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        一類申報新藥雷騰舒工作對照品核磁共振定量分析方法的建立

        2016-02-22 10:30:59賈國慧呼海濤
        上海醫(yī)藥 2016年1期

        賈國慧++呼海濤

        摘要 目的:建立一類申報新藥雷騰舒工作對照品的核磁共振定量方法。方法:以咖啡因為內(nèi)標,采用核磁共振定量法對雷騰舒樣品進行定量。結(jié)果:本方法三個不同濃度水平的樣品平均回收率為99.87%,RSD0.76%。重復(fù)性考察RSD為0.53%。日間精密度考察RSD為0.20%。結(jié)論:所建立的核磁共振定量方法,簡便、快速、準確性、重復(fù)性好,可作為該新藥工作對照品定量的方法之一。

        關(guān)鍵詞 核磁共振定量法 雷騰舒 工作對照品賦值

        中圖分類號:TQ460.72; 0657.2

        文獻標識碼:A

        文章編號:1006-1533(2016)01-0072-03

        隨著我國新藥研究的發(fā)展,企業(yè)研發(fā)人員需要為開發(fā)的新藥制備工作對照品并進行定量的情況越來越多。為確保定量的可靠性,往往需要用多種不同原理來建立定量方法。通過不同方法所測數(shù)據(jù)的差異,對工作對照品定量的準確性與可靠性進行確認。常用的方法豐要包括色譜扣除法(質(zhì)量平衡法)和容量分析方法等,然而對于有些沒什么滴定活性基團的化合物,往往很難找到合適的容量分析方法。

        本研究為擬申報化學(xué)11類新藥雷騰舒(研發(fā)代號T8,目前已在II期臨床評價階段,圖1)藥學(xué)研究中的一部分,按照新藥研究指導(dǎo)原則,須采用不同原理的方法對其工作對照品進行定量(賦值)研究。在我們完成質(zhì)量平衡法評估后,希望采用經(jīng)典的容量分析方法進行比對研究。然而通過對本品結(jié)構(gòu)、性質(zhì)的深入分析,發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)中存在的3類可能的可滴定基團(環(huán)氧基、羥基、內(nèi)酯環(huán))都很難設(shè)計量化方案。分析如下。

        ①環(huán)氧基結(jié)構(gòu)中存在的三個環(huán)氧結(jié)構(gòu)單元,各自的化學(xué)環(huán)境不盡相同,難以量化反應(yīng)程度。②羥基結(jié)構(gòu)中有兩個羥基,一個為二級羥基、另一個為三級羥基。二級羥基雖可通過與醋酐反應(yīng)?;?,用堿滴定牛成的醋酸,從而完成定量,但前提是須確保?;耆?。即使可以酰化完全,醋酐也很容易使三級羥基脫水,從而干擾定量結(jié)果。③內(nèi)酯環(huán)該基團理論上可與堿反應(yīng),先加成再脫去-OR,但因本品內(nèi)酯環(huán)上同時存在雙鍵,會導(dǎo)致1、2加成與l、4加成同時存在,很難量化。預(yù)試驗結(jié)果也證實了上述分析。

        面對上述問題,如何選擇更加便捷、可靠的賦值方法成為我們在新藥申報中必須考慮的問題。通過調(diào)研,我們發(fā)現(xiàn)采用已知含量的其他化合物做內(nèi)標的定量核磁方法可以很好地解決我們所面臨的問題。方法具有專屬性好、無需已知含量自身對照品的技術(shù)特點。

        為了建立并驗證該方法在新藥一雷滕舒樣品定量上的可行性,我們對該方法進行了研究,并獲得了準確性、重復(fù)性良好的結(jié)果。

        1 材料與方法

        1.1 儀器

        核磁共振儀(德國布魯克,Ascend 400)。天平(瑞士梅特勒,XP56,百萬分之一)。

        1.2 試藥

        雷騰舒(本公司自制,批號:235-61、20080102);咖啡因(Alfa公司,含量99.6%);氘代乙腈、氘代吡啶(J&K Scientific Ltd.);氘代二甲亞砜(Cambridge Isotope Laboratories. Inc.)。

        1.3 樣品制備與計算

        精密稱定咖啡因(約4mg)及本品(約6mg)適量至2ml量瓶,以氘代乙腈溶解并定容至刻度,搖勻,取約0.5ml到核磁管,上樣測定。分別記錄化學(xué)位移值為3.345、3.358組峰(T8)的面積和化學(xué)位移值為3.274峰(咖啡因)的峰面積,按下述公式計算。

        A1/A2=n1W1/M1/(n2W2/M2

        其中A1為T8定量峰的面積、A2為內(nèi)標咖啡因定量峰的面積;

        n1為T8定量峰氫質(zhì)子數(shù)(n1=1),n2為咖啡因定量峰氫質(zhì)子數(shù)(n2=3);

        W1為T8測定量,W2為咖啡因稱樣量,M1、M2分別為T8、咖啡因的分子量。

        1.4 核磁共振儀條件設(shè)置

        核磁共振儀:2930序列,共振頻率400兆赫,磁場強度9.4T,弛豫時間12s,中心頻率3.31ppm。

        2 結(jié)果

        2.1 方法的重復(fù)性

        采用本法對經(jīng)干燥的T8樣品(批號:235-61)平行測定5次,考察方法的重復(fù)性(表1)。結(jié)果表明,RSD小于2,方法重復(fù)性很好。

        2.2 方法的重現(xiàn)性

        為了考察方法的重現(xiàn)性,我們在不同日期,對上述T8樣品進行了測定,經(jīng)計算方法重現(xiàn)性好(表2)。

        2.3 方法的準確度

        采用上述方法,對方法準確度進行考察。取經(jīng)干燥的T8原料(批號:235-61)4、6、8mg,精密稱定,分別置于2ml量瓶中,再分別加入精密稱定的4mg咖啡因,用氘代乙腈溶解并稀釋至刻度,搖勻,吸取0.5ml至核磁管中,測定。從平均回收率和RSD值可見該方法準確度非常好(表3)。

        2.4 與質(zhì)量平衡法數(shù)據(jù)的比較

        采用本法和質(zhì)量平衡法分別檢測了批號為20080102的T8樣品。本法測定結(jié)果:99.20%、質(zhì)量平衡法測定結(jié)果:99.56%。兩種方法測定結(jié)果基本一致。

        3 討論

        工作對照品定量(賦值)是研發(fā)工作中經(jīng)常遇到的問題。在追求真值的過程中,需要多種分析于段協(xié)同作用,綜合判斷。采用核磁共振儀進行定量,提供了不同原理定量的義一方法。該方法的定量研究,國內(nèi)外已有報道,其工作原理也在多國藥典上有詳述,但在新藥附值研究的實際應(yīng)用方面報道不多。

        我們在方法建立過程中發(fā)現(xiàn),內(nèi)標選擇、樣品前處理、儀器參數(shù)設(shè)置等因素,都會對檢測結(jié)果產(chǎn)牛影響,須關(guān)注。

        以本研究為例,我們篩選了多個化合物,最終選定了咖啡因(圖1)作為內(nèi)標物。因為咖啡因結(jié)構(gòu)中氫的磁場環(huán)境比較簡單,可找到與本研究被測物峰位不干擾且場位比較接近的測量峰;另外,經(jīng)考察,咖啡因在我們選定的溶解樣品的溶劑氘代乙腈中非常穩(wěn)定而且不會與被測物反應(yīng)。這些特點保障了測定結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

        新藥賦值研究中,節(jié)約樣品和選擇合適的溶解樣品的溶劑也是我們方法設(shè)計中不得不考慮的問題。為篩選到樣品溶解度高、穩(wěn)定性好、且對測定無干擾的溶劑,我們分別考察了氘代二甲亞砜、氘代吡啶、氘代乙腈三種溶劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn),氘代二甲亞砜為溶劑,雖然可滿足溶解度高、溶劑干擾少、樣品穩(wěn)定性好等要求,但重復(fù)性、線性結(jié)果不穩(wěn)定,無法達到預(yù)期的定量要求。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),為節(jié)省樣品與氘代試劑,我們在試驗方案中選用了1ml量瓶進行定容,由于氘代二甲亞砜黏度大,容易導(dǎo)致定量誤差,使測定結(jié)果重現(xiàn)性不好。為此,我們換用氘代吡啶作為溶解溶劑對方法進行考察,發(fā)現(xiàn)T8在氘代吡啶中不穩(wěn)定,放置后溶液顏色會發(fā)牛變化,測定結(jié)果可靠性差。通過這兩次溶解溶劑對測定結(jié)果的影響,我們重新分析了T8的溶解度、穩(wěn)定性,最終選擇氘代乙腈為溶劑,獲得了比較理想的結(jié)果。

        此外,儀器的參數(shù)設(shè)置,也是影響數(shù)據(jù)穩(wěn)定性的重要因素,特別是中心頻率、弛豫時間、掃描次數(shù)的設(shè)定。合適的中心頻率(參數(shù)OI)的選擇,可使脈沖對各定量峰強度的影響差異最小。另外,須考察弛豫時間、掃描次數(shù)對外加標準和待測物響應(yīng)穩(wěn)定性的影響,以確定最佳參數(shù)。

        綜上,在新藥開發(fā)過程中無法獲得標準品對照的情況下,采用核磁定量法對企業(yè)自制工作對照品進行純度分析與賦值,是不同原理進行純度評估的新選擇。其優(yōu)點除簡單、快捷之外,還具有不需要已知含量待測樣品的對照品,僅需要已知含量的普通化學(xué)品的特點。這很好地解決了新藥工作對照品賦值研究中無對照品的問題,且測定數(shù)據(jù)可靠性好。

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