劉艷利，申　靜，支麗慧，李世召，姚軍虎，楊小軍

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100)

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葉酸調(diào)控雞脾和胸腺IGF2表達(dá)的表觀遺傳機(jī)制探究

劉艷利，申靜，支麗慧，李世召，姚軍虎，楊小軍*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100)

摘要：本試驗(yàn)旨在研究胚期注射葉酸對(duì)肉雞脾和胸腺中IGF2基因表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探究其調(diào)控基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。選擇重量和大小相近的種蛋360枚，隨機(jī)分為4組，在孵化期第11天(E11)分別注射0(對(duì)照)、50、100和150 μg的葉酸。每個(gè)處理選取體重相近的48只1日齡雛雞，隨機(jī)分為6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8只雞，在飼養(yǎng)的第21和42天取胸腺和脾組織。用RT-PCR方法檢測(cè)組織中IGF2的相對(duì)表達(dá)量；重亞硫酸鹽修飾克隆測(cè)序法(BSP)檢測(cè)IGF2啟動(dòng)子區(qū)域(-648/-479 bp)甲基化水平；DNase I-qPCR方法檢測(cè)IGF2啟動(dòng)子區(qū)域(-847/-616 bp)染色質(zhì)構(gòu)象。結(jié)果表明，胚期注射100和150 μg葉酸顯著提高了受精蛋孵化率(P<0.05)；胚期注射150 μg葉酸顯著提高了42日齡脾中IGF2的表達(dá)量(P<0.05)、降低了42日齡脾中該基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平(P<0.05)，并且也顯著增加了42日齡脾中IGF2啟動(dòng)子區(qū)的染色質(zhì)可接近度(P<0.05)；然而在21日齡時(shí)各葉酸處理組對(duì)脾中IGF2的表達(dá)均無(wú)顯著影響(P>0.05)。與脾組織不同，150 μg葉酸處理組顯著提高了21日齡胸腺中IGF2的表達(dá)(P<0.05)，對(duì)42日齡胸腺中該基因的表達(dá)卻沒(méi)有顯著影響(P>0.05)，并且與對(duì)照組相比，150 μg葉酸處理組中21日齡胸腺組織IGF2啟動(dòng)子區(qū)的染色質(zhì)可接近度也顯著增加(P<0.05)。由此可見(jiàn)，在種蛋孵化第11天注射葉酸可通過(guò)影響基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平和染色質(zhì)構(gòu)象來(lái)調(diào)控組織中IGF2的表達(dá)，并且存在組織器官和時(shí)間特異性。

關(guān)鍵詞：葉酸；IGF2；甲基化；染色質(zhì)構(gòu)象；表觀遺傳

胰島素樣生長(zhǎng)因子2(Insulin-like growth factor 2，IGF2)基因位于雞第5號(hào)染色體，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，其編碼的蛋白是一種促有絲分裂多肽，與胰島素具有相似的結(jié)構(gòu)，對(duì)機(jī)體正常的生長(zhǎng)發(fā)育，尤其是在調(diào)控胚胎發(fā)育上具有重要作用，也是一種胚胎生長(zhǎng)因子[1-2]。許多在家禽上的研究均報(bào)道IGF2參與機(jī)體DNA和蛋白合成，在體內(nèi)葡萄糖、能量甚至是脂質(zhì)代謝中具有重要作用[3-4]，并且作為在選育過(guò)程中的一個(gè)候選基因，其與家禽的一些生產(chǎn)性狀例如肌肉及骨骼生長(zhǎng)和腹脂率等存在一定的相關(guān)性[5-9]。然而關(guān)于IGF2在家禽中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制卻鮮有報(bào)道。

近年來(lái)，隨著表觀遺傳學(xué)的提出，葉酸因具有攜帶活性甲基集團(tuán)的功能，作為一碳單位代謝中重要的輔酶因子，有關(guān)其影響DNA甲基化的報(bào)道也越來(lái)越多。有研究報(bào)道，在妊娠和哺乳期給母鼠飼喂低葉酸含量的日糧，小鼠長(zhǎng)大后其小腸組織中表現(xiàn)出全基因組DNA的低甲基化[10]。然而在斷奶后，給小鼠飼喂葉酸含量高的日糧，在結(jié)腸和直腸組織中依然發(fā)現(xiàn)DNA低甲基化狀態(tài)[11]。人類大量的流行病學(xué)中也涉及到葉酸與DNA甲基化之間的關(guān)聯(lián)，在結(jié)腸癌的患者中，葉酸促進(jìn)了血清全基因組DNA的高甲基化[12]。通過(guò)限制絕經(jīng)女性飲食中的葉酸含量，其白血球中的DNA出現(xiàn)低甲基化現(xiàn)象，并且有一定的劑量依賴效應(yīng)[13]。體外培養(yǎng)雞脂肪前體細(xì)胞，探究葉酸如何影響家禽脂肪生成基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的試驗(yàn)結(jié)果表明，未添加葉酸的試驗(yàn)組中，C/EBPα基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平比添加16 mg·L-1的葉酸組降低21.8%，但PPAR基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化在各試驗(yàn)組中并沒(méi)有受到影響[14]。

家禽作為卵生動(dòng)物，其孵化過(guò)程中胚胎發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)素和能量不能像哺乳動(dòng)物那樣來(lái)源于母體，均依賴于雞蛋中所積累的物質(zhì)，因此鑒于家禽胚胎發(fā)育的特殊性和IGF2在機(jī)體組織生長(zhǎng)發(fā)育和物質(zhì)代謝中的重要性，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期工作[15]，本試驗(yàn)通過(guò)在孵化期11胚齡注射不同劑量的葉酸，旨在以研究胚期注射葉酸能否影響肉雞脾和胸腺中IGF2基因的表達(dá)為依據(jù)，探討胚期營(yíng)養(yǎng)調(diào)控基因表達(dá)的分子機(jī)制，為家禽營(yíng)養(yǎng)表觀遺傳學(xué)研究建立基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取重量和大小相近的科寶500肉雞商品代種蛋360枚，隨機(jī)分為4個(gè)處理組并進(jìn)行孵化。在孵化的第11天(E11)，向4個(gè)處理組種蛋的卵黃囊分別注射葉酸0、50、100和150 μg。葉酸溶液提前配制為相應(yīng)的濃度，0 μg對(duì)照組注射的是生理鹽水，每個(gè)處理組注射體積均為0.1 mL。待出殼后，每個(gè)處理選取體重相近的48只小雞，隨機(jī)分為6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8只雞。飼養(yǎng)期為42 d。

1.2受精蛋孵化率統(tǒng)計(jì)

種蛋孵化期間通過(guò)照蛋去除未受精蛋，記錄每個(gè)處理組去除的蛋數(shù)，待孵化期過(guò)后根據(jù)每組的出殼數(shù)計(jì)算受精蛋孵化率：受精蛋孵化率=出殼數(shù)/受精蛋數(shù)×100%。

1.3樣品采集

飼養(yǎng)的第21和第42天，在每個(gè)處理的每個(gè)重復(fù)中挑選1只與所在重復(fù)平均體重相近的雞只進(jìn)行屠宰，收集脾和胸腺組織，立即放入液氮，隨后轉(zhuǎn)至-80 ℃保存待用。

1.4主要試劑和儀器

葉酸標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白酶K購(gòu)自Sigma公司；組織RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR試劑盒和pMDTM19-T Vector購(gòu)自TaKaRa公司；EZ DNA Methylation-GoldTM試劑盒購(gòu)自美國(guó)Zymo公司；組織DNA提取試劑盒和DNA純化膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；細(xì)胞核提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DNase Ⅰ和PCR純化試劑盒購(gòu)自Thermo公司。

核酸定量分析儀(Nanodrop ND-1000)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(iQ5，Bio-Rad 公司)；離心機(jī)(Eppendorf)；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱；恒溫?fù)u床。

1.5RT-PCR檢測(cè)IGF2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平

脾與肝中RNA的提取以及RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的過(guò)程均參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)使用TaKaRa 公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，選用β-actin作為內(nèi)參基因?；虻囊镄蛄腥缦?5′-3′)：β-actin上游ATTGTCCACCGCAAATGCTTC，β-actin下游AAATAA-AGCCATGCCAATCTCGTC；IGF2上游AGACC-AGTGGGACGAAATAACA，IGF2下游CACGC-TCTGACTTGACGGAC。RT-PCR的反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算組織中IGF2的相對(duì)表達(dá)量[16]。

1.6BSP(Bisulfite sequencing PCR)克隆測(cè)序法檢測(cè)IGF2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平

組織基因組DNA的提取按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，每個(gè)處理的6個(gè)DNA樣品兩兩隨機(jī)等量混合成為3個(gè)樣品。隨后450 ng的DNA被用來(lái)進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，具體操作參照EZ DNA Methylation-GoldTM試劑盒說(shuō)明流程。被修飾的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳跑膠進(jìn)行目的片段DNA的回收，目的產(chǎn)物純化后進(jìn)行pMDTM19-T Vector克隆，每個(gè)樣品的克隆至少選取20個(gè)陽(yáng)性菌落測(cè)序，用來(lái)檢測(cè)IGF2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-648～-479 bp啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平。具體試驗(yàn)流程參照V.P.Kovacheva等的方法[17]。BSP中PCR引物用Methprimer軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)(http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)，序列如下(5′-3′)：上游TGGTTGTGTTGTAGATTTTT-TTTGT，下游ACACTAAATTTCACCTCCCAT-TTT。檢測(cè)甲基化的區(qū)域包含4個(gè)CpG位點(diǎn)，測(cè)序后最終每個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平用在線的QUMA軟件分析(http：//quma.cdb.riken.jp/)，每個(gè)樣品選取13個(gè)轉(zhuǎn)化率在95%以上的克隆參與結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

1.7DNaseⅠ-qPCR檢測(cè)IGF2啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)疏松度

參照細(xì)胞核試劑盒說(shuō)明書提取組織細(xì)胞核，細(xì)胞核的DNase I酶切消化參照前人的研究流程[18-20]。消化體系中的DNA用試劑盒進(jìn)行純化回收后用于PCR擴(kuò)增，檢測(cè)IGF2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-847 ～-616 bp啟動(dòng)子區(qū)域的染色質(zhì)疏松度，所用引物序列如下(5′-3′)：上游CAGGTGGTGCTGCGATGAC，下游CGGAGATGGAGCCGAAGC。PCR擴(kuò)增后，經(jīng)過(guò)DNase I酶切消化的樣品的Ct值記為Ct (DNase+)，每個(gè)樣品所設(shè)的與之對(duì)應(yīng)的未經(jīng)過(guò)酶消化的Ct值記為Ct (DNase-)，染色質(zhì)的疏松度用ΔCt=Ct (DNase+)-Ct (DNase-)表示。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)結(jié)果除了孵化率采用卡方檢驗(yàn)外，其他均采用One-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)均設(shè)置為P<0.05。

2結(jié)果

2.1胚期注射葉酸對(duì)受精蛋孵化率的影響

孵化期11胚齡注射葉酸對(duì)受精蛋孵化率的影響見(jiàn)表1，與對(duì)照組相比，50 μg葉酸注射組并沒(méi)有顯著影響受精蛋孵化率(P>0.05)，但100和150 μg葉酸組顯著提高了受精蛋孵化率(P<0.05)。

2.2胚期注射葉酸對(duì)雞脾和胸腺中IGF2表達(dá)的影響

孵化期11胚齡注射不同濃度葉酸后，各處理組21和42日齡雞脾與胸腺中IGF2表達(dá)量的分析如圖1和圖2所示，胚期不同的葉酸注射水平對(duì)21日齡脾和42日齡胸腺中IGF2的表達(dá)均無(wú)顯著影響(P>0.05)。但與對(duì)照組相比，150 μg葉酸注射組顯著提高了42日齡脾和21日齡胸腺組織中IGF2的表達(dá)(P<0.05)。

2.3胚期注射葉酸對(duì)IGF2啟動(dòng)子區(qū)(-648/-479 bp)DNA甲基化的影響

如圖3和圖4所示，注射不同濃度的葉酸對(duì)21日齡脾中IGF2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平?jīng)]有影響(P>0.05)。在42日齡，50和150 μg葉酸注射組脾中IGF2啟動(dòng)區(qū)甲基化水平顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組(28.8%)相比，150 μg葉酸注射組(18.6%)甲基化水平降低了35.4%。胚期注射葉酸對(duì)胸腺IGF2啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響見(jiàn)圖5和圖6，與脾組織不同，孵化期第11天100和150 μg葉酸的注射顯著增加了21日齡胸腺IGF2啟動(dòng)子區(qū)的甲基化(P<0.05)，但所有葉酸處理組對(duì)42日齡基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化均沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。

表1胚期注射葉酸對(duì)種蛋孵化率的影響

Table 1Effects of folic acid injected on E11 on the hatchability of fertilized eggs

同列內(nèi)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Different letters in the same column mean significant difference (P<0.05)

2.4胚期注射葉酸對(duì)IGF2啟動(dòng)子區(qū)(-847/-616 bp)染色質(zhì)構(gòu)象的影響

孵化期注射葉酸對(duì)脾中IGF2啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)可接近度的影響如圖7所示，150 μg葉酸注射組顯著增加了42日齡脾中該基因啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)的可接近度(P<0.05)，而50和100 μg葉酸注射組對(duì)其并沒(méi)有顯著影響(P>0.05)；與對(duì)照組相比，21日齡3個(gè)葉酸注射組脾中IGF2啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)構(gòu)象均沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。由圖8可知，僅150 μg葉酸注射組顯著增加了21日齡胸腺IGF2啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)可接近度(P<0.05)，各葉酸處理組對(duì)42日齡胸腺該基因啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)構(gòu)象均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

2.5IGF2啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

采用在線軟件(http：//www.genomatix.de)對(duì)本試驗(yàn)所涉及的IGF2啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖9所示，圖9A預(yù)測(cè)的區(qū)域包含本試驗(yàn)所檢測(cè)的4個(gè)CpG位點(diǎn)，共預(yù)測(cè)出7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。圖9B預(yù)測(cè)的是IGF2啟動(dòng)子染色質(zhì)構(gòu)象所在的區(qū)域，軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示共有39個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。

3討論

李世召等[21]指出，種蛋注射技術(shù)在家禽上已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，很多研究學(xué)者通過(guò)在孵化期注射營(yíng)養(yǎng)素或疫苗來(lái)提高機(jī)體的生產(chǎn)性能和免疫功能。有研究表明，在雞胚孵化期11天注射3 mg維生素C能顯著提高種蛋孵化率[22]，與本試驗(yàn)中注射葉酸提高受精蛋孵化率結(jié)果一致，說(shuō)明注射并沒(méi)有對(duì)雞胚產(chǎn)生危害，并且注射的營(yíng)養(yǎng)素對(duì)孵化率起到積極作用。

本研究結(jié)果表明，孵化期150 μg葉酸的注射提高了42日齡脾中和21日齡胸腺中IGF2的mRNA表達(dá)，雖然沒(méi)有關(guān)于葉酸在家禽上調(diào)控IGF2表達(dá)的報(bào)道，但有研究表明，IGF2在五指山豬8個(gè)組織中的表達(dá)量呈時(shí)序性變化，并且也存在組織差異[23]。因此葉酸在家禽中上調(diào)IGF2的表達(dá)可能也存在時(shí)間和組織的特異性。

目前，基因表達(dá)調(diào)節(jié)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制并不完全明晰，有觀點(diǎn)認(rèn)為基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化能通過(guò)阻礙轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來(lái)抑制基因的表達(dá)[24]。除此之外，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑也參與基因的表達(dá)調(diào)控，啟動(dòng)子區(qū)域染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的疏松度與基因的表達(dá)成正相關(guān)[18]。而葉酸在一碳單位的代謝中扮有重要角色，與甲基集團(tuán)的轉(zhuǎn)移有關(guān)，參與DNA和組蛋白的甲基化過(guò)程。本試驗(yàn)中，150 μg葉酸組顯著降低了42日齡脾中IGF2啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化，并提高了啟動(dòng)子區(qū)域的染色質(zhì)疏松度，與該日齡組織中IGF2表達(dá)的上調(diào)相對(duì)應(yīng)。膽堿與葉酸在一碳單位代謝中具有類似的功能，有研究表明，通過(guò)給孕期母鼠飼喂高膽堿日糧，能夠降低小鼠肝中IGF2基因調(diào)控區(qū)域的甲基化[17]，與本試驗(yàn)中葉酸降低脾IGF2啟動(dòng)子區(qū)甲基化的結(jié)果相似，并且有研究認(rèn)為，CpG的甲基化能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合子來(lái)誘導(dǎo)組蛋白的去乙?；?，進(jìn)而影響染色質(zhì)的重塑來(lái)沉默基因的表達(dá)[25]。通過(guò)對(duì)IGF2啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在本試驗(yàn)中所涉及到的DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象測(cè)定區(qū)域均存在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，表明葉酸有可能通過(guò)改變DNA甲基化來(lái)影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合進(jìn)而調(diào)控IGF2的表達(dá)。

與脾組織不同的是，葉酸對(duì)胸腺IGF2的表達(dá)、基因啟動(dòng)子甲基化以及構(gòu)象的影響均體現(xiàn)在21日齡上，雖然150 μg葉酸組對(duì)21日齡胸腺IGF2的表達(dá)和IGF2啟動(dòng)子染色質(zhì)構(gòu)象的影響與對(duì)42日齡脾組織的影響結(jié)果相同，但對(duì)IGF2啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響結(jié)果卻完全相反。體外培養(yǎng)雞的脂肪前體細(xì)胞研究表明，添加16 mg·L-1葉酸的試驗(yàn)組C/EBPα基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與對(duì)照組相比升高了21.8%[14]，與本試驗(yàn)中葉酸提高21日齡胸腺IGF2啟動(dòng)子區(qū)甲基化的結(jié)果一致，這就表明在21日齡胸腺中，IGF2的表達(dá)雖然受啟動(dòng)子區(qū)甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象的影響，但染色質(zhì)構(gòu)象更占主導(dǎo)地位。

5-甲基四氫葉酸因其結(jié)構(gòu)的特殊性，可攜帶活性甲基集團(tuán)，作為S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成的甲基提供者，通過(guò)對(duì)DNA甲基化作用，改變表觀遺傳，故葉酸參與調(diào)控DNA甲基化已得到普遍共識(shí)[26]。但在不同動(dòng)物、不同細(xì)胞以及不同目的基因中，葉酸對(duì)DNA甲基化的影響結(jié)果卻不盡相同[27-28]。機(jī)體中，SAM合成所需要的甲基也可來(lái)源于其他營(yíng)養(yǎng)素例如膽堿和甜菜堿，并且SAM接收來(lái)自葉酸最終攜帶的甲基基團(tuán)的過(guò)程中也受很多輔酶因素(維生素B2、B6和B12等)的制約[29]，也有研究稱葉酸的添加可能會(huì)打破細(xì)胞內(nèi)一碳單位的代謝[30]。因此，葉酸對(duì)組織IGF2啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響出現(xiàn)不同的結(jié)果可能與日齡以及組織的不同有關(guān)。

除此之外，雖然基因的表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)的甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象有關(guān)，但甲基化與染色質(zhì)構(gòu)象之間的內(nèi)在關(guān)系至今仍沒(méi)有明確定論，有學(xué)者認(rèn)為，甲基化的DNA能夠招募甲基胞嘧啶結(jié)合蛋白2(MeCP2)，此蛋白有一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域(TRD)，它能結(jié)合另一個(gè)抑制子蛋白mSin3A，mSin3A蛋白是包括組蛋白去乙?；冈趦?nèi)的多重蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)中心，能使組蛋白去乙?；?，從而改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象[25]。本試驗(yàn)中，葉酸雖然提高了21日齡胸腺IGF2啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平，但染色質(zhì)疏松度反而升高，故在不同的組織中，葉酸通過(guò)甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象調(diào)控IGF2表達(dá)可能存在不同的機(jī)制，本試驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)到IGF2啟動(dòng)子區(qū)有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的存在，但在家禽上有關(guān)表觀遺傳調(diào)控基因表達(dá)的研究較少，是否葉酸是通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子為中介并連結(jié)DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象來(lái)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄有待將來(lái)進(jìn)一步的深入研究。

4結(jié)論

在雞胚孵化第11天注射葉酸能夠通過(guò)改變IGF2啟動(dòng)子區(qū)甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象來(lái)調(diào)控脾和胸腺中IGF2的表達(dá)，但存在組織和時(shí)間特異性，啟動(dòng)子區(qū)甲基化與染色質(zhì)構(gòu)象改變的內(nèi)在聯(lián)系有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)(References)：

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(編輯郭云雁)

The Study on Epigenetic Mechanism ofIGF2 Expression in Spleen and Thymus Regulated by Folic Acid in Broilers

LIU Yan-li，SHEN Jing，ZHI Li-hui，LI Shi-zhao，YAO Jun-hu，YANG Xiao-jun*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

Key words:folic acid；IGF2；methylation；chromatin structure；epigenetics

Abstract:The study was conducted to investigate the effects of folic acid injected in incubation period onIGF2 expression in spleen and thymus in broilers，further exploring epigenetic mechanism of folic acid modulating gene expression.A total of 360 eggs，whose weight and size were mostly same，were selected and randomly assigned to 4 treatments.0，50，100 and 150 μg folic acid were injected into eggs，respectively on E11 of incubation.After hatching，48 healthy 1-day-old chickens selected from each treatment were divided into 6 replicates and 8 birds each.Spleens and thymus were collected at the age of 21 and 42 d.The mRNA expression ofIGF2 were tested by RT-PCR；BSP was used to determine the methylation level ofIGF2 gene promoter region from -648 to -479 bp and DNase I-qPCR for chromatin structure of theIGF2 promoter from -847 to -616 bp.The results were shown as followed：100 and 150 μg folic acid groups improved hatchability of fertilized eggs(P<0.05)；150 μg folic acid injected on E11 significantly up-regulatedIGF2 expression in spleen (P<0.05) and reduced methylation level of gene promoter at the age of 42 d (P<0.05)；Chromatin accessibility ofIGF2 promoter region was improved in 150 μg folic acid group at the age of 42 d(P<0.05)in spleen.Different from spleen，150 μg folic acid didn’t affectIGF2 expression in thymus at the age of 42 d(P>0.05)but significantly increased gene expression in thymus at the age of 21 d(P<0.05).Compared with the control group，150 μg folic acid improved chromatin accessibility ofIGF2 promoter in thymus at the age of 21 d(P<0.05).Overall，the results indicated that folic acid injected on E11 could affectIGF2 expression in tissues by altering methylation level and chromatin structure of gene promoter，and there exists specificity on organs and time.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.012

收稿日期：2015-04-13

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272464)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才項(xiàng)目(NCET-12-0476)；陜西省農(nóng)業(yè)攻關(guān)計(jì)劃(2014k01-18-02；2015NY149)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2015KTCQ02-19)

作者簡(jiǎn)介：劉艷利(1993- )，女，河南伊川人，碩士生，主要從事畜禽免疫營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與營(yíng)養(yǎng)表觀遺傳調(diào)控相關(guān)研究，E-mail：1085752204@qq.com *通信作者：楊小軍，教授，E-mail：yangxj@nwsuaf.edu.cn

中圖分類號(hào)：S831.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)02-0296-09