何良英，劉蘭平，曾振靈，劉健華

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州510642)

?

攜帶blaCTX-M-65、rmtB和fosA3多重耐藥質(zhì)粒pHN7A8的適應(yīng)性研究

何良英#，劉蘭平#，曾振靈，劉健華*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州510642)

摘要：為分析攜帶blaCTX-M-65、rmtB和fosA3多重耐藥質(zhì)粒pHN7A8的適應(yīng)性代價(jià)，將犬源大腸桿菌7A8的多重耐藥質(zhì)粒pHN7A8轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109中，獲得轉(zhuǎn)化子7A8JT，并采用生長(zhǎng)曲線測(cè)定和競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)方法研究pHN7A8對(duì)宿主菌適應(yīng)性的影響。結(jié)果表明，攜帶pHN7A8的轉(zhuǎn)化子7A8JT和受體菌JM109的生長(zhǎng)曲線相似，但前者對(duì)于后者有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pHN7A8對(duì)宿主菌產(chǎn)生適應(yīng)性代價(jià)。攜帶blaCTX-M-65、rmtB和fosA3的多重耐藥質(zhì)粒pHN7A8能在宿主菌中穩(wěn)定傳代，臨床上應(yīng)警惕大量使用或?yàn)E用抗菌藥物對(duì)其形成的選擇壓力，以防止多重耐藥質(zhì)粒進(jìn)一步擴(kuò)散。

關(guān)鍵詞：16S rRNA甲基化酶；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；多重耐藥質(zhì)粒；適應(yīng)性

近年來，16S rRNA甲基化酶基因和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)基因關(guān)系密切，常被報(bào)道位于同一個(gè)質(zhì)粒上[1]。目前，在獸醫(yī)領(lǐng)域也出現(xiàn)了兩者共同傳播的現(xiàn)象[2-3]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，寵物源和豬源腸桿菌中的rmtB和blaCTX-M傳播主要由IncFⅡ質(zhì)粒介導(dǎo)[4-5]，并發(fā)現(xiàn)新出現(xiàn)的磷霉素修飾酶基因fosA3與rmtB和blaCTX-M-65相連，位于同一質(zhì)粒上[6]，且rmtB與blaCTX-M-65、fosA3等耐藥基因構(gòu)成的多重耐藥(multidrug resistance，MDR)質(zhì)粒已在寵物源及豬源腸桿菌中傳播和擴(kuò)散。本研究對(duì)已進(jìn)行全序列測(cè)定的該類型質(zhì)粒pHN7A8[7]進(jìn)行適應(yīng)性代價(jià)分析，探討其廣泛傳播的成因，為臨床控制多重耐藥質(zhì)粒的傳播和擴(kuò)散提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株及其質(zhì)粒來源

多重耐藥質(zhì)粒pHN7A8來源于大腸桿菌7A8，為本實(shí)驗(yàn)室于2008年分離自寵物犬糞便樣品。常規(guī)質(zhì)粒接合試驗(yàn)和化學(xué)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)均無法獲得pHN7A8單質(zhì)粒接合子或轉(zhuǎn)化子。使用質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN公司)提取質(zhì)粒，經(jīng)電泳切膠純化后采用電轉(zhuǎn)化將目的質(zhì)粒pHN7A8轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌JM109中，獲得轉(zhuǎn)化子7A8JT[6]。采用瓊脂稀釋法分析受體菌、供體菌及轉(zhuǎn)化子的藥物敏感性。標(biāo)準(zhǔn)菌E.coliATCC?25922及工程菌E.coliJM109為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將7A8JT和E.coliJM109劃線培養(yǎng)后，分別挑取單菌落到2 mL空白LB肉湯中，37 ℃ 200 r·min-1過夜培養(yǎng)。分別測(cè)定7A8JT和E.coliJM109的母液OD值，取OD值最接近的母液進(jìn)行下一步試驗(yàn)。從母液中吸取200 μL 接種到含20 mL新鮮LB肉湯的錐形瓶中，37 ℃ 200 r·min-1震蕩培養(yǎng)。每1 h準(zhǔn)確吸取200 μL到96孔板中，平行吸取三次，以空白的LB肉湯作為空白對(duì)照，測(cè)定OD600 nm。

1.3競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)試驗(yàn)

分別挑取7A8JT和E.coliJM109單菌落到4 mL LB肉湯中，37 ℃ 200 r·min-1過夜培養(yǎng)。取OD600 nm值最相近的初始培養(yǎng)物母液，以1∶1的比例均勻混合。取200 μL混合液接種到20 mL空白LB肉湯中(1∶100)，同時(shí)設(shè)6個(gè)平行，設(shè)此時(shí)為競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)0 d。37 ℃ 200 r· min-1震蕩培養(yǎng)24 h后，取混合液200 μL接種到20 mL新鮮空白LB肉湯中(1∶100)。此操作每24 h重復(fù)一次，連續(xù)6 d。吸取已充分混勻的菌懸液200 μL，至含有1 800 μL 0.85%生理鹽水的試管中，此即為10倍稀釋，依次類推。立即向上述盛有不同稀釋倍數(shù)菌液(10-6、10-7、10-8)的平皿中倒入空白培養(yǎng)基或含有100 μg·mL-1阿米卡星的培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，每個(gè)稀釋度設(shè)三個(gè)平行進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)化子及原菌的藥敏結(jié)果

原菌7A8對(duì)多種藥物耐藥，攜帶blaCTX-M-65、rmtB和fosA3的轉(zhuǎn)化子7A8JT對(duì)頭孢噻肟、慶大霉素、阿米卡星、氨芐西林的MIC值比受體菌的分別升高至少256倍、512倍、64倍和32倍。藥敏結(jié)果見表1。

表1轉(zhuǎn)化子及原菌對(duì)抗生素的敏感性

Table 1Susceptibitity of transformant and donor

2.2生長(zhǎng)曲線測(cè)定

以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，以不同時(shí)間點(diǎn)的平均OD600 nm值為縱坐標(biāo)，繪制7A8JT和E.coliJM109生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，7A8JT和E.coliJM109母液的OD600 nm值分別為0.01和0.011，可認(rèn)為兩者母液濃度接近一致。此外，從遲緩期到對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，兩者的OD600 nm值相等或相近，曲線趨于一致，表明7A8JT菌株生長(zhǎng)能力接近于受體菌E.coliJM109。結(jié)果見圖1。

2.3競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)

以采樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，轉(zhuǎn)化子7A8JT和受體菌E.coliJM109的相對(duì)含量為縱坐標(biāo)作圖。結(jié)果顯示，7A8JT和E.coliJM109的母液中，兩者各占一半，六個(gè)平行的傳代培養(yǎng)菌液中兩者相對(duì)含量平均值為50%，表明競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)開始時(shí)7A8JT和E.coliJM109起始菌量一致。到傳代培養(yǎng)第一天時(shí)，兩者的相對(duì)含量保持在50%，表明7A8JT和JM109的共培養(yǎng)未出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)。直至第二天后，7A8JT逐漸呈現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)含量在55%～66%之間變化。相比之下，不含pHN7A8的受體菌JM109的相對(duì)含量逐漸下降，表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)劣勢(shì)。結(jié)果見圖2。

3討論

適應(yīng)性是指耐藥菌在沒有藥物選擇壓力的情況下生長(zhǎng)、定植等方面的能力。抗菌藥物一般作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成、染色體超螺旋的調(diào)節(jié)、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的生物合成，因此相關(guān)部位產(chǎn)生的耐藥突變常常伴隨著細(xì)菌適應(yīng)性的下降，但有些卻表現(xiàn)適應(yīng)性增強(qiáng)。例如空腸彎曲桿菌的gyrA突變?cè)诮閷?dǎo)其對(duì)喹諾酮類藥物耐藥的同時(shí)也使耐藥菌表現(xiàn)出適應(yīng)性的增強(qiáng)[8]。耐藥質(zhì)粒通常攜帶多種耐藥基因，對(duì)宿主菌的生長(zhǎng)代謝及其在環(huán)境中的適應(yīng)性造成一定影響。細(xì)菌捕獲耐藥質(zhì)粒后，通常伴隨著適應(yīng)性代價(jià)的產(chǎn)生[9]。耐藥菌的適應(yīng)性研究主要包括耐藥菌是否能快速適應(yīng)宿主或環(huán)境，能否在與敏感菌的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)中成為優(yōu)勢(shì)菌群。

細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線描述了細(xì)菌群體從開始生長(zhǎng)到死亡的動(dòng)態(tài)變化過程，競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)反映了連續(xù)生長(zhǎng)周期中菌株的競(jìng)爭(zhēng)劣勢(shì)，能夠較準(zhǔn)確地衡量適應(yīng)性[10]。本研究通過測(cè)定轉(zhuǎn)化子7A8JT和受體菌E.coliJM109的生長(zhǎng)曲線和兩者的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系來分析多重耐藥質(zhì)粒pHN7A8對(duì)宿主菌產(chǎn)生的適應(yīng)性代價(jià)。7A8JT和E.coliJM109表現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)能力，但轉(zhuǎn)化子7A8JT相對(duì)于受體菌E.coliJM109具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，表明菌株獲得質(zhì)粒pHN7A8后短期內(nèi)不會(huì)有較強(qiáng)的適應(yīng)性代價(jià)，宿主有可能適應(yīng)機(jī)體或外界環(huán)境使得該質(zhì)粒能夠穩(wěn)定存在于宿主中。質(zhì)粒pHN7A8能夠增強(qiáng)宿主菌適應(yīng)性的原因可能是由于該質(zhì)粒攜帶F33：A-：B-復(fù)制子[7]，為典型的IncFII型質(zhì)粒的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，主要編碼基因是copB(repA2)、repA1和repA4。攜帶此類復(fù)制子的典型質(zhì)粒如pEK499(GenBank No.EU935739)、pC15-1a(GenBank No.AY458016)、R100(GenBank No.AP000342)。雖然F型質(zhì)粒為窄宿主、低拷貝的大質(zhì)粒(100 kb左右)，但常常攜帶多個(gè)復(fù)制子，如FII型質(zhì)粒同時(shí)攜帶FIB和FIA型復(fù)制子。F型質(zhì)粒通常編碼多種毒力因子和耐藥決定因子以提高宿主菌的適應(yīng)性?？梢姡|(zhì)粒pHN7A8的復(fù)制控制系統(tǒng)及其攜帶的多種耐藥基因可能為減少宿主菌的適應(yīng)性代價(jià)起到一定作用。其次，質(zhì)粒沉溺系統(tǒng)可以修復(fù)質(zhì)粒分配不穩(wěn)定性，野生型耐藥質(zhì)粒不斷累積并得以穩(wěn)定傳播的一大因素是質(zhì)粒沉溺系統(tǒng)的作用。在本研究中，pHN7A8質(zhì)粒上存在三種沉溺系統(tǒng)，pemI-pemK、sok-mok-hok和srnB，其中hok-sok質(zhì)粒沉溺系統(tǒng)來源于大腸埃希菌質(zhì)粒R1，為毒素-抗毒素基因組合，可提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。在典型復(fù)制區(qū)上下游分別銜接沉溺系統(tǒng)srnB和pemk-pemI，進(jìn)一步保證了該質(zhì)粒在宿主菌傳代中的穩(wěn)定分配及遺傳。因此，質(zhì)粒pHN7A8能夠在寵物源及豬源腸桿菌中傳播和擴(kuò)散，可能與其能夠提高宿主菌的適應(yīng)性有關(guān)。此外，質(zhì)粒pHN7A8同時(shí)攜帶rmtB、blaCTX-M-65和fosA3等耐藥基因，提示多種抗生素的選擇壓力可能有助于其形成與傳播，因此臨床上應(yīng)警惕大量使用或?yàn)E用抗菌藥物對(duì)其形成的選擇壓力，以防止多重耐藥質(zhì)粒進(jìn)一步擴(kuò)散。聯(lián)合使用中藥可能有助于耐藥性的緩解[11]。

4結(jié)論

攜帶blaCTX-M-65、rmtB和fosA3多重耐藥質(zhì)粒pHN7A8在宿主菌JM109中能穩(wěn)定傳代。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]YU F Y，YAO D，PAN J Y，et al.High prevalence of plasmid-mediated 16S rRNA methylase genermtBamongEscherichiacoliclinical isolates from a Chinese teaching hospital[J/OL].BMCInfectDis，2010，10：184.[2015-9-18].http：//www.biomedcentral.com/1471-2334/10/184.

[2]XIA L N，TAO X Q，SHEN J Z，et al.A survey of β-lactamase and 16S rRNA methylase genes among fluoroquinolone-resistantEscherichiacoliisolates and their horizontal transmission in Shandong，China[J].FoodbornePathogDis，2011，8(12)：1241-1248.

[3]DU X D，WU C M，LIU H B，et al.Plasmid-mediatedArmAandRmtB16S rRNA methylases inEscherichiacoliisolated from chickens[J].JAntimicrobChemother，2009，64(6)：1328-1330.

[4]DENG Y，HE L，CHEN S，et al.F33：A-：B- and F2：A-：B- plasmids mediate dissemination of rmtB-blaCTX-M-9 group genes andrmtB-qepAinEnterobacteriaceaeisolates from pets in China[J].AntimicrobAgentsChemother，2011，55(10)：4926-4929.

[5]YAO Q，ZENG Z，HOU J，et al.Dissemination of thermtBgene carried onIncFandIncNplasmids amongEnterobacteriaceaein a pig farm and its environment[J].JAntimicrobChemother，2011，66(11)：2475-2479.

[6]HOU J，HUANG X，DENG Y，et al.Dissemination of the fosfomycin resistance gene fosA3 withCTX-Mβ-lactamase genes andrmtBcarried onIncFIIplasmids amongEscherichiacoliisolates from pets in China[J].AntimicrobAgentsChemother，2012，56(4)：2135-2138.

[7]HE L，PARTRIDGE S R，YANG X，et al.Complete nucleotide sequence of pHN7A8，an F33：A-：B- type epidemic plasmid carryingblaCTX-M-65，fosA3 andrmtBfrom China[J].JAntimicrobChemother，2013，68(1)：46-50.

[8]ZHANG Q，LIN J，PEREIRA S.Fluoroquinolone-resistantCampylobacterin animal reservoirs：dynamics of development，resistance mechanisms and ecological fitness[J].AnimHealthResRev，2003，4(2)：63-71.

[9]JOHNSEN P J，SIMONSEN G S，OLSVIK O，et al.Stability，persistence，and evolution of plasmid-encoded VanA glycopeptide resistance in enterococci in the absence of antibiotic selectioninvitroand in gnotobiotic mice[J].MicrobDrugResist，2002，8(3)：161-170.

[10]FOUCAULT M L，COURVALIN P，GRILLOT-COURVALIN C.Fitness cost of VanA-type vancomycin resistance in methicillin-resistantStaphylococcusaureus[J].AntimicrobAgentsChemother，2009，53(6)：2354-2359.

[11]寧官保，牛藝儒，張鼎，等.雞源大腸桿菌耐藥性分析及中藥對(duì)大腸桿菌耐藥性消除作用的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，46(6)：1018-1025.

NING G B,NIU Y R,ZHANG D,et al.Studies on the drug resistance of chiken isolatedEscherichiacoliand role of traditional Chinese mediciues in drug resistance elimination[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica,2015,46(6):1018-1025.(in Chinese)

(編輯白永平)

Fitness Cost of a Multidrug Plasmid CarryingblaCTX-M-65，rmtB，andfosA3

HE Liang-ying#，LIU Lan-ping#，ZENG Zhen-ling，LIU Jian-hua*

(CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

Key words:16S rRNA methylases；extended-spectrum β-lactamases；multidrug resistance encoding plasmids；fitness cost

Abstract:The objective of this study was to examine the fitness cost of a multidrug plasmid pHN7A8 carryingblaCTX-M-65，rmtB，andfosA3.Plasmid pHN7A8 carryingblaCTX-M-65，rmtB，andfosA3 fromE.coli7A8 was transferred intoE.coliJM109 by electroporation.Transformant 7A8JT containing pHN7A8 was obtained.Growth curve and growth competition experiments were performed to assess the fitness cost of pHN7A8 upon its host.Growth curve showed no significant difference between the transformant carrying pHN7A8 and sensitive recipientE.coliJM109.Competition experiments betweenE.coliJM109 strain and transformant 7A8JT revealed a competitive advantage for the transformant versus the recipient.The results showed that no fitness cost was observed for plasmid pHN7A8.More attention should be taken into account the effect of the clinical use of antibiotics on the selection of multidrug resistance encoding plasmids.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.023

收稿日期：2015-02-16

基金項(xiàng)目：973項(xiàng)目(2013CB127200)；國(guó)家自然科學(xué)基金廣東省聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目(U1031004)；廣東省高等學(xué)校高層次人才項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：何良英(1986-)，女，廣西南寧人，博士，主要從事細(xì)菌耐藥性、新型環(huán)境污染物的微生物降解研究，E-mail:heliangying@163.com；劉蘭平(1989-)，女，碩士生，主要從事細(xì)菌耐藥性研究。二人對(duì)本文貢獻(xiàn)相同 *通信作者：劉建華，教授，碩士生導(dǎo)師，Tel:(86-20)-85283824，F(xiàn)ax:(86-20)-85283824，E-mail：jhliu@scau.edu.cn

中圖分類號(hào)：S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)01-0172-05