孫 晨綜述，韓利文，何秋霞，張 云，王 雪，劉可春審校

（山東省科學院生物研究所/山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室，山東濟南250014）

·綜 述·

斑馬魚模型在中藥毒性研究中的應用進展*

孫 晨綜述，韓利文，何秋霞，張 云，王 雪，劉可春△審校

（山東省科學院生物研究所/山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室，山東濟南250014）

斑馬魚； 中草藥/毒性； 綜述

自20世紀90年代以來國際中藥市場蓬勃發(fā)展，世界各大制藥公司均投入巨資研究中藥。與化學藥物比較，中藥一直被人們認為毒性低、安全。但若使用不當或不能保證原料制劑質(zhì)量，中藥仍會出現(xiàn)較強毒性。因此，提高中藥早期毒性預測的靈敏度和可靠性已成為中藥行業(yè)的迫切需求。在此大趨勢下斑馬魚這一新的生物型模憑借獨特優(yōu)勢已逐步成為中藥研發(fā)過程中的毒性評價的重要工具。

1 斑馬魚模型的生理特征

斑馬魚屬小型熱帶魚類，體側從頭至尾遍布藍色條紋，形似斑馬，因此得名。繁殖周期較短，受精約3個月即可性成熟，5個月可至體成熟，一年四季均可產(chǎn)卵，雌魚每次產(chǎn)卵可達200多枚。斑馬魚體外受精、體外發(fā)育；胚胎透明，整個發(fā)育過程清晰可見。受精約120 hpf（hours post fertilization，受精后小時）后斑馬魚各組織、臟器均已發(fā)育完全。2005年斑馬魚全基因組測序成功。在此基礎上英國Sanger研究所在2013年完成了斑馬魚參考基因組[1]。比較斑馬魚與人類基因組的異同可發(fā)現(xiàn)，斑馬魚與人類基因組具有高達87.0%相似性，約70.0%人類基因至少有一個明顯的斑馬魚同源基因[1]。在信號通路傳導、蛋白質(zhì)功能和生理結構等方面斑馬魚與人類比較，也表現(xiàn)出很高的保守性[2]。斑馬魚現(xiàn)已被美國國家衛(wèi)生研究院列為繼人類和小鼠后的第三大模式生物。

2 斑馬魚模型在中藥毒性研究中的優(yōu)勢

中藥成分復雜、配伍多變、不同劑型對療效的影響各不相同，因此，在中藥毒性研究過程中存在許多困難，如常用中藥與有毒中藥的安全劑量范圍、毒性靶器官、量-毒效應范圍、最小有毒劑量與有效劑量等均不明確。目前，在中藥毒性研究領域常以細胞或嚙齒類動物作為模型[3]。以細胞作為模型進行體外實驗，雖然具有快速、高效等優(yōu)點，但細胞培養(yǎng)對環(huán)境的要求較高，體外模型研究結果的種屬差異性較大。有些中藥的毒性作用需在體內(nèi)經(jīng)代謝轉化后才能顯現(xiàn)，而細胞模型由于無法模擬以上過程，因此，不能在機體水平對中藥安全性進行綜合評價。以嚙齒類動物作為研究對象進行體內(nèi)實驗，雖然具有結果可靠、綜合全面等優(yōu)點，但研究周期長、所用動物多、用藥量大，且嚙齒類動物需解剖才能觀察到靶器官，因此，無法實現(xiàn)中藥毒性的高通量快速篩選。

有研究發(fā)現(xiàn)，在中藥毒性研究中斑馬魚模型兼具細胞實驗的高通量性和嚙齒類動物實驗的高內(nèi)涵性等雙重優(yōu)勢[4]。由于斑馬魚體積較小、產(chǎn)卵量大、繁殖周期短且易于養(yǎng)殖，因此，利用斑馬魚對中藥毒性進行研究可在細胞培養(yǎng)板中進行大規(guī)模同步實驗，且藥物用量少，實驗周期短、成本較低；整個實驗過程易于觀察與操作，可實現(xiàn)微孔板高通量自動篩選[5]。由于斑馬魚胚胎透明、發(fā)育快速，因此，可借助顯微鏡直接觀察各發(fā)育時期藥物對內(nèi)臟組織的毒性作用。在毒理學實驗中通過這種直接觀察的方式可從多角度獲得更多的實驗數(shù)據(jù)，更有利于評價毒理學實驗的終點[6]。在基因、蛋白和生理結構等多重層次方面由于斑馬魚與人類均非常相似，因此，以斑馬魚作為實驗動物對中藥的毒性進行研究，所得實驗結果真實可靠，完全適用于人類。有研究結果顯示，斑馬魚模型對藥物致畸性、發(fā)育毒性、心血管毒性、肝臟毒性、神經(jīng)毒性的評價結果與人體實驗的一致性可達80.0%以上[7]。此外，利用斑馬魚模型可對中藥毒性進行體內(nèi)研究，便于研究人員分析中藥在機體內(nèi)部的生物積累、物質(zhì)代謝及生物轉化等動態(tài)過程，方便對中藥致毒機制的進一步分析，實現(xiàn)高內(nèi)涵性的毒性研究。雖然出于動物保護條例等因素，目前，各國特別是歐盟對實驗動物的使用進行了限制；但在斑馬魚研究領域，其受精120 hpf前的胚胎通常不被看成是動物個體[8]。因此，從這一角度看，在中藥毒性研究領域斑馬魚模型與嚙齒類動物比較，也更具有優(yōu)勢。

3 基于斑馬魚模型的中藥發(fā)育毒性研究

斑馬魚胚胎透明，體外發(fā)育，最早即是作為模式生物用于發(fā)育遺傳學領域的研究[9]。1996年歐洲經(jīng)濟合作與發(fā)展組織將斑馬魚胚胎檢測技術列為測定單一化學物毒性的標準方法之一。在發(fā)育毒性研究中常用的斑馬魚毒性檢測指標包括胚胎死亡率、胚胎畸形率、卵黃囊

水腫、色素形成、卵凝結、尾部延展、頭部形態(tài)、體節(jié)形成等[10]。應用上述檢測指標，以發(fā)育6～72 hpf的斑馬魚胚胎作為實驗對象發(fā)現(xiàn)，與哺乳動物體內(nèi)毒性評價技術比較，斑馬魚胚胎對化合物毒性檢測的特異性可達70.0%～80.0%；靈敏度更是高達80.0%以上[5]。Ton等[11]發(fā)現(xiàn)，應用斑馬魚胚胎對非致畸化合物的發(fā)育毒性進行評價，準確率可達75.0%；致畸化合物的毒性評價準確率更是高達100.0%。

中藥雖然具有成分復雜、毒性靶器官不明確等特點，但以斑馬魚胚胎作為實驗動物仍能對發(fā)育毒性進行準確、快速評價。He等[12]發(fā)現(xiàn)，大黃素可影響斑馬魚胚胎存活率和孵化率，造成軀干彎曲、卵黃囊水腫等。陳怡君等[13]發(fā)現(xiàn)，麝香酮可引起斑馬魚胚胎心包水腫、脊柱彎曲、卵黃囊水腫等。2016年何育霖等[14]發(fā)現(xiàn)，紫草對各發(fā)育階段斑馬魚均具有致死作用，1.0 mg/L紫草可抑制胚胎發(fā)育，造成斑馬魚胚胎體節(jié)數(shù)量減少、尾部畸形、身體彎曲、黑色素減少等。

4 基于斑馬魚模型的中藥心血管毒性研究

心血管毒性是制約藥物研發(fā)的重要因素之一。藥物心血管毒性的主要臨床表現(xiàn)為心律失常、心瓣膜損害、心肌缺血等。目前，常用的臨床前心血管毒性研究方法中離體心臟灌注成本較高，原代心肌細胞培養(yǎng)種屬差異性較大，清醒動物遙測技術不適于早期評價。斑馬魚心血管系統(tǒng)與人類非常類似，發(fā)育過程可分為5個階段，受精22 hpf時心臟開始具備收縮功能，48 hpf時心臟結構基本形成，心律趨于穩(wěn)定[15]。在整個發(fā)育過程中由于斑馬魚胚胎透明，因此，其心臟結構清晰可見；經(jīng)藥物處理后可直接在光學顯微鏡下觀察藥物對斑馬魚心血管系統(tǒng)的致毒作用，分析藥物誘導引起的心包水腫、心律失常、血栓形成、血流改變等情況。借助微電極還可同時對斑馬魚心室肌細胞的復合動作電位和心電圖進行監(jiān)控[16]，明確藥物對斑馬魚心律、心肌和心室發(fā)育等的影響。另外，通過轉基因技術，現(xiàn)已構建完成多種心臟、血管或血細胞等特異表達熒光蛋白的轉基因斑馬魚模型。以上述轉基因斑馬魚為實驗動物，借助熒光顯微鏡，可更為清楚地看到藥物對斑馬魚心血管系統(tǒng)中各毒性檢測指標的影響。按照歐洲替代方法驗證中心的替代動物驗證標準，斑馬魚模型預測藥物心血管毒性的靈敏度為78.0%～100.0%，特異性為77.0%～100.0%[17]。

史美娟等[18]對98份中藥心血管毒性文獻進行分析后發(fā)現(xiàn)，含有苷類和生物堿等成分的中藥多能引起心血管毒性。胡占英等[19]以發(fā)育144 hpf的斑馬魚胚胎為模型進行研究發(fā)現(xiàn)，長春新堿具有心臟發(fā)育毒性，質(zhì)量濃度為25 μg/mL時會造成斑馬魚胚胎瘀血、體長變短、圍心囊腫大等。方芳等[20]利用不同質(zhì)量濃度烏頭堿處理48 hpf斑馬魚胚胎后發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度10 mg/L以上的烏頭堿可造成胚胎心包囊水腫、血細胞堆積、心膜出血等；烏頭堿處理12 h后斑馬魚胚胎心率將受影響。長春新堿和烏頭堿均屬中國傳統(tǒng)中藥的生物堿類成分。因此，上述斑馬魚實驗所得結果與中藥心血管毒性的文獻報道一致，也進一步說明斑馬魚非常適于中藥心血管毒性的研究。

5 基于斑馬魚模型的中藥肝臟毒性研究

肝臟是人類身體內(nèi)以代謝為主的一個器官，負擔著幾乎所有外來物質(zhì)的代謝和解毒作用。藥物導致的肝臟毒性多表現(xiàn)為肝細胞損傷，臨床表現(xiàn)類似于病毒性肝炎。據(jù)不完全資料分析，由中藥及其制劑所導致的肝損傷占臨床藥物性肝損傷的4.8%～32.6%[21]。斑馬魚的肝臟與人類類似，不僅具有分泌膽汁、合成蛋白質(zhì)的功能，還能中和分解有毒物質(zhì)。斑馬魚受精48 hpf時肝臟形態(tài)基本形成；受精72 hpf后肝臟形態(tài)及功能全部發(fā)育成熟[22]。斑馬魚肝臟對藥物的介入非常敏感，肝臟毒性藥物極易使其生理結構發(fā)生改變。由于在早期發(fā)育階段斑馬魚胚胎透明，因此，在光學顯微鏡下可直接對其肝臟進行觀察；結合斑馬魚整體圖像分析技術，利用肝臟面積、卵黃囊吸收延遲和肝臟變性程度等多項指標可對藥物的肝臟毒性進行定量分析。除此之外，斑馬魚肝臟中還存在多種脂質(zhì)代謝酶和氧化酶體增殖物受體，且可通過酶的誘導和氧化應激等方式對外源物質(zhì)進行防御[23]。因此，以斑馬魚為模型，對藥物的肝臟毒性進行研究時可通過細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶檢測、脂質(zhì)過氧化檢測、鈣離子成像檢測等對藥物的致毒機制進一步分析。已有研究顯示，斑馬魚對藥物肝臟毒性檢測的準確率可達100.0%[24]。

有研究表明，中藥肝臟毒性的主要作用機制包括CYP450酶代謝異常、脂質(zhì)過氧化損傷、鈣離子平衡失調(diào)等。上述毒性機制均可通過斑馬魚模型進行分析驗證。鄭潤凱等[25]對飛機草提取物的毒性進行研究時發(fā)現(xiàn)，95%乙醇提取物具有肝臟毒性，會造成斑馬魚肝臟界限模糊，肝細胞腫脹、壞死。

6 基于斑馬魚模型的中藥腎臟毒性研究

腎臟為多種藥物進行排泄過濾的場所，因此，在濾過、重吸收、排泄等過程中藥物非常容易對其造成損傷。2000年5月、2001年4月美國食品藥品管理局2次發(fā)布公告提醒醫(yī)藥專業(yè)人士注意植物中具有腎臟毒性的相應成分。2001年11月至2012年4月我國國家藥品不良監(jiān)測中心發(fā)布了《藥品不良反應信息通報》，共涉及51種中藥材及制劑；被通報腎臟毒性的中成藥約占總通報中成藥的1/3。腎臟毒性已成為制約中藥發(fā)展的重要因素之一。常用的藥物腎臟毒性研究方法多以哺乳動物為模型，通過血、尿等生化指標的檢測和腎臟組織病理學觀察等對藥物毒性進行評價。這些實驗過程周期較長，成本較高，且哺乳動物模型對輕、中度腎臟毒性的靈敏度不高。斑馬魚腎臟屬于原腎，雖然結構相對簡單，但

其功能及構成腎小球的細胞類型均與人類非常類似。受精約40 hpf時斑馬魚前腎即具有濾過功能，96 hpf時腎臟濾過的超微結構發(fā)育完全。當斑馬魚腎功能受損后由于無法調(diào)節(jié)滲透壓會產(chǎn)生嚴重水腫，腎小球濾過功能也將受影響。斑馬魚胚胎受精168 hpf內(nèi)由于鰓還未發(fā)育完全，主要依賴腎臟排出體內(nèi)代謝廢物和多余水分，加之該階段仔魚不必喂食即可存活，因此，干擾因素少，非常便于開展腎臟毒性相關研究。在該階段加藥處理可直接在光學顯微鏡下觀察斑馬魚腎包膜水腫、腎臟扭曲等情況；通過計算胚胎體內(nèi)菊粉等類似物的清除速率，還可對腎小球濾過功能進行分析。除此之外，借助免疫組織化學或病理切片等技術可觀察斑馬魚腎單位、腎小球等組織形態(tài)改變，方便對藥物毒性的進一步分析。

馬兜鈴酸為硝基菲類有機酸，多種中藥中均含有該成分。近年來，隨著大量臨床報道，馬兜鈴酸引起的腎臟毒性陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。2012年Ding等[26]和2015年王雪等[27]分別以斑馬魚作為模型，對馬兜鈴酸腎臟毒性進行了研究，結果顯示，馬兜鈴酸能誘導斑馬魚腎臟出現(xiàn)畸形，造成腎小管上皮排列紊亂。當其劑量增加時可明顯降低斑馬魚腎小球濾過率，結果與中藥腎臟毒性臨床報道一致，說明斑馬魚模型非常適用于中藥腎臟毒性的研究。

7 小結與展望

作為毒理學常用的替代型模，斑馬魚在中藥毒性研究中的應用尚處于探索階段。目前，利用斑馬魚模型對中藥毒性進行的研究很大部分只是針對單體化合物進行篩選和評價。而中藥復方中的化學成分極其復雜，一個復方可能包含幾百種化合物；各化合物可能通過多種途徑、對機體的多個靶點同時造成毒性。因此，如何利用斑馬魚模型對中藥復雜成分之間的相互作用進行分析、明確復方中各成分的具體作用靶點和毒性機制尚需進一步研究。

總體而言，斑馬魚模型是一種能簡單、快速研究中藥毒性的生物模型。隨著生物科技的不斷發(fā)展，斑馬魚模型在中藥毒性研究領域的應用前景將更為廣闊。

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A

1009-5519（2016）22-3467-03

2016-07-21）

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