李春曉，張宇曦，祁克宗，韓先干，涂　健，薛　挺，周秀紅

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036)

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phoP/Q雙組分系統(tǒng)對禽致病性大腸桿菌的毒力調(diào)控作用

李春曉，張宇曦，祁克宗*，韓先干，涂健，薛挺，周秀紅

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036)

摘要：phoP/Q作為一種外在環(huán)境感受器，參與調(diào)節(jié)細(xì)菌對外部環(huán)境的適應(yīng)性。本研究擬探討phoP/Q雙組分系統(tǒng)對禽致病性大腸桿菌(APEC)的生長、定植、毒力等生物學(xué)特性的影響。利用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建APEC AE 17株的phoP/Q雙組分調(diào)控系統(tǒng)缺失株，并構(gòu)建phoP/Q雙組分調(diào)控系統(tǒng)回復(fù)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化缺失株，構(gòu)建回復(fù)株。通過生長運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、黏附入侵CEF細(xì)胞試驗(yàn)、毒力基因轉(zhuǎn)錄水平檢測以及半數(shù)致死量(LD50)等試驗(yàn)比較野生株、缺失株、回復(fù)株的生物特性。與野生株相比，phoP-phoQ缺失不改變其生長特性；運(yùn)動(dòng)性較野生株下降63%；黏附與入侵CEF細(xì)胞能力分別降低69.83%(P<0.01)和62.17%(P<0.05)；LD50顯示毒力減弱13.3倍；polA、tsh基因轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)41%、54%；sodA、iss分別下調(diào)64%和98%。phoP/Q雙組分系統(tǒng)參與對APEC致病性的調(diào)控，該系統(tǒng)的缺失會(huì)降低APEC的致病性。

關(guān)鍵詞：禽致病性大腸桿菌；phoP/Q雙組分調(diào)控系統(tǒng)；致病性；熒光定量PCR

禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli，APEC) 屬于腸道外致病菌。由于其復(fù)雜的血清型和廣泛的耐藥性，一直制約著APEC疾病的防控，并給養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。影響APEC致病性的毒力因子包括黏附素、溶血素、攝鐵系統(tǒng)、脂多糖、侵襲素、毒素等。參與細(xì)菌毒力調(diào)控的系統(tǒng)主要包括有phoP/Q雙組分調(diào)控系統(tǒng)、QS系統(tǒng)、Fur系統(tǒng)等。APEC通過調(diào)控系統(tǒng)對其毒力因子進(jìn)行調(diào)控，實(shí)現(xiàn)對宿主的感染和致病[3]。

phoP/Q是革蘭陰性菌中普遍存在的雙組分調(diào)控系統(tǒng)[4]。它由細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白phoP(response regulator protein)和跨膜的組氨酸蛋白激酶phoQ(histidine protein kinases)組成[5]。研究表明，phoP/Q雙組分系統(tǒng)作為一種外在環(huán)境感受器，能被多種物質(zhì)(如Mg2+、Ca2+、防御素等)激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄水平，從而引起宿主細(xì)胞對環(huán)境的改變做出適應(yīng)性的調(diào)整(如增強(qiáng)耐酸性的能力、參與上皮細(xì)胞侵襲和抗菌肽抗感染等)[6-7]。最近的研究表明，phoP/Q系統(tǒng)參與對多種細(xì)菌的毒力調(diào)控[8]。在沙門菌中phoP/Q系統(tǒng)存在抵抗宿主抗菌肽作用，維持細(xì)菌致病力[6，9]。在鼠疫耶爾森菌中phoP/Q系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌表達(dá)一系列毒力因子，免受巨噬細(xì)胞吞噬并耐受宿主防御系統(tǒng)[10]。但phoP/Q基因?qū)PEC毒力因子在發(fā)病中的調(diào)控尚未見報(bào)道[11-12]。因此本試驗(yàn)利用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建禽致病性大腸桿菌AE17中的phoP/Q雙組分調(diào)控系統(tǒng)缺失株，并利用低拷貝載體pSTV28構(gòu)建phoP/Q雙組分系統(tǒng)回復(fù)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化缺失株內(nèi)構(gòu)建回復(fù)株，通過比較野生株、缺失株、回復(fù)株的生物特性，研究該系統(tǒng)缺失對APEC菌株的生長、定植、毒力等生物學(xué)特性的影響，為進(jìn)一步研究APEC的phoP/Q雙組分調(diào)控機(jī)制提供參考。

1材料與方法

1.1載體、菌株、試劑

禽致病性大腸桿菌AE17株(O2)，本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶SalⅠ、EcoRⅠ，DNA ligation Kit Ver.2.0，pSTV 28質(zhì)粒均購自大連TaKaRa有限公司。L-阿拉伯糖購自Sigma公司。大腸埃希菌DH5α、TOP10，質(zhì)粒小量提取試劑盒均購自天根生化有限公司。SYBR Green PCR Master Mix和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Promega公司。DNA-free kit購于Ambion公司。DNA marker、PCR MasterMix，購自北京康為世紀(jì)公司。96和6孔細(xì)胞板，購自美國Corning公司。TRIzol購自Invitrogen 公司。0.22 μm的無菌濾器，購自美國Millipore公司。

1.2引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank(NC_008563.1)公布的APEC O1基因序列、GenBank(KJ632656.1)公布的APEC O2phoP-phoQ基因序列和GenBank (AY048742.1)公布的pKD3質(zhì)粒序列，分別設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增phoP-phoQ上、下游序列的兩對引物phoPQ-UF/phoPQ-lap-cat-UR和phoPQ-lap-cat-DF/phoPQ-DR，用于擴(kuò)增氯霉素抗性片段的引物Cat-lap-phoPQ-F/Cat-lap-phoPQ-R，用于鑒定phoP-phoQ雙基因缺失株和回復(fù)株的3對引物：phoPQ-OF/phoPQ-OR、phoPQ-IF/phoPQ-IR和M13-47/M13-RV-M，以及用于構(gòu)建phoP-phoQ回復(fù)的引物phoPQ-C-EcoRI-F/phoPQ-C-SalI-R。其中phoPQ-lap-cat-UR與Cat-lap-phoPQ-F、Cat-lap-phoPQ-R與Cat-lap-phoPQ-F兩對引物5′端均帶有用于進(jìn)行重疊PCR(overlap-PCR)的反向互補(bǔ)20個(gè)堿基。引物序列見表1。

1.3缺失打靶片段的構(gòu)建

分別利用引物phoPQ-UF/phoPQ-lap-Cat-UR、phoPQ-lap-Cat-DF/phoPQ-DR和Cat-lap-phoPQ-F/Cat-lap-phoPQ-R擴(kuò)增回收得到phoP-phoQ上游同源臂(1 068 bp)、下游同源臂(992 bp)和氯霉素抗性片段(1 033 bp)。再使用overlap-PCR的方法利用引物phoPQ-UF/Cat-lap-phoPQ-R將phoP-phoQ上游同源臂(Up)與氯霉素片段(Cat)連接得到Up-Cat片段。最后再次使用overlap-PCR的方法利用引物phoPQ-UF/phoPQ-DR將Up-Cat片段與phoP-phoQ下游同源臂(Down)連接形成打靶片段Up-Cat-Down。打靶片段回收后，用于轉(zhuǎn)化含有pKD46質(zhì)粒的AE17菌株進(jìn)行缺失株的構(gòu)建。

1.4缺失株的構(gòu)建及抗性基因的敲除

參照文獻(xiàn)[13]的方法制備感受態(tài)細(xì)胞，利用同源重組方法進(jìn)行phoP-phoQ基因的敲除 (圖1)。取純化好的Up-Cat-Down打靶片段約500 ng與100 μL感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴15 min后將混合物轉(zhuǎn)入2 mm的Bio-Rad電轉(zhuǎn)化杯中，用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化參數(shù)設(shè)置為電壓2.3 kV、電阻200 Ω、脈沖25 μF。電擊后迅速加入900 μL SOC培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)45 min后涂于LB(Cat+)平板(氯霉素質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1)，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，PCR鑒定具有氯霉素抗性的克隆。

表1缺失株和回復(fù)株的引物序列

Table 1Primers used in the gene deletion and complemented strains

參照上文電轉(zhuǎn)化步驟，轉(zhuǎn)化pCP20質(zhì)粒至缺失株中，選擇含pCP20質(zhì)粒的陽性克隆，28 ℃培養(yǎng)8 h后，提高到42 ℃過夜培養(yǎng)，通過溫度的轉(zhuǎn)換熱誘導(dǎo)FLP重組酶表達(dá)，接種固體LB培養(yǎng)基后，挑取單克隆菌落，PCR鑒定氯霉素抗性消除的缺失株AE17ΔphoPQ。

1.5回復(fù)株的構(gòu)建

利用引物phoPQ-C-EcoRI-F/phoPQ-C-SalI-R擴(kuò)增回收含有上游啟動(dòng)子、下游終止子和phoP-phoQ基因ORF的序列C-phoPQ(2 776 bp)。使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切處理pSTV28質(zhì)粒和C-phoPQ片段，經(jīng)T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化入DH5α，使用M13-47/M13-RV-M引物進(jìn)行PCR鑒定，含有回復(fù)質(zhì)粒pSTV28-C-phoPQ的陽性克隆可擴(kuò)增出2 924 bp的條帶。

同樣方法制備缺失株AE17ΔphoPQ的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將構(gòu)建好的回復(fù)質(zhì)粒pSTV28-C-phoPQ電轉(zhuǎn)化入缺失株AE17ΔphoPQ中，將PCR鑒定的陽性回復(fù)株命名為AE17CΔphoPQ。

1.6生長曲線及運(yùn)動(dòng)性測定

參照文獻(xiàn)[14]的方法測定野生株、缺失株和回復(fù)株的生長曲線。參照文獻(xiàn)[15]的方法配制泳動(dòng)(swiming)培養(yǎng)基(1% trytone，0.5% NaCl，0.8% glucose，0.3% agar)和進(jìn)行運(yùn)動(dòng)性測定：取生長至OD600 nm=1.0的野生株AE17、缺失株AE17ΔphoPQ和回復(fù)株AE17CΔphoPQ各10 μL滴于平板中間，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，觀察并測量菌落直徑的差異。

1.7細(xì)胞的黏附和入侵

將野生株、缺失株、回復(fù)株，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期，6 000 g 4 ℃離心5 min，棄上清，菌體用無菌PBS洗滌3次，并用無抗生素的DMEM重懸。將液氮中保存的原代CEF細(xì)胞經(jīng)10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)液于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)復(fù)蘇后，傳代于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長滿孔底時(shí)，以細(xì)胞專用PBS洗滌細(xì)胞3次后待用。

參照文獻(xiàn)[16]，設(shè)計(jì)黏附組和入侵組每組都包含上述處理的三株細(xì)菌，按感染復(fù)數(shù)(MOI)=200加入滿CEF細(xì)胞的24孔板中，對照組加入等體積的不含抗生素的DMEM，每孔做三個(gè)重復(fù)。400 g低速離心5 min，使細(xì)菌沉降至孔底與細(xì)胞充分結(jié)合，37 ℃恒溫靜置孵育1.5 h，無菌PBS洗5次。黏附組每孔加入0.1%胰酶 200 μL，室溫作用10 min，裂解細(xì)胞，稀釋后涂布LB平板，37 ℃培養(yǎng)后平板菌落計(jì)數(shù)進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。入侵組每孔加入含100 μg·mL-1慶大霉素的DMEM作用1 h，無菌PBS洗3次后，用0.5% Triton X-100裂解細(xì)胞，稀釋后涂布LB平板，37 ℃培養(yǎng)后平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.8熒光定量PCR比較野生株和缺失株毒力基因轉(zhuǎn)錄水平差異

參照文獻(xiàn)[17]的方法用TRIzol法提取野生、缺失和回復(fù)株的RNA。設(shè)計(jì)禽致病性大腸桿菌毒力基因[18]——pfs、vat、luxS、tsh、fuyA、iucD、iss、yhiD、SodA、metJ、polA以及管家基因dnaE的熒光定量PCR引物[16]。引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，見表2。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：Real time PCR Master Mix 10 μL，Primer 1(10 μmoL·L-1) 0.5 μL，Primer 2(10 μmoL·L-1) 0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 8 μL。擴(kuò)增條件：50 ℃×2 min，95℃×10 min；變性95 ℃×15 s，60 ℃×1 min，循環(huán)次數(shù)40次。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT(Livak)法[19]，用于比較野生株和缺失株毒力基因轉(zhuǎn)錄水平差異。

表2Q-PCR所用的引物序列

Table 2Q-PCR primers used in this study

1.9半數(shù)致死量(LD50)的測定

將野生株、缺失株、回復(fù)株，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期，PBS洗滌后重懸。對10日齡櫻桃谷鴨采用腿部肌肉注射的方式進(jìn)行攻毒，分為6組，每組8只，攻毒劑量如下：1×109、1×108、1×107、1×106、1×105和1×104。攻毒后連續(xù)觀察7 d，記錄發(fā)病死亡情況并采用改良寇氏法計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)。

2結(jié)果

2.1phoP-phoQ缺失株和回復(fù)株的鑒定

對疑似缺失株和回復(fù)株用外側(cè)引物phoPQ-OF/phoPQ-OR進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明，缺失株和回復(fù)株可擴(kuò)增出2 435 bp的片段(圖2A泳道1、2)，而野生株擴(kuò)增的片段大小為4 432 bp(圖2A泳道3)。對疑似缺失株和回復(fù)株用內(nèi)側(cè)引物phoPQ-IF/phoPQ-IR進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明，缺失株未擴(kuò)增出條帶(圖2B泳道5)，而回復(fù)株和野生株擴(kuò)增出大小為711 bp的片段(圖2B泳道6、7)。鑒定結(jié)果表明，成功獲得AE17ΔphoPQ缺失株和AE17CΔphoPQ回復(fù)株。

2.2生長曲線及運(yùn)動(dòng)性檢測

對野生株、phoP-phoQ缺失株及回復(fù)株的生長曲線和運(yùn)動(dòng)性檢測結(jié)果(圖3、4)表明，phoP-phoQ雙基因缺失后對細(xì)菌的生長速率沒有明顯影響，但運(yùn)動(dòng)性顯著降低，僅為野生株的37%(P<0.01)，而AE17CΔphoPQ回復(fù)株可恢復(fù)其運(yùn)動(dòng)性。

2.3phoP-phoQ缺失顯著降低AE17對CEF細(xì)胞的黏附和入侵

對野生株AE17、缺失株AE17ΔphoPQ和回復(fù)株AE17CΔphoPQ對CEF細(xì)胞的黏附和入侵檢測結(jié)果表明，AE17、AE17ΔphoPQ菌株對CEF細(xì)胞的黏附能力分別為3.47×104、1.05×104CFU·孔-1；入侵能力分別為1.19×103、4.50×102CFU·孔-1。與野生株相比，缺失株對CEF的黏附和入侵能力分別降至30.17%和37.83%，敲除株黏附及入侵CEF能力較AE17均顯著的下降(P<0.05)。回復(fù)株可以恢復(fù)對CEF的黏附能力，回復(fù)株對CEF的入侵能力能夠部分恢復(fù)(圖5)。

2.4相關(guān)毒力基因 mRNA 水平轉(zhuǎn)錄情況

對野生株AE17、缺失株AE17ΔphoPQ和回復(fù)株AE17CΔphoPQ部分的毒力基因的mRNA轉(zhuǎn)錄分析顯示：phoP-phoQ雙基因缺失后polA和tsh基因轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)41%和54%，而sodA和iss分別下調(diào)了64%和98%，其他基因的轉(zhuǎn)錄水平變化不明顯(圖6)。

2.5半數(shù)致死量(LD50)的測定

動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示AE17、AE17ΔphoPQ、AE17CΔphoPQ對雛鴨的LD50分別為1.78×105、2.37×106和4.22×105CFU，表明phoP-phoQ雙基因缺失可導(dǎo)致APEC對櫻桃谷鴨的致病力減弱13.3倍(表3)。

表3phoP-phoQ基因缺失對APEC致病性(LD50)的影響

Table 3The effects of phoP-phoQ deletion mutant on LD50of APEC

3討論

革蘭陰性菌中phoP/Q雙組分系統(tǒng)即為一種外在環(huán)境感受器，參與調(diào)節(jié)細(xì)菌對外部環(huán)境的適應(yīng)性[20]。有研究推測革蘭陰性菌的phoP-phoQ作用機(jī)制可能是調(diào)節(jié)細(xì)菌外膜蛋白以及LPS結(jié)構(gòu)，使其能與宿主抗菌肽結(jié)合，減小了宿主抗菌肽從細(xì)菌表面競爭二價(jià)金屬離子的量或作用強(qiáng)度，進(jìn)而減弱宿主清除細(xì)菌的能力，維持細(xì)菌致病力[9-10，21]。

本研究結(jié)果表明，缺失株AE17ΔphoPQ在生長曲線上較野生株并沒有明顯變化，而運(yùn)動(dòng)性較野生株下降了63%，這與C.J.Alteri等報(bào)道的phoP缺失株運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)相反[22]。推測phoP和phoQ可能對細(xì)菌的群集運(yùn)動(dòng)都有顯著的調(diào)控影響，phoP單缺失會(huì)造成細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，而phoP/Q雙組分全部缺失會(huì)造成細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力降低[23]，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

細(xì)菌黏附于宿主細(xì)胞或其他機(jī)體表面對細(xì)菌的定殖、感染至關(guān)重要[24-25]。APEC在自然條件下一般先在禽類的呼吸道表面定殖，繼而感染肺部，然后才進(jìn)入血液并進(jìn)行擴(kuò)散，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病。為了驗(yàn)證phoP/Q雙組分系統(tǒng)對APEC定植感染能力的影響，本試驗(yàn)對phoP-phoQ缺失前后APEC黏附和入侵CEF細(xì)胞能力以及對禽類的LD50進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示缺失株的黏附及入侵能力均較野生株下降明顯(P<0.05)，LD50也較野生株下降了13.3倍，而回復(fù)株毒力與基因的表達(dá)有關(guān)，而基因的表達(dá)與之相連載體的表達(dá)有關(guān)，所以回復(fù)株毒力與原始株相比有所降低，但恢復(fù)大部分感染及致病能力。結(jié)果表明phoP/Q雙組分系統(tǒng)對APEC致病性具有重要調(diào)控作用。這與其他細(xì)菌中相關(guān)研究類似，phoP/Q雙組分系統(tǒng)的缺失能降低細(xì)菌對宿主的致病性，在福氏志賀菌中phoP/Q雙組分的突變降低了其對PMNs (多形核白細(xì)胞)和抗菌肽的抵抗能力，進(jìn)而降低其致病性[26]。

phoP/Q雙組分系統(tǒng)中，組氨酸蛋白激酶phoQ通過感受外界信息變化激活phoP蛋白；反應(yīng)調(diào)控蛋白phoP通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)H+的外排，產(chǎn)生質(zhì)子動(dòng)力來調(diào)控下游基因的表達(dá)[22]。本研究對pfs、vat、luxS、tsh、fuyA、iucD、iss、yhiD、SodA、metJ和polA等基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，在phoP-phoQ缺失后APEC的polA(DNA修復(fù)相關(guān))、tsh(黏附相關(guān))基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)(P<0.05)；sodA(超氧化酶)、iss(血清存活)的轉(zhuǎn)錄水平均極顯著下調(diào)(P<0.01)。結(jié)果表明phoP/Q雙組分系統(tǒng)可能參與多種APEC毒力基因的調(diào)控，影響APEC對宿主的致病性。

iss與tsh是APEC的關(guān)鍵致病基因，對其毒力影響顯著[27-28]。phoP-phoQ雙基因缺失前后對比，iss轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)了98%，這可能造成在腿部肌肉攻毒后細(xì)菌在體內(nèi)的血清存活能力下降明顯；盡管tsh轉(zhuǎn)錄上調(diào)了0.54倍，但缺失株毒力仍然下降13.3倍。這與在沙門菌上，phoP/Q任意一基因的敲除會(huì)造成其不同毒力因子轉(zhuǎn)錄升高或者下降，但細(xì)菌毒力下降一致[29]。黏附因子tsh在缺失株中轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，而缺失株黏附DEF細(xì)胞能力卻降低，可能是由于細(xì)菌中存在多種不同的黏附素[24，30]，tsh只是其中之一。此外，細(xì)菌對細(xì)胞的入侵黏附是個(gè)多因子共同作用的過程。本研究中，polA和sodA轉(zhuǎn)錄的改變，其原因可能與在沙門菌中一樣，是由于phoP/Q的缺失，導(dǎo)致細(xì)菌喪失對跨膜電化學(xué)梯度的調(diào)控，進(jìn)而引起電化學(xué)梯度敏感性基因轉(zhuǎn)錄水平的改變[22]。

4結(jié)論

phoP/Q雙組分系統(tǒng)對APEC的致病性具有重要調(diào)控作用，phoP-phoQ雙基因的缺失會(huì)造成APEC致病性明顯減弱。本研究為進(jìn)一步開展phoP/Q雙組分系統(tǒng)對APEC的致病作用的探討提供參考。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]DHO M M，F(xiàn)AIRBROTHER J M.Avian pathogenicEscherichiacoli(APEC)[J].VetRes，1999，30(2-3)：299-316.

[2]MELLATA M，DHO-MOULIN M，DOZOIS C M，et al.Role of avian pathogenicEscherichiacolivirulence factors in bacterial intertation with chicken heterophils and macrophages[J].InfectImmun，2003，71(1)：494-503.

[3]WANG S，NIU C，SHI Z，et al.Effects of ibeA deletion on virulence and biofilm formation of avian pathogenicEscherichiacoli[J].InfectImmun，2011，79(1)：279-287.

[4]EGUCHI Y，UTSUMI R.A novel mechanism for connecting bacterial two-component SIGNAL-transduction systems[J].TrendsBiochemSci，2005，30(2)：70-72.

[5]PARK S Y，GROISMAN E A.Signal-specific temporal response by the Salmonella PhoP/PhoQ regulatory system[J].MolMicrobiol，2014，91(1)：135-144.

[6]BADER M W，NAVARRE W W，SHIAU W，et al.Regulation of Salmonella typhimurium virulence gene expression by cationic antimicrobial peptides[J].MolMicrobiol，2003，50(1)：219-230.

[7]SHPRUNG T，PELEG A，ROSENFELD Y，et al.Effect of PhoP-PhoQ activation by broad repertoire of antimicrobial peptides on bacterial resistance[J].JBiolChem，2012，287(7)：4544-4551.

[8]STRAUBE R.Reciprocal regulation as a source of ultrasensitivity in two-component systems with a bifunctional sensor kinase[J].PLoSComputBiol，2014，10(5)：e1003614.

[9]LIPPA A M，GOULIAN M.Perturbation of the oxidizing environment of the periplasm stimulates the PhoQ/PhoP system inEscherichiacoli[J].JBacteriol，2012，194(6)：1457-1463.

[10]MOON K，GOTTESMAN S.A PhoQ/P-regulated small RNA regulates sensitivity ofEscherichiacolito antimicrobial peptides[J].MolMicrobiol，2009，74(6)：1314-1330.

[11]CRéPIN S，CHEKABAB S M，LE BIHAN G，et al.The Pho regulon and the pathogenesis ofEscherichiacoli[J].VetMicrobiol，2011，153(1-2)：82-88.

[12]GROISMAN E A，PARRA-LOPEZ C，SALCEDO M，et al.Resistance to host antimicrobial peptides is necessary for Salmonella virulence[J].ProcNatlAcadSciUSA，1992，89(24)：11939-11943.

[13]DATSENKO K A，WANNER B L.One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichiacoliK-12 using PCR products[J].ProcNatlAcadSciUSA，2000，97(12)：6640-6645.

[14]CHATTERJEE S，BANDYOPADHYAY A，SARKAR K.Effect of iron oxide and gold nanoparticles on bacterial growth leading towards biological application[J].JNanobiotechnol，2011，9：34.

[15]韓月，韓先干，白灝，等.rmlA基因缺失影響禽致病性大腸桿菌的生物被膜形成[J].微生物學(xué)報(bào)，2013，53(10)：1056-1062.

HAN Y，HAN X G，BAI H，et al.rmlAgene deletion affects biofilm formation of avian pathogenicEscherichiacoli[J].ActaMicrobiologicaSinica，2013，53(10)：1056-1062.(in Chinese)

[16]HAN X，BAI H，LIU L，et al.The luxS gene functions in the pathogenesis of avian pathogenicEscherichiacoli[J].MicrobPathog，2013，55：21-27.

[17]HAN X G，LU C P.Detection of autoinducer-2 and analysis of the profile of luxS and pfs transcription inStreptococcussuisserotype 2[J].CurrMicrobiol，2009，58(2)：146-152.

[18]LI Y，GAO H，QIN L，et al.Identification and characterization of PhoP regulon members in Yersinia pestis biovar Microtus[J].BMCGenomics，2008，9：143.

[19]SCHMITTGEN T D，LIVAK K J.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[J].NatProtoc，2008，3(6)：1101-1108.

[20]NAM D，CHOI E，KWEON D H，et al.The RstB sensor acts on the PhoQ sensor to control expression of PhoP-regulated genes[J].MolCells，2010，30(4)：363-368.

[21]BAND V I，WEISS D S.Mechanisms of antimicrobial peptide resistance in gram-negative bacteria[J].Antibiotics(Basel)，2015，4(1)：18-41.

[22]ALTERI C J，LINDNER J R，REISS D J，et al.The broadly conserved regulator PhoP links pathogen virulence and membrane potential inEscherichiacoli[J].MolMicrobiol，2011，82(1)：145-163.

[23]LIPPA A M，GOULIAN M.Perturbation of the oxidizing environment of the periplasm stimulates the PhoQ/PhoP system inEscherichiacoli[J].JBacteriol，2012，194(6)：1457-1463.

[25]KLINE K A，F(xiàn)LKER S，DAHLBERG S，et al.Bacterial adhesins in host-microbe interactions[J].CellHostMicrobe，2009，5(6)：580-592.

[26]MOSS J E，F(xiàn)ISHER P E，VICK B，et al.The regulatory protein PhoP controls susceptibility to the host inflammatory response inShigellaflexneri[J].CellMicrobiol，2000，2(6)：443-452.

[27]ZAHRAEI SALEHI T，DERAKHSHANDEH A，TADJBAKHSH H，et al.Comparison and phylogenetic analysis of the ISS gene in two predominant avian pathogenicE.coliserogroups isolated from avian colibacillosis in Iran[J].ResVetSci，2013，94(1)：5-8.

[28]DELICATO E R，DE BRITO B G，KONOPATZKI A P，et al.Occurrence of the temperature-sensitive hemagglutinin among avianEscherichiacoli[J].AvianDis，2002，46(3)：713-716.[29]SKYBERG J A，HORNE S M，GIDDINGS C W，et al.Characterizing avianEscherichiacoliisolates with multiplex polymerase chain reaction[J].AvianDis，2003，47(4)：1441-1447.

[30]SHATA M T，REITZ M S JR，DEVICO A L，et al.Mucosal and systemic HIV-1 Env-specific CD8+T-cells develop after intragastric vaccination with a Salmonella Env DNA vaccine vector[J].Vaccine，2001，20(3-4)：623-629.

(編輯白永平)

The Role of phoP/Q Two-component System in Virulence of Avian PathogenicEscherichiacoli

LI Chun-xiao，ZHANG Yu-xi，QI Ke-zong*，HAN Xian-gan，TU Jian，XUE Ting，ZHOU Xiu-hong

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China)

Key words:avian pathogenicEscherichiacoli；phoP/Q two-component system；pathogenicity;real-time PCR

Abstract:As a kind of external environment receptor，phoP/phoQ is involved in regulating bacterial adaptability to external environment.The aim of this study was to investigate the effect of phoP/Q two-component system to biological characteristics of avian pathogenicEscherichiacoli(APEC) such as growth，engraftment，and virulence.The phoP-phoQ deletion mutant strain was constructed by homologous recombination assay，and the complement strain was constructed through transformation deletion strain with the plasmid complement.The growth curve determination and motility assay，the adhesion and invasion to chicken embryo fibroblast (CEF)，detection of virulence gene transcription and median lethal dose (LD50) experimental were used to compare biological characteristics of wild strain，deletion strain and complement strain.Compared with the wild strain，the growth characteristics of the mutant strain did not change；the motility of the mutant strain felled by 63% comparing with wild strain；its ability of adhesion and invasion to DEF cells respectively decreased to 69.83% and 62.17%；and LD50was significantly reduced by 13.3 times.The transcription ofpolA，tshrespectively increased by 41% and 54%，while thesodAandissdecreased by 64% and 98%.The phoP/Q two-component system is involved in the regulation of the APEC pathogenic，and its deletion can reduce the pathogenicity of APEC.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.021

收稿日期：2015-06-29

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372402)；安徽省自然科學(xué)基金(1508085SQC206)

作者簡介：李春曉(1990-)，女，河南駐馬店人，碩士生，主要從事獸醫(yī)疫病病理研究，E-mail：18756903021@163.com *通信作者：祁克宗(1962-)，男，安徽合肥人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事獸醫(yī)疫病病理研究，E-mail：qkz@ahau.edu.cn

中圖分類號(hào)：S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)01-0157-08