管媛媛，張宏如，張皓然，顧一煌

麥粒灸對自發(fā)性高血壓大鼠血壓及mTOR蛋白表達的影響

管媛媛，張宏如，張皓然，顧一煌

目的 觀察麥粒灸對自發(fā)性高血壓大鼠血壓及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表達的影響，以對其降壓機制作初步探討。方法 將12周齡的自發(fā)性高血壓大鼠隨機分為模型組、麥粒灸組，另取12周齡SD大鼠設為正常組。干預前測量每只大鼠血壓，并記錄。各組相同環(huán)境飼養(yǎng)。模型組、正常組不施灸，麥粒灸組每天同一時間段取“足三里”“曲池”進行麥粒灸治療，每穴灸5壯，每日1次，共28 d。末次施灸結束，再測各組大鼠血壓變化并記錄。取各組大鼠心臟，用Westernblot檢測心肌組織mTOR表達水平。結果 12周時，模型組和麥粒灸組血壓明顯高于正常組(P<0.01)，模型組和麥粒灸組血壓差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。16周時，麥粒灸組血壓明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。麥粒灸組mTOR蛋白表達明顯升高，與模型組和正常組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論 麥粒灸可能通過調控mTOR蛋白的表達，降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓。

高血壓；麥粒灸；雷帕霉素靶蛋白；足三里；曲池；眩暈

高血壓病是常見的心血管疾患之一，近年來，發(fā)病率逐步上升，對原發(fā)性高血壓采用降壓藥物治療仍是目前的普遍治療方法，但有藥物副反應多，病人對藥物依賴性強等缺點。已有的研究表明，灸法治療高血壓病具有改善臨床癥狀，操作簡單方便，不良反應少，有效安全等特點。但艾灸降血壓機制尚待深入研究。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是存在于胞漿中的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，與細胞的生長、分裂、存活、遷移、自我更新和細胞周期進程等生理過程密切相關，是細胞生長和增殖的關鍵調控因子。生物醫(yī)學資料證明，高血壓的發(fā)病機制與氧化應激密切相關，而mTOR受活性氧調控，根據氧化應激的程度，它可以引起細胞增殖、生長停止、衰老、凋亡或壞死[1]。本研究以自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)為模型，以麥粒灸為干預手段，觀察實驗前后大鼠血壓以及蛋白表達變化，進一步探索艾灸降血壓的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 12周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠20只，同周齡雄性SD大鼠10只。由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證編號：SCXK(京)2012-0001，合格證編號：11400700098261。所有SHR大鼠隨機分為模型組和麥粒灸組各10只。同周齡雄性SD大鼠設為正常組。

1.2 干預方法 各組相同環(huán)境飼養(yǎng)。模型組、正常組不施灸，麥粒灸組于每天同一時間段進行艾灸治療，將40∶1的金艾絨制作成麥粒大小的灸炷，用特制的大鼠固定板固定好大鼠，取大鼠 “曲池”“足三里” 剪毛后進行艾灸，取穴方法參照《實驗針灸學》[2]，每穴灸5壯，每日1次，共28 d。

1.3 血壓的測定 通過智能無創(chuàng)血壓計(NIBP，澳大利亞)；分別于12 周齡和16周齡，在大鼠清醒安靜狀態(tài)下，將大鼠固定于特制的鐵絲套中，套上加熱器，溫度達 37 ℃～40 ℃，加熱10 min～15 min，暴露鼠尾動脈于儀器外，連接血壓計的套管套于尾動脈末端，無創(chuàng)性測定尾動脈血壓。每只測5次，取平均值。本實驗以收縮壓(systolic bloodpressure，SBP)為觀察指標。

1.4 心肌組織mTOR蛋白表達的測定 實驗結束后，處死大鼠，分離心臟，迅速置于液氮，后轉入-80 ℃待測。大鼠心肌組織總蛋白濃度采用 Bradford法測定。小鼠心肌組織中mTOR蛋白用常規(guī)的Westernblot 印跡法測定。 取 70 μg總蛋白加樣于預灌制的8%～15%聚丙烯酰胺凝膠中，在100 V條件下進行電泳2 h，然后電轉移至聚偏氟乙烯 (PVDF)膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，將膜采用AntimTOR蛋白-一抗(美國Abcam公司)孵育過夜。洗膜后接著室溫下將膜用二抗孵育2 h，常規(guī)洗膜后采用增加化學發(fā)光 (ECL)試劑盒顯影曝光對特異性蛋白帶進行半定量分析。采用β-action蛋白作為內對照。

2 結 果

2.1 各組大鼠血壓變化情況 12周時，模型組與麥粒灸組血壓均顯著高于正常組(P<0.01)，模型組和麥粒灸組血壓差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。16周與12周相比，正常組大鼠血壓無明顯變化(P>0.05)，模型組血壓明顯升高(P<0.01)，麥粒灸組明顯降低(P<0.01)；16周時，麥粒灸組血壓明顯低于模型組(P<0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠血壓變化情況(±s) mmHg

2.2 各組大鼠心肌組織mTOR蛋白表達情況 與正常組相比，模型組心肌組織mTOR蛋白表達量低于正常組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；麥粒灸組心肌組織mTOR蛋白表達量明顯上升[(0.33±0.02)比(1.54±0.31)，P<0.01]。與模型組相比，麥粒灸組心肌組織mTOR蛋白表達量上升[(1.54±0.31)比 (0.06±0.04)，P<0.01]。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織mTOR蛋白表達情況

3 討 論

高血壓病是現代醫(yī)學疾病名稱，根據其臨床特點，可將其歸屬于中醫(yī)學“眩暈”“頭痛”等范疇，其病機為風、火、痰、瘀、虛等所致的氣血運行乖戾，臨床表現為肝陽上亢，腎精不足，氣血虧虛，痰濁中阻等證型[3]。自古醫(yī)家就善用灸法治療心血管疾病，如孫思邈在《備急千金方》中記載：“心懊憹微痛，煩逆，灸心俞百壯”。“心痛暴絞急絕欲死，灸神府百壯，在鳩尾正心有忌”。同時現代醫(yī)學表明，艾灸在防治心腦血管疾病[4]、預防化療所致的骨髓抑制[5]、抗疲勞以及調整亞健康狀態(tài)[6]等方面有明顯療效。臨床研究表明，艾灸能夠明顯提高機體總的抗氧化能力，提高過氧化氫酶活性，減少氧自由基(ROS)和丙二醛(MDA)的生成[7]。研究表明，氧化應激是導致心血管結構和功能異常的主要原因之一，與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關系[8]，血管氧化應激的增加已在自發(fā)性高血壓大鼠和其他多種高血壓實驗動物模型中得到了證實。艾灸屬于一種熱刺激，能夠誘導應激耐受即能夠使機體產生低水平的應激狀態(tài)，從而增強機體耐受抵抗能力。已有研究證實，適度的熱刺激能夠增加生命體抗氧化應激能力，延長壽命，也是生命體生存重要的決定因素[9]。此外，艾灸可以激活熱休克蛋白(HSP)，如HSP60、HSP70[10]，而HSP70能夠減少H2O2誘導的活性氧(ROS)的積累[11]；哺乳動物mTOR是另一種存在于哺乳動物中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過激活下游與代謝應激密切相關的分p70S6K、HIF-1α等，調控生長周期、血管生成、線粒體代謝等多種分子信號，調控細胞生長[12]。研究證明，mTOR受活性氧調控，根據氧化應激的程度，它可以引起細胞增殖、生長停止、衰老、凋亡或壞死[1]，高程度氧化應激將抑制骨髓干細胞mTOR活性，及其下游蛋白p-mTOR、p-p70S6K、p-S6表達[13]。有研究表明，伴隨mTOR水平的降低，機體合成HSP(包括HSP70，HSP90和HSP110)的能力也會大幅度降低[14]。目前，國內外艾灸對mTOR通路及其關鍵分子調控作用的研究鮮有報道，而同為中醫(yī)外治的針刺療法已有相關研究：電針能夠激活阿爾茨海默氏病大鼠海馬區(qū)的AMPK，提高磷酸化AMPK水平，減少p-mTOR 及其下游分子p-p70S60K表達，從而改善小鼠的認知功能[15-16]；而另有研究表明，電針也能通過上調mTOR，提高磷酸化mTOR水平，改善血管性癡呆大鼠的學習和記憶能力[17]。本實驗結果表明，艾灸可明顯提高mTOR蛋白表達。故推測艾灸能通過調控mTOR蛋白，誘導應激耐受，降低血壓實現對心血管保護。具體艾灸如何通過對mTOR蛋白的調控誘導應激耐受，有待于進一步研究。因此，可以推測艾灸降血壓作用的機制可能與mTOR蛋白表達有關。明確mTOR蛋白及其信號通路在灸法治療高血壓中的作用，可為闡明艾灸降血壓的作用機制和尋找特異性治療靶點提供理論基礎和實驗依據。

[1] Lu WC，Chen CJ，Hsu HC，et al. The adaptor protein SH2B1beta reduces hydrogen peroxide-induced cell death in PC12 cells and hippocampal neurons[J]. J Mol Signal，2010，5：17.

[2] 李忠仁．實驗針灸學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：314.

[3] 黎芳，方顯明. 中醫(yī)外治治療高血壓病的機制研究與臨床應用進展[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2005，3(9)：792-794.

[4] Ye X，Zhang H.Influence of moxibustion temperatures on blood lipids， endothelin-1，and nitric oxide in hyperlipidemia patients[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine，2013，33(5)：592-596.

[5] Xu H，Jia Y，Chen J，et al. Current advances in meridians and acupoints for moxibustion in patients with chemotherapy-induced myelosuppression[J]. Tumor，2014，34(6)：564-568.

[6] Zhong D，Tang D，Xue L，et al. Effectiveness of moxibustion for exercise-induced fatigue：a systematic review for randomized controlled trials[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine，2014，20：1-11.

[7] Park H，Kim H，Yoo S，et al. Antioxidant effect of indirect moxibustion on healthy subjects：a pilot study[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine，2012，32(4)：590-595.

[8] Zhang PY，Xu X，Li XC. Cardiovascular diseases：oxidative damage and antioxidant protection[J]. European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2014，18(20)：3091-3096.

[9] Spiró Z，Arslan MA，Somogyvári M，et al. RNA interference links oxidative stress to the inhibition of heat stress adaptation[J]. Antioxidants & Redox Signaling，2012，17(6)：890-901.

[10] Yu J，Peng H，Lin Y，et al. Effect of moxibustion treatment on cell apoptosis and expressions of heat shock protein and second mitochondrial activator of caspase in acute gastric mucosal lesion of rats[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine，2013，33(2)：258-261.

[11] Ghiadoni L，Taddei S，Virdis A. Hypertension and endothelial dysfunction：therapeutic approach[J]. Curr Vasc Pharmacol，2012，10(1)：42-60.

[12] Ding X，Du H，Yoder MC，et al.Critical role of the mTOR pathway in development and function of myeloid-derived suppressor cells in lal(-/-) mice[J]. The American Journal of Pathology，2014，184(2)：397-408.

[13] 黃文秋，黃宏，徐祥，等. mTOR及其下游信號通路在骨髓間充質干細胞氧化應激損傷中的變化及作用[J]. 第三軍醫(yī)大學學報，2013，35(2)：114-118.

[14] Chou SD，Prince T，Gong J，et al. mTOR is essential for the proteotoxic stress response，HSF1 activation and heat shock protein synthesis[J]. PLoS One，2012，7(6)：e39679.

[15] Dong W，Guo W，Zheng X，et al. Electroacupuncture improves cognitive deficits associated with AMPK activation in SAMP8 mice[J]. Metabolic Brain Disease，2014，30(3)：777-784.

[16] 國海東，崔國紅，朱晶，等. 電針對阿爾茨海默病大鼠mTOR信號通路相關蛋白表達的影響[J]. 中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2013，11(7)：843-845.

[17] Zhu Y，Zeng Y，Wang X，et al. Effect of electroacupuncture on the expression of mTOR and eIF4E in hippocampus of rats with vascular dementia[J].Neurological Sciences，2013，34(7)：1093-1097.

(本文編輯郭懷印)

Effects of Moxibustion with Seed-sided Moxa Cone on Blood Pressure and the Expression of mTOR Protein in Spontaneously Hypertensive Rats

Guan Yuanyuan，Zhan Hongru，Zhang Haorang，Gu Yihuang

Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210046，Jiangsu，China Corresponding Author:Gu Yihuang

Objective To observe the effects of moxibustion with seed-sided moxa cone on blood pressure in spontaneously hypertensive rats(SHR) and the expression of mammalian target of rapamycin(mTOR) protein，so as to make preliminary discussion on its anti-hypertensive mechanism.Methods Twenty SHR (12 weeks) were randomly divided into model group，and moxibustion group，10 cases in each one.Another 10 Sprague-Dawley(SD) rats (12 weeks) were set as normal group.Another 10 SD rats of 12 weeks with normal hypertension were regard as control group.The blood pressure of all rats were measured and recorded before the experiment.Rats in all group received identical feeding environment.Rats in model group and normal group did not received moxibustion. Rats in the moxibustion group received moxibustion with seed-sized moxa cone at Zusanli Point and Quchi Point at the same time，5 cones at each acupoint，once a day for 28 days.After the final moxibustion，blood pressure of all rats were measured and recorded again.Western blotting method was used to measure the levels of the expression of mTOR protein in cardiac muscle tissue.Results At 12 weeks，the blood pressure in model group and moxibustion group were higher than that in normal group(P<0.01)，and there was no difference between model group and moxibustion group(P>0.05).After 16 weeks，the level of blood pressure were decreased in moxibustion group，which was lower than that in model group(P<0.01).The expression of mTOR protein was obviously increased in moxibustion group，which was higher than that in model group and normal group(P<0.01).Conclusion Moxibustion with seed-sided moxa cone may reduce the blood pressure in spontaneously hypertensive rats by regulate the expression of mTOR protein.

hypertension；moxibustion with seed-sided moxa cone；mTOR protein；Zusanli Point；Quchi Point

國家體育總局健身氣功管理中心科研項目(No.QG2014046)；江蘇省普通高校研究生實踐創(chuàng)新項目(No.SJLX0438)

南京中醫(yī)藥大學(南京 210046)

顧一煌，E-mail：gyh5196411@163.com

R544.1 R255.3

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2016．04．008

1672-1349(2016)04-0361-03

2015-10-08)