器械生物學評價第六部分：植入后局部反應(yīng)試驗》確定觀察時間為材料植入SD大鼠體內(nèi)術(shù)后6、12、18、24周。每個時間點隨機抽取3只動物取材，每次分別有SF1、SF2、SF3各3個標本。分別進行大體觀察、HE染色、Masson染色組織切片觀察。

1.3.4 術(shù)后觀察及組織學染色

1)大體觀察。動物麻醉后取出皮下植入材料，取材時保留周圍部分組織。觀察材料周圍組織有無明顯炎癥反應(yīng)，材料表面有無明顯纖維組織包繞，周圍組織有無反應(yīng)性肉芽增生，植入材料的外觀形態(tài)改變，測量植入材料的直徑與厚度得出降解百分比。

2)HE染色。將植入材料標本置于10%中性福爾馬林液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光學顯微鏡下觀察不同時間點組織纖維化反應(yīng)、炎性細胞類型，及支架崩解情況，是否存在組織壞死，材料內(nèi)有無組織長入。

3)Masson染色。取出材料保留部分周圍組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、Masson染色，光學顯微鏡下觀察Masson染色結(jié)果，染色后膠原纖維、粘液、軟骨呈藍色，胞漿、肌肉、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，胞核黑藍色。

2 結(jié)果

2.1 多孔絲素蛋白支架孔徑及孔隙率

制備3種多孔絲素蛋白支架材料SF1、SF2、SF3(見圖1)，平均孔徑及孔隙率見表1。

圖1 3種不同孔徑絲素材料掃描電鏡照片(500×)。 (a) SF1； (b) SF2； (c) SF3Fig.1 Scanning electron microscope images of silk fibroin scaffolds with different pore sizes (500×). (a) SF1; (b) SF2; (c) SF3

表1 3種多孔絲素蛋白支架參數(shù)(均值±標準差)Tab.1 Mean aperture and mean porosity of 3 silk fibroin scaffold materials(Mean±SD)

2.2 標本大體觀察

SF1: 術(shù)后6周，SF1形態(tài)、外觀與植入前無明顯變化，移植物周圍無明顯炎癥反應(yīng)；術(shù)后12～24周，可見絲素蛋白支架與周圍組織輕度粘連，易于分離。6周～24周內(nèi)支架材料體積及外形無明顯變化(見圖2(a))。

SF2: 術(shù)后6周，SF2與周圍組織粘連，表面組織較易分離。第12周開始發(fā)現(xiàn)材料體積變小約15%，部分降解，與周圍新生組織難以分離。隨著時間延長，材料厚度逐漸變薄，與周圍組織粘連更加緊密，24周時絲素蛋白支架直徑無明顯變化，厚度縮小約40%(見圖2(b))。

SF3: 術(shù)后6周，SF-3與周圍組織難以分離，體積較植入前變小。12周時，材料與周圍組織分離困難，材料直徑無明顯變化，體積縮小約50%。24周時，組織生長進入材料內(nèi)部，很難找到成形材料存在(見圖2(c))。

總體上SF1在24周內(nèi)降解十分緩慢或基本不能降解；SF2降解較緩慢，24周時厚度縮小約40%；SF3降解較快，12周厚度減少約50%，24周時支架基本崩解。

圖2 植入3種支架術(shù)后大體觀察像(每行從左至右分別為12、18、24周時照片)。 (a) SF1; (b) SF2; (c) SF3Fig.2 Images of 3 silk fibroin scaffolds postoperative 12, 18 and 24 weeks (from left to right each line). (a) SF1; (b) SF 2; (c) SF 3

2.3 HE染色

SF1: 術(shù)后第6周取材，SF-1材料表面可見巨噬細胞及較多中性粒細胞浸潤。隨著時間延長，炎癥細胞逐漸減少，成纖維細胞逐漸增多。在整個降解過程中絲素蛋白支架嗜伊紅染色，材料與周圍組織界限清楚，內(nèi)部未見組織細胞長入，材料結(jié)構(gòu)變化不大(見圖3(a))。

SF2：術(shù)后6周可見成纖維細胞粘附在絲素蛋白材料表面生長，周圍組織呈增生性改變，可見炎性細胞浸潤，偶可見新生血管形成，周圍組織未見壞死征象。術(shù)后12周可見組織細胞逐漸長入材料，18周后邊界材料出現(xiàn)明顯崩解現(xiàn)象，24周可見成熟血管長入材料(見圖3(b))。

SF3：術(shù)后6周材料內(nèi)部分區(qū)域嗜伊紅染色消失，支架結(jié)構(gòu)有崩解現(xiàn)象，炎癥細胞明顯減少，可見較多血管及成纖維細胞，成纖維細胞等組織細胞逐漸深入材料內(nèi)部生長。術(shù)后12周見較多成熟血管及成纖維細胞，材料邊緣支架結(jié)構(gòu)崩解現(xiàn)象較前明顯，出現(xiàn)較大孔隙，但材料內(nèi)部變化不大，組織細胞進一步長入材料，組織增生現(xiàn)象仍較明顯。術(shù)后18周與12周所見基本相同，組織細胞進一步長入材料。術(shù)后24周絲素支架基本崩解，組織細胞與殘存材料共存，鏡下界限不明確(見圖3(c))。

圖3 植入3種支架后HE染色圖像(每行從左至右分別為6、12、18、24周時照片，左起第1列400×，其余為200×; S-絲素蛋白支架, *-巨噬細胞; ★-血管)。 (a) SF1; (b) SF2; (c) SF3Fig.3 Images of HE staining for 3 silk fibroin scaffolds postoperative 6, 12, 18 and 24 weeks (From left to right each line, first column left 400×, others 200×; S- silk fibroin scaffolds, *- macrophages; ★- blood vessel). (a) SF 1; (b) SF 2; (c) SF 3

2.4 Masson染色

SF1：術(shù)后6周、12周、18周時，材料與周圍組織無明顯粘連，可見膠原纖維與絲素材料界限較清楚，未見明顯包繞、長入。術(shù)后24周見膠原纖維包繞材料，但未長入材料(見圖4(a))。

SF2：術(shù)后6周材料周圍見膠原纖維包繞，未見明顯長入。術(shù)后12周，膠原纖維長入材料，邊界模糊。隨著時間延長，血管與膠原纖維逐漸由絲素蛋白支架周圍向內(nèi)部生長(見圖4(b))。

SF3：術(shù)后6周見較多膠原纖維、新生血管長入材料。12周時可見成熟血管及膠原纖維進一步長入。18周時見膠原纖維侵入材料深部，分區(qū)包繞材料。24周見大量膠原纖維分區(qū)包繞殘余材料，正常材料結(jié)構(gòu)基本消失(見圖4(c))。

圖4 植入3種支架后Masson染色圖像(每行從左至右分別為6、12、18、24周時照片, 400×; CF-膠原; ★-血管)。 (a) SF1; (b) SF2; (c) SF3Fig.4 Images of Masson staining for 3 silk fibroin scaffolds postoperative 6, 12, 18 and 24 weeks(From left to right each line, 400×; CF- collagen; ★- blood vessel). (a) SF1; (b) SF2; (c) SF3

3 討論

天然蠶絲作為手術(shù)縫線已有超過100年的歷史，其主要成分絲素蛋白作為一種天然高分子材料，因其固有的低免疫原性、良好的生物相容性、緩慢的降解速度和特有的理化性質(zhì)在組織工程研究中備受關(guān)注。

具備良好的生物相容性是作為組織工程或組織誘導支架的一個必要前提，生物材料的降解性能同樣至關(guān)重要，材料的降解速率必須與組織的再生速率相匹配，并且滿足組織的功能需求。因此，需要弄清絲素蛋白材料的生物可降解程度、降解機理及影響其降解速度的因素。

絲素蛋白在體內(nèi)降解并非單一機理，而是一個復雜的生物物理、生物化學協(xié)同作用、相互促進的過程。多孔絲素的降解行為與材料制備工藝、孔徑、絲素蛋白的濃度、材料表面粗糙度、結(jié)晶度，材料植入部位、周圍受力情況密切相關(guān)[15-16]。體外研究顯示，多種蛋白酶如彈性蛋白酶、放線菌蛋白酶、膠原蛋白酶等對絲素蛋白材料具有降解作用[17-18]。生物體內(nèi)環(huán)境復雜，通過活體實驗?zāi)軌蛑苯?、準確地了解材料在動物體內(nèi)的降解行為及機體對材料的組織學反應(yīng)。本實驗中3種絲素蛋白支架的差別主要是孔徑不同，通過觀察不同孔徑絲素蛋白支架體內(nèi)降解過程，為我們了解材料結(jié)構(gòu)特性對絲素蛋白體內(nèi)降解的影響提供幫助。

在形貌特征方面，絲素蛋白具有的疏松多孔結(jié)構(gòu)有利于細胞黏附[19]。本實驗制備的材料具有疏松多孔結(jié)構(gòu)，3種絲素蛋白支架的平均孔徑分別為20、100、200 μm，孔隙率均在85%以上。絲素蛋白屬于天然可降解生物活性材料，通過觀察上述3種不同孔徑絲素蛋白支架在體內(nèi)降解速率，孔徑最小的SF1植入SD大鼠皮下24周基本沒有降解，孔徑較大的SF2植入24周后材料降解約40%，孔徑最大的SF3植入24周后基本崩解。因此，孔徑較大的SF3、SF2較孔徑小的SF1降解速率明顯加快，這種體內(nèi)降解速率的差異是由孔徑不同造成的。我們考慮大孔徑、高孔隙率一方面能夠降低了植入材料密度，另一方面提高了支架材料與細胞的接觸面積，有利于細胞黏附生長進入支架內(nèi)部，有利于營養(yǎng)物質(zhì)進入及代謝產(chǎn)物排出。

我們在取材時發(fā)現(xiàn)，6周時植入物周圍炎癥反應(yīng)已不明顯，且材料表面有半透明纖維膜包裹。3種絲素蛋白支架降解速率明顯不同，隨著材料的降解，周圍組織逐漸長入支架內(nèi)部，難以分離。HE染色發(fā)現(xiàn)絲素蛋白嗜伊紅染色，植入初期材料表面可見炎性細胞聚集及成纖維細胞緊貼材料的不規(guī)則表面沿腔隙向內(nèi)部生長，后期炎性細胞明顯減少，血管及成纖維組織逐漸向材料內(nèi)部生長，大孔徑材料結(jié)構(gòu)逐漸崩解，形態(tài)不規(guī)整。Masson染色可見降解較快的SF2與SF3被大量膠原纖維長入、包繞，降解較慢的SF1未見膠原纖維長入。實驗結(jié)果提示，絲素蛋白在體內(nèi)的降解，早期主要與宿主的炎性細胞聚集有關(guān)，而后期似與成纖維細胞有關(guān)，炎性細胞中的巨噬細胞與生物材料在體內(nèi)的降解有關(guān)。

4 結(jié)論

綜上所述，絲素蛋白支架具有良好的組織相容性，孔徑大小對絲素材料降解有明顯相關(guān)性，提示可通過改變絲素蛋白支架的孔徑有效干預(yù)其在生物體內(nèi)的降解速率以匹配不同組織修復的要求。但是，根據(jù)不同部位組織修復的特點，除了考慮支架材料降解與局部組織修復速度相匹配這一因素外，對支架材料在不同時間點的機械強度也有相應(yīng)要求，因此實現(xiàn)絲素蛋白的降解與其功能發(fā)揮的同步仍需進一步研究。

[1] Khademhosseini A, Vacanti JP, Langer R. Progress in tissue engineering [J]. Sci Am, 2009, 300(5): 64-71.

[2] Navone SE, Pascucci L, Dossena M, et al. Decellularized silk fibroin scaffold primed with adipose mesenchymal stromal cells improves wound healing in diabetic mice. [J]. Stem Cell Res Ther, 2014, 5(7): 2-15.

[3] Morita Y, Tomita N, Aoki H, et al. Frictional properties of regenerated cartilage in vitro [J]. J Biomech, 2006, 39(1): 103-109.

[4] Byette F, Bouchard F, Pellerin C, et al. Cell-culture com-patible silk fibroin scaffolds concomitantly patt erned by freezing conditions and salt concentration [J]. Polym Bull, 2011,67(1): 159-175.

[5] Yang Y, Chen X, Ding F, et al. Biocompatibility evaluation of silk fibroin with peripheral nerve tissues and cells in vitro [J]. Biomaterials, 2007, 28(9): 1643-1652.

[6] Mandal BB, Kundu SC. Osteogenic and adipogenic differentiation of rat bone marrow cells on non-mulberry and mulberry silk gland fibroin 3D scaffolds [J]. Biomaterials, 2009, 30(28): 5019-5030.

[7] Shangkai C, Naohide T, Koji Y, et al. Transplantation of allogeneic chondrocytes cultured in fibroin sponge and stirring chamber to promote cartilage regeneration [J]. Tissue Eng, 2007, 13(3): 483-492.

[8] Lovett M. Silk fibroin microtubes for blood vessel engineering [J]. Biomaterials, 2007, 28(35): 5271-5279.

[9] 焦微，趙霞，陸艷，等. 許旺細胞在不同孔徑絲素蛋白支架上的生長[J]. 中國組織工程研究與臨床康復, 2011, 15(25): 4607-4610.

[10] 唐鳴，趙霞，陳新，等 多孔絲素蛋白支架修復兔下頜骨臨界性骨缺損[J]. 中國組織工程研究與臨床康復, 2013, 17(8): 1337-1343.

[11] Vepari C, Kaplan DL. Silk as a biomaterial [J]. Progress in Polymer Science, 2007, 32(8-9): 991-1007.

[12] Wang Y1, Rudym DD, Walsh A, et al. In vivo degradation of three-dimensional silk fibroin scaffolds [J]. Biomaterials, 2008, 29(24-25): 3415-3428.

[13] Yumin Yang, Yahong Zhao, Yun Gu, et al. Degradation behaviors of nerve guidance conduits made up of silk fibroin in vitro and in vivo [J]. Polymer Degradation and Stability, 2009, 94(12): 2213-2220.

[14] GB/T 16886.6-1997/IS010993-6:1994, 醫(yī)療器械生物學評價 第6部分;植入后局部反應(yīng)試驗[S].

[15] Cao Y, Wang B. Biodegradation of silk biomaterials [J]. Int J Mol Sci, 2009, 10(4): 1514-1524.

[16] Wang Y, Rudym DD, Walsh, A. et al. In vivo degradation of three-dimensional silk fibroin scaffolds[J]. Biomaterials, 2008, 29(24-25): 3415-3428.

[17] Numata K, Cebe P, Kaplan DL.Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals. [J]. Biomaterials, 2010,3(1): 2926-2933.

[18] Horan RL, Antle K, Collette AL, et al. In vitro degradation of silk fibroin [J]. Biomaterials, 2005, 26(17): 3385-3393.

[19] Woolfson DN, Ryadnov MG. Peptide-based fibrous biomaterials: Some things old, new and borrowed [J]. Curr Opin Chem Biol, 2006, 10(6): 559-567.

Degradation Behaviors of Silk Fibroin Scaffolds with Different Pore Sizesinvivo

Qian Jianfeng1, 3Cai Lihui1Qi Weidong1*Zhao Xia1Chen Xin2

1(DepartmentofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery,HuashanHospitalFudanUniversity,Shanghai200040,China)2(StateKeyLaboratoryofMolecularEngineeringofPolymers,CollaborativeInnovationCenterofPolymersandPolymerCompositeMaterials,DepartmentofMacromolecularScience,LaboratoryofAdvancedMaterials,FudanUniversity,Shanghai200433,China)3(DepartmentofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery,ZhengzhouPeople′sHospital,Zhengzhou450012,China)

silk fibroin; scaffolds; tissue engineering; degradation

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 04.018

2015-06-28， 錄用日期:2016-04-15

國家自然科學基金項目(81271094)

R318

D

0258-8021(2016) 04-0507-05

*通信作者(Corresponding author)， E-mail:drqiweidong@126.com