戈勝?gòu)?qiáng)，吳曉東，張志誠(chéng)，張永強(qiáng)，趙永剛，王志亮

(中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032)

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非洲豬瘟疫苗研究進(jìn)展

戈勝?gòu)?qiáng)#，吳曉東#，張志誠(chéng)，張永強(qiáng)，趙永剛，王志亮*

(中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032)

摘要：非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒引起的、以軟蜱為傳播媒介的豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病毒主要在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞中復(fù)制，造成細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重影響宿主的免疫系統(tǒng)。該病雖最早見(jiàn)報(bào)于1921年，但由于病毒基因組大，基因型多且非常容易變異等客觀(guān)原因，造成至今無(wú)有效的疫苗面世。國(guó)外ASF疫苗研發(fā)一直在開(kāi)拓前行，而國(guó)內(nèi)大多數(shù)文獻(xiàn)只進(jìn)行了簡(jiǎn)單的描述，沒(méi)有全面展示ASF疫苗的研究進(jìn)展，為此作者就ASF疫苗的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為我國(guó)ASF的疫苗研究提供參考。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟；細(xì)胞免疫；疫苗

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)于1921年在肯尼亞首次報(bào)道[1]，但該病毒實(shí)際早已在東非和南非的疣豬(warthogs)和波斯銳綠蜱(tampan)中循環(huán)存在許多世紀(jì)[2]。自該病公開(kāi)報(bào)道以后，其在非洲大陸快速蔓延，并于1957年首次傳入歐洲的葡萄牙，之后開(kāi)始在西歐廣泛傳播。西班牙(1960)、法國(guó)(1964)、意大利(1967)、前蘇聯(lián)(1977)、馬耳他(1978)、比利時(shí)(1985)、荷蘭(1986)等歐洲國(guó)家隨后均有疫情報(bào)道。2007年，非洲豬瘟傳播至歐亞接壤的高加索地區(qū)并很快傳至格魯吉亞、亞美尼亞、阿塞拜疆以及俄羅斯地區(qū)，且呈現(xiàn)出繼續(xù)蔓延的趨勢(shì)。近幾年的疫情監(jiān)測(cè)顯示，非洲豬瘟已經(jīng)在俄羅斯成為地方流行性疾病，特別是俄羅斯境內(nèi)野豬的潛在感染使得該病在俄羅斯快速根除的可能性很小。由于我國(guó)與俄羅斯接壤，且與非洲的人員、貿(mào)易交流日益頻繁，此病傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越大。雖然國(guó)外有根除該病的成功案例，但是面對(duì)國(guó)內(nèi)不規(guī)范的養(yǎng)殖環(huán)境，復(fù)雜的疫情狀況和落后的飼養(yǎng)管理水平等，使得疫苗仍為我國(guó)預(yù)防該病的最佳方案。

ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬中的唯一成員，而且是唯一的蟲(chóng)媒DNA病毒。在1982年的國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)第4次報(bào)告中因ASFV與虹彩病毒科的形態(tài)相似，將ASFV劃至虹彩病毒科。但隨后發(fā)現(xiàn)其DNA結(jié)構(gòu)和復(fù)制方式明顯不同于虹彩病毒科內(nèi)的其他成員，而與痘病毒相似，故在1991年的國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)第5次報(bào)告中將其劃入痘病毒科內(nèi)，但置于該科的脊椎動(dòng)物痘病毒亞科及昆蟲(chóng)痘病毒亞科之外。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ASFV的復(fù)制策略與痘病毒也有差異，且具有介于痘病毒和虹彩病毒之間的特征，所以在2000年的國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)第7次報(bào)告中將其歸屬于非洲豬瘟病毒科，而且是其中唯一的成員。ASFV顆粒直徑約200 nm，衣殼呈二十面體對(duì)稱(chēng)，具有復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)。病毒基因組為一條線(xiàn)性雙鏈DNA分子，170～190 kb，可編碼約200種蛋白質(zhì)。由于A(yíng)SFV的抗感染機(jī)制十分復(fù)雜、基因型多(22個(gè)基因型)且病毒容易變異，故ASF疫苗一直未研究成功，但國(guó)外科學(xué)家一直在不斷嘗試。我國(guó)已有大量文獻(xiàn)介紹非洲豬瘟及防控[3]，但是針對(duì)該病疫苗的介紹還較簡(jiǎn)單，沒(méi)有全面展示該病疫苗的研究進(jìn)展，為此作者就ASF疫苗的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為我國(guó)ASF的疫苗研究提供參考。

1滅活疫苗

滅活疫苗作為最經(jīng)典的疫苗研制方式，在非洲豬瘟發(fā)現(xiàn)之后即已開(kāi)始研發(fā)，但早期落后的滅活工藝無(wú)法取得滿(mǎn)意的制苗效果。如經(jīng)加熱[1]、復(fù)方碘溶液、甲苯、福爾馬林[4]、結(jié)晶紫[5-6]、β-丙內(nèi)酯[7-8]、乙酰氮丙啶和縮水甘油醛[8]處理的ASF滅活疫苗雖部分能刺激豬產(chǎn)生抗體，但即使借助佐劑仍無(wú)法抵御ASFV的攻擊。20世紀(jì)60年代后的研究也證實(shí)ASF滅活疫苗作用微弱[8-9]或僅在某些病例中發(fā)揮部分保護(hù)作用[7]，如用ASFV接種的肺泡巨噬細(xì)胞懸浮液制備的滅活疫苗免疫后無(wú)保護(hù)作用[10]，ASFV感染豬的脾組織勻漿經(jīng)弗氏完全佐劑乳化制備的滅活疫苗僅可以使ASF同源毒株的攻毒保護(hù)率達(dá)到70%，且所有存活豬都表現(xiàn)出臨床癥狀[11]，該試驗(yàn)的第二次驗(yàn)證仍只能達(dá)到50%以上的保護(hù)率[12]。由于滅活疫苗自身固有的缺陷，很難刺激先天免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的細(xì)胞免疫，而隨著ASF研究的不斷深入，科學(xué)家逐漸認(rèn)識(shí)到細(xì)胞免疫對(duì)于A(yíng)SFV感染的重要作用，因此科學(xué)家又希望通過(guò)添加佐劑或免疫增強(qiáng)劑來(lái)提高ASF滅活疫苗的功效，刺激機(jī)體產(chǎn)生合適的細(xì)胞免疫反應(yīng)[12]。但最新的研究結(jié)果證實(shí)，即使使用最新的佐劑，如PolygenTM或Emulsigen?-D等，ASF滅活疫苗仍無(wú)法達(dá)到有效保護(hù)的目的[13]。

2弱毒疫苗

早在1957年，科學(xué)家即認(rèn)識(shí)到感染低毒力ASFV存活下來(lái)的豬可以抵御同基因型強(qiáng)毒株的攻擊[5]。隨后，在20世紀(jì)60年代，大量的試驗(yàn)證實(shí)ASFV經(jīng)細(xì)胞多次傳代培養(yǎng)后可以使其毒力下降[14-18]，接種家豬不再產(chǎn)生致死性感染，這使得人們相信制備ASF弱毒疫苗的可能性很大。1963年，R.J.Manso等證實(shí)通過(guò)豬骨髓細(xì)胞傳代致弱的ASF弱毒疫苗可以抵御強(qiáng)毒株攻擊[15]。此弱毒疫苗隨后在葡萄牙和西班牙進(jìn)行田間試驗(yàn)，但卻造成了災(zāi)難性的后果，免疫后的許多豬出現(xiàn)了肺炎、運(yùn)動(dòng)障礙、皮膚潰瘍、流產(chǎn)和死亡等疫苗免疫副作用。特別是在葡萄牙，550 000頭豬免疫后有128 684頭出現(xiàn)免疫副作用，且出現(xiàn)大量病毒攜帶豬。據(jù)推測(cè)，隨后出現(xiàn)的ASF疫情中分離的弱毒株可能也來(lái)自此次疫苗接種[19-20]。 這種現(xiàn)象也與相關(guān)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的攻毒結(jié)果相似[19]，后者證實(shí)ASF弱毒疫苗接種后，即使沒(méi)有接種強(qiáng)毒株，大多數(shù)的免疫動(dòng)物仍會(huì)出現(xiàn)慢性感染，且最終死亡率達(dá)到10%～50%。很多病毒攜帶者雖能在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持健康狀態(tài)，但大多數(shù)最終發(fā)展為慢性肺炎或因急性發(fā)作而死亡。最終的死亡率與弱毒返強(qiáng)的程度、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的敏感程度和接種動(dòng)物的壓力狀況等有密切關(guān)系。有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ASF弱毒疫苗接種豬暴露于口蹄疫、牛瘟或豬瘟的環(huán)境壓力下時(shí)，相比較無(wú)此壓力的ASF弱毒疫苗接種豬，在面對(duì)強(qiáng)毒攻擊時(shí)暴露在壓力之下的豬更易死亡[21]。

由于此次失敗的臨床經(jīng)驗(yàn)，ASF再無(wú)弱毒疫苗進(jìn)行過(guò)田間試驗(yàn)[22]。雖然ASF弱毒疫苗的田間試驗(yàn)停滯不前，但是關(guān)于此方向的研究仍在繼續(xù)。通過(guò)自然篩選或細(xì)胞傳代致弱技術(shù)，P.J.Wilkinson(1981年)[23]，G.F.Ruiz等(1986年)[24]，A.Leit?o等(2001年)[25]，F(xiàn).S.Boinas等(2004年)[26]和K.King等(2011年)[27]均證實(shí)ASF弱毒疫苗可以抵御強(qiáng)毒株的攻擊。為進(jìn)一步研究ASFV致弱的分子機(jī)制，D.A.Chapman等[28]對(duì)葡萄牙分離的基因Ⅰ型自然弱毒株OURT88/3進(jìn)行了全基因測(cè)序，經(jīng)與西非強(qiáng)毒株Benin 97/1和西班牙Vero細(xì)胞傳代適應(yīng)株BA71V對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn)，OURT88/3和BA71V均出現(xiàn)了8～10 kb大小片段的基因丟失。這個(gè)片段可以表達(dá)5個(gè)拷貝的多基因家族(multigene family，MGF)360和2個(gè)拷貝的多基因家族505/530。這2個(gè)多基因家族的丟失可以增加Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生和增強(qiáng)干擾素的反應(yīng)強(qiáng)度[29]。OURT88/3同時(shí)還在EP402R和EP153R基因處發(fā)生移碼突變，這2個(gè)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)證實(shí)也與免疫逃避有關(guān)[30-31]。這些基因的丟失和中斷可能在A(yíng)SFV致弱或增強(qiáng)機(jī)體免疫水平方面發(fā)揮重要作用。

隨著全基因測(cè)序技術(shù)的不斷成熟以及ASFV基因功能的不斷探索，通過(guò)基因敲除的方式制備ASF弱毒疫苗的可能性越來(lái)越大。目前最常用的技術(shù)手段是利用溶斑識(shí)別和篩選技術(shù)(lysis plaque identification and selection)進(jìn)行基因突變[32]。由于基因敲除的變化不是點(diǎn)突變，因此毒力更穩(wěn)定，毒力返強(qiáng)概率也更小。對(duì)于A(yíng)SFV，目前備受關(guān)注的基因主要是那些刪除后會(huì)導(dǎo)致病毒毒力降低或增加機(jī)體免疫反應(yīng)的功能基因[33]。例如，多基因家族360和530里面的基因[29]，參與到核苷酸代謝的胸苷激酶基因(thymidine kinase，TK)[33]和B119L或9GL基因[34]。這些基因刪除后通過(guò)降低病毒在巨噬細(xì)胞的繁殖能力進(jìn)而達(dá)到降低病毒毒力的目的。還有些基因雖然刪除后不能降低病毒在巨噬細(xì)胞的繁殖能力，但也能減低病毒在豬體內(nèi)的毒力。例如，刪除DP71L基因(也命名為114L、NL、NLS)和DP96R(也命名為UK)毒力基因也可以降低病毒的毒力[35-36]。相反，有一些涉及免疫逃避的基因被刪除后不能降低病毒毒力。例如，編碼 A238L蛋白[37]、CD2v 蛋白[30]、C-型凝集素(C-type lectin)[38]和細(xì)胞凋亡抑制因子的基因被刪除后并沒(méi)有降低病毒在豬體內(nèi)的毒力，但仍有希望作為弱毒疫苗的刪除基因，因?yàn)檫@些基因刪除后可能會(huì)對(duì)豬產(chǎn)生適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)反應(yīng)。

3亞單位疫苗

ASF亞單位疫苗的研究策略主要是將具有中和表位的非洲豬瘟病毒保護(hù)性抗原基因在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)，并將產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽遞呈給抗原遞呈細(xì)胞，以誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗非洲豬瘟病毒的中和抗體。ASFV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白很多，但恢復(fù)期豬血清顯示P72、P30和P54為感染過(guò)程中引起體液免疫應(yīng)答最重要的3個(gè)抗原蛋白[39-44]。針對(duì)P72和P54的抗體可以阻止病毒吸附，針對(duì)P30的抗體可以阻止病毒內(nèi)吞[42]。目前大量的研究已經(jīng)證實(shí)將這三個(gè)蛋白質(zhì)作為ASF亞單位疫苗具有一定的局限性。P.Gómez-Puertas等采用重組桿狀病毒表達(dá)的P30和P54蛋白制備的疫苗僅能提供50%的保護(hù)[45]，M.G.Barderas等表達(dá)的P54/30重組蛋白質(zhì)僅可以延緩臨床癥狀的出現(xiàn)和降低病毒血癥的滴度[46]，J.G.Neilan等證實(shí)將P30、P54和P72免疫后不能提供免疫保護(hù)，僅能延緩臨床癥狀出現(xiàn)時(shí)間和降低病毒血癥水平[47]。針對(duì)其他ASFV蛋白質(zhì)的研究也證實(shí)了單純的將蛋白質(zhì)作為疫苗使用的不足，如將2只ASFV血凝素蛋白免疫豬與ASFV強(qiáng)毒感染豬混合飼養(yǎng)，1只死亡，1只存活[48]；桿狀病毒表達(dá)的CD2v蛋白只能提供部分保護(hù)[49]；經(jīng)抗原分析后人工合成的ASFV肽段只能延緩病程[50]；病毒結(jié)合蛋白P12的抗血清在體外試驗(yàn)中不能降低病毒感染[42]，不能阻止ASFV與易感細(xì)胞結(jié)合或中和病毒等[51-52]。這些試驗(yàn)說(shuō)明面對(duì)ASFV眾多的抗原結(jié)構(gòu)蛋白和復(fù)雜的免疫刺激過(guò)程，單純依靠一種或幾種蛋白質(zhì)很難達(dá)到免疫預(yù)防效果。

4DNA疫苗

DNA疫苗又稱(chēng)核酸疫苗，是指將編碼某種抗原蛋白質(zhì)的重組真核表達(dá)載體直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)合成抗原蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生針對(duì)該抗原蛋白質(zhì)的特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疫病的目的。作為新一代的疫苗研制方向，ASFV的相關(guān)研究也已經(jīng)開(kāi)始。J.M.Argilaguet等將 P30和P54連入真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-PQ，結(jié)果該DNA疫苗免疫豬后無(wú)法抵御強(qiáng)毒株的攻擊[53]。隨后，該實(shí)驗(yàn)室又進(jìn)一步將ASFV血凝素蛋白基因和泛素基因(ubiquitin)連入上述DNA疫苗中，結(jié)果仍不能達(dá)到完全保護(hù)的功效[54]。為進(jìn)一步研究能刺激CD8+T細(xì)胞的潛在免疫保護(hù)區(qū)，A.Lacasta等通過(guò)表達(dá)文庫(kù)(expression library)構(gòu)建了4 029個(gè)表達(dá)質(zhì)粒(ASFVUblib)并對(duì)其進(jìn)行了免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果保護(hù)率仍只達(dá)到60%[55]。雖然目前研制的DNA疫苗還不能抵御強(qiáng)毒攻擊，但ASFVUblib免疫攻毒后存活的豬無(wú)排毒現(xiàn)象，這個(gè)研究結(jié)果標(biāo)志著距離開(kāi)發(fā)出有效的ASF疫苗又邁出了一大步。相信隨著ASFV基因組及保護(hù)性抗原的不斷深入研究以及表達(dá)載體的不斷改造優(yōu)化，DNA疫苗一定會(huì)在未來(lái)ASF疫苗市場(chǎng)上占據(jù)一席之地。

5其他新型疫苗

復(fù)制缺陷型病毒疫苗是近些年倍受關(guān)注的新型疫苗研制方向。ASF復(fù)制缺陷型疫苗是采用基因工程方法，將非洲豬瘟弱毒株復(fù)制過(guò)程中的一些必需基因進(jìn)行缺失，使其只有在提供復(fù)制必需基因的輔助細(xì)胞系中才能進(jìn)行有效復(fù)制，在感染動(dòng)物后不能進(jìn)行有效復(fù)制，故該疫苗毒株最大程度保留了病毒的原始狀態(tài)，保持了完整病毒顆粒所具有的免疫原性且在感染動(dòng)物中不會(huì)產(chǎn)生排毒等免疫副作用。雖然目前還無(wú)更詳細(xì)的專(zhuān)業(yè)報(bào)道，但有報(bào)道稱(chēng)西班牙馬德里Severo Ochoa分子生物學(xué)中心(CBMSO)的研究人員已經(jīng)開(kāi)始研發(fā)[56]，其實(shí)驗(yàn)室也于2012年將通過(guò)抑制pp220、pp62和pB438L基因產(chǎn)生ASF復(fù)制缺陷性病毒的研究申請(qǐng)專(zhuān)利[57]。

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(編輯白永平)

Progress in Development of African Swine Fever Vaccine

GE Sheng-qiang#，WU Xiao-dong#，ZHANG Zhi-cheng，ZHANG Yong-qiang，ZHAO Yong-gang，WANG Zhi-liang*

(ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter，Qingdao266032，China)

Key words:African swine fever；cellular immunity；vaccine

Abstract:African swine fever(ASF) is an acute，febrile，highly contagious，tick borne disease caused by African swine fever virus.The virus mainly replicate in the reticuloendothelial cells and mononuclear macrophage，resulting in cell apoptosis and causing serious impact on the immune system of the host.Even though the disease was first described in 1921，there is still no efficient vaccine available in the market because of the big virus genome，multi genotype and easily mutation.Even so，foreign scientists keep researching on the development of ASF vaccine.Although there are Chinese articles on ASF had been published，most of these articles provided brief introductions of the disease without fully discussed the development associated with ASF vaccine.Here，in order to provide reference to the research of ASF vaccine，we reviewed the current research progress of ASF vaccine.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.002

收稿日期：2015-03-04

作者簡(jiǎn)介：戈勝?gòu)?qiáng)(1982-)，男，山東青島人，博士，主要從事動(dòng)物疫病病原分子生物學(xué)研究，E-mail：geshengqiang@cahec.cn；吳曉東，Tel：0532-87839188。二人并列第一作者 *通信作者：王志亮，研究員，E-mail：wangzhiliang@cahec.cn

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.285.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)01-0010-06