李　濤，David Cooper KC綜述，王　毅△審校（.南華大學附屬第二醫(yī)院腎移植科，湖南衡陽4000；.The Thomas E.Starzl Transplantation Institute，University of Pittsburgh，Pittsburgh，PA，USA，56）

轉(zhuǎn)基因豬對異種移植的影響研究

李濤1，David Cooper KC2綜述，王毅1△審校
（1.南華大學附屬第二醫(yī)院腎移植科，湖南衡陽421000；2.The Thomas E.Starzl Transplantation Institute，University of Pittsburgh，Pittsburgh，PA，USA，15261）

移植，異種；豬；轉(zhuǎn)基因；凝血功能；炎癥；人類補體調(diào)控蛋白；綜述

對于器官衰竭的患者來說，器官移植是最好的治療手段。盡管在過去的50年做了很大的努力，但這個問題仍未完全解決，事實上還有很多新的問題?？v觀20世紀，有人嘗試用動物器官作為臨床移植器官的來源［1-2］。這些動物一般為非人類靈長動物（nonhuman primates，NHPs）。通過一些使用NHPs作為供者的實驗發(fā)現(xiàn)，移植器官的生存時間都很短，經(jīng)常只存活幾分鐘，最長也只持續(xù)幾天。人們開始認識到NHPs不是很適合成為器官及細胞的供者。因此，在20世紀末期，人們開始將注意力轉(zhuǎn)移到豬身上，用豬作為器官及細胞的供者，盡管豬的免疫障礙遠遠大于NHPs，但是豬作為供者有很大優(yōu)勢，特別是在目前這個基因時代，轉(zhuǎn)基因豬孕育而生，給豬-人類提供了無限的前景。本文對轉(zhuǎn)基因豬與影響異種移植物存活條件的因素進行綜述，為未來的臨床異種移植研究提供參考。

1　轉(zhuǎn)基因豬誕生背景

據(jù)研究報道，我國每年等待器官移植的患者超過150萬人，但其中僅有1萬人能夠幸運的等到供體，而異種移植卻能解決供需不平衡，并且豬被認為是最合適的供體［3］。未經(jīng)過基因處理過的豬，不能很好地阻止移植器官及細胞受到靈長動物免疫系統(tǒng)的攻擊，這類豬被稱之為野生型。野生型豬的器官移植到NHPs發(fā)生廣泛的超急性排斥反應，類似于沒有經(jīng)過處理的人類血型不相容器官移植。在同種移植中，當受者對供者人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）高度敏感，有較高梯度的群體反應性抗體，即有可能發(fā)生超急性排斥反應。免疫抑制藥物治療很難阻止野生型豬的器官不發(fā)生超急性排斥反應。

20世紀80年代，發(fā)現(xiàn)豬器官的識別抗原在豬血管內(nèi)皮細胞上。為了延長器官的生存，通過血漿置換去除受者免疫球蛋白。這種方法在人類血型不相容器官移植中取得了成功［4-6］。因此，人們設(shè)想將這種方法用于異種移植中［7-8］。然而異種移植（豬-靈長動物）的機制遠遠比靈長動物ABO血型不相容復雜，持續(xù)抗豬抗體產(chǎn)生，同時凝血功能紊亂、炎性反應等多種因素導致移植器官的衰竭及發(fā)生急性體液性異種移植排斥反應（acute humoral xenograft rejecton，AHXR）。因此，基因工程豬對異種移植有深遠的意義。

2　α-1　，3　-半乳糖抗原（Gal抗原）敲除豬

人類抗豬細胞抗體的識別位點在豬血管內(nèi)皮上，即Gal抗原，這是在異種移植上具有歷史意義的重要發(fā)現(xiàn)［9］。人們嘗試用免疫親和柱等免疫吸附特異性去除受者抗Gal抗體［10］，但是結(jié)果與血漿置換效果相差無幾。雖然能推遲器官排斥，但是沒有真正延長器官的存活時間，即使聯(lián)合免疫抑制藥物治療也沒能阻止T細胞介導的抗體反應，移植物幾天則失去功能。

當基因敲出技術(shù)成熟后，人們想到將基因工程運用到異種移植中。Gal抗原轉(zhuǎn)移酶能加強Gal抗原在豬內(nèi)皮細胞的表達。人們將豬Gal抗原轉(zhuǎn)移酶敲除（GTKO）后，把這種轉(zhuǎn)基因豬作為器官供者，選擇表達低濃度抗豬抗體的狒狒作為受者，移植物心臟和腎臟的存活時間明顯延長［11-16］。Tseng等［17］將敲出Gal抗原豬的心臟移植給8只狒狒，并配合使用抗體、阿司匹林等，結(jié)果6只狒狒存活了2～6個月。上述研究為異種移植開拓了新的里程碑。

3　人類補體系統(tǒng)

在轉(zhuǎn)基因豬中，首先要克服的是組織靈長動物補體對移植物的攻擊。當致病細菌存在于人類血液里，人類補體系統(tǒng)會像瀑布一樣激活，然而卻不會傷害人類本身組織。這是因為人類內(nèi)皮細胞血管可表達人類補體調(diào)節(jié)蛋白（human complement-regulatory protein，CRPs）。野生豬也表達豬補體調(diào)節(jié)蛋白，但不能很好地阻止豬細胞不被人類補體攻擊［18］。因此，意味著通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將表達人類CRPs基因?qū)胴i中，如CD46、CD55、CD59，能很好地保護移植物不受NHPs補體的攻擊。

在20世紀90年代，第一個表達人類CRPs，即表達CD55［19-22］豬成功培養(yǎng)，CD55也叫做DAF，是補體激活調(diào)節(jié)因子中的一員，它是補體活化經(jīng)典通路的主要調(diào)節(jié)因子，表達于所有血清中的細胞。活化的CD55不僅是補體系統(tǒng)的抑制劑，而且廣泛地表達于惡性腫瘤。同時表達CD46轉(zhuǎn)基因組成功培養(yǎng)，相信不久的將來，更多的表達人類補體蛋白的基因?qū)晒胴i中。

4　非Gal抗原敲除豬

豬器官移植物內(nèi)皮細胞上除了表達Gal抗原外，同時還表達非Gal抗原，即使Gal抗原被敲出，仍有抗體與血管內(nèi)皮上非Gal抗原結(jié)合，從而導致排斥反應。因此，人們通過很多努力去研究非Gal抗原的結(jié)構(gòu)。直到1990年左右，才被人們認識，其中一種為N-羥己硫神經(jīng)氨酸（NeuGc）。該抗原在豬身上表達，同時也在猩猩和亞洲猴子身上表達，而不在人類表達。因為人類不表達該抗原，所以產(chǎn)生抗NeuGc抗原抗體。因此可以說，NeuGc抗原是臨床異種移植的一重要影響因素。因為豬和NHPs均表達該抗原，因此不適用于豬移植到NHPs的實驗。

最近，不表達Gal及NeuGc抗原豬已近培育出來［23-24］，在試管實驗中，用人類血漿和豬細胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)人類補體與GTKO/NeuGcKO豬細胞結(jié)合少于與單獨GTKO豬的結(jié)合［25］。因此，培育Gal和NeuGc均不表達的豬對于臨床異種移植有重要意義。

第2個重要的非Gal抗原被發(fā)現(xiàn)，為β1，4N-乙酸氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶［26］。狒狒和大多數(shù)人類會產(chǎn)生與抗原結(jié)合的抗體。有證據(jù)表明，不表達這種抗原的豬細胞能減少人類血清抗體與之結(jié)合［25］。這種抗原也不在NHPs上表達，該抗原被敲出的豬也可能用于異種移植實驗，Tector的團隊已經(jīng)培育出Gal、NeuGc、β1，4N-乙酸氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶敲出的豬［25］。

5　表達人類凝血功能調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)基因豬

抗非Gal抗體、抗Gal抗體、補體沉積、先天免疫細胞激活的內(nèi)皮細胞可導致血管微血管病和器官衰竭的發(fā)生［27-29］。纖維蛋白和血小板在移植器官血管中沉積，導致凝血因子等消耗，從而發(fā)生凝血功能紊亂。這將導致自發(fā)性的出血，如消化道出血等。

豬-人類靈長動物的器官移植能加強血管內(nèi)皮細胞的激活，從而導致血栓微血管病變。例如，豬組織因子抑制途徑不能成功抑制靈長動物Ⅹa因子。豬的血栓調(diào)節(jié)蛋白不能催化激活靈長動物蛋白C。同時，豬的血管性血友病因子又與過多的靈長類血小板聚集有關(guān)。凝血機制很復雜，不僅僅是組織因子在豬內(nèi)皮細胞的高度表達和組織因子激活的增強，更是豬的血管內(nèi)皮細胞直接暴露在靈長類的血小板和單核細胞下，從而激活組織因子。

因此，可以考慮通過轉(zhuǎn)基因豬來克服這些凝血差異［30］。培養(yǎng)能表達人類凝血調(diào)節(jié)蛋白的豬，例如：血栓調(diào)節(jié)蛋白、血管內(nèi)皮細胞C受體、組織因子途徑抑制物、CD39、CD73等［31-34］。多轉(zhuǎn)基因豬，而且多種抗凝血轉(zhuǎn)基因豬已近培養(yǎng)成功［30］。

6　表達人類炎癥調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)基因豬

越來越多的證據(jù)表明，在豬器官移植物失敗的過程中，炎癥扮演了重要角色，免疫反應與炎性反應往往是同時發(fā)生的，一些炎癥因此會促進免疫細胞的活化，誘導免疫細胞釋放細胞因子，加重炎性反應，同時，炎性反應也會影響免疫反應。Ezzelarab稱之為異種移植物受者的系統(tǒng)炎性反應 （systemic inflammatory response in xenograft recipient，SIXR）。IL-6在炎性反應中扮演了重要角色，T細胞及巨噬細胞分泌IL-6，刺激免疫應答。同時，纖維蛋白的形成及裂解是炎癥表達的一部分，纖維蛋白的降解過程，包括D-二聚體，對炎性反應的急性反應、IL-6分泌有一定的影響。

其他細胞因子及趨化因子也參與其中。所以，培養(yǎng)含有人類抗炎基因的轉(zhuǎn)基因豬是很有意義的。人們已發(fā)現(xiàn)血紅素氧合酶-1（HO-1）、A20能起到抗炎作用。在GTKO/hCRP轉(zhuǎn)基因豬培養(yǎng)成功后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因豬表達A20 或HO1是可能的［35-37］。

7　抑制T細胞免疫適應反應轉(zhuǎn)基因豬

即使運用其他轉(zhuǎn)基金豬器官作為供者來源，也難以避免適應性T細胞反應，包括同種及異種移植。因此，有效的藥物免疫抑制方案被運用于移植中，例如他克莫司、環(huán)孢素、MMF等，甚至是聯(lián)合運用。這些方案可適用于同種移植，但是在異種移植中卻不能成功，除非給予大劑量的藥物，這必然會增加藥物所帶來并發(fā)癥的危險，如感染等。

然而，最新研究發(fā)現(xiàn)，阻止T細胞共同刺激路徑已經(jīng)在異種移植中取得了成功。比如：（1）CD40/CD154 T細胞共同刺激途徑，通過抗CD154單克隆抗體抑制該通路，能有效阻止激發(fā)抗體反應。但是該抗體能引起同種及異種移植血栓的形成，因此，不適合用于臨床?？笴D40單克隆抗體，同樣能阻止CD40/CD154 T細胞共同刺激途徑，在Iwase等［38］和Iwase等［39］實驗小組的異種移植中，該抗體有很好的作用。（2）B7/CD28 T細胞共同刺激途徑，通過CTLA4-Ig（abatacept）和（belatacept）可以阻斷該通路。更少的免疫藥物治療能維持移植器官功能是最好的，能減輕其帶來的并發(fā)癥。因此，通過基因工程直接組織T細胞適用性應答是最好的手段。Phelps和他的同事在2009年已經(jīng)將CTLA4-Ig誘導到豬身上。在同種移植實驗中，接受表達CTLA4-Ig基因豬器官的受者，血液中含CTLA4-Ig的濃度是通過藥物CTLA4-Ig的很多倍，因此，該實驗相當成功。另外，將人類CD47基因?qū)胴i，CD47又稱“免疫躲避”蛋白，能使含該基因的豬細胞躲避人巨噬細胞的激活和吞噬［40］。目前，CD47轉(zhuǎn)基因豬已培育成功。

8　結(jié)　語

雖然轉(zhuǎn)基因豬有很大的優(yōu)勢，然而轉(zhuǎn)基因豬仍存在一直困擾人們數(shù)年的問題，即豬器官中潛在的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，在豬身體里面不會有毒性，但當豬的細胞和人的細胞接觸時，這種病毒會從豬的基因組進入人的基因組中，從而導致人感染，更重要的是擔心這些內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒在人類中互相傳播，異種病毒傳播最典型的例子就是艾滋病病毒（一種逆轉(zhuǎn)錄病毒）從靈長類動物傳播到人類。人類沒有天然抗這種豬病毒的免疫機制。人們隔離供者豬，同時嚴密監(jiān)測，有些病毒可以通過監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，然而有些病毒卻不能。最近令人興奮的消息是，美國《Nature》雜志網(wǎng)絡(luò)報告，有學者利用一種新的基因編輯技術(shù)，敲出了豬基因組中可能有害的病毒基因。

目前，在中國廣州轉(zhuǎn)基因豬的眼角膜已用于人類臨床移植。異位心臟移植物在NHPs中能保持很好的功能超過12個月，可取代心臟移植在NHPs中能存活近2個月。轉(zhuǎn)基因豬的胰島細胞移植到患有糖尿病的NHPs中，正常血糖維持超過1年，且豬的胰島素跟人類胰島素很相似。轉(zhuǎn)基因豬-NHPs腎移植最長存活時間超過12個月，且死于感染，腎功能仍保持良好。然而肝臟移植在NHPs中，移植物功能僅僅能維持幾天，這是因為特殊的凝血功能紊亂問題，特別是豬移植物血管內(nèi)皮細胞及Kupffer細胞，細胞吞噬受者血小板。

在這個醫(yī)學飛速發(fā)展、器官移植盛行的時代，基因工程高速發(fā)展，相信在不久的將來，轉(zhuǎn)基因豬異種移植能取代同種移植，成為治療終末期器官衰竭的重要治療途徑。

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（2015-12-07）