葉震世　高雅玲　巴亞斯古楞　任建林

【摘要】 目的 檢測再生基因4（RegⅣ）在各種胃癌及胃非癌組織中的表達情況， 并探討其可能臨床意義。方法 運用免疫組織化學方法檢測73例胃癌手術(shù)切除標本和90例胃癌及癌旁非癌組織芯片標本中RegⅣ蛋白的表達情況。結(jié)果 RegⅣ在胃黏膜腸化生杯狀細胞呈強陽性染色。腸型胃癌、胃印戒細胞癌、粘液腺癌的癌細胞中呈頻繁免疫反應(yīng)性[分別為100.0%（3/3）、93.3%（14/15）和90.9%（10/11）]。RegⅣ的表達與胃癌的組織分型相關(guān)（P<0.05）， 與胃癌的侵襲參數(shù)（主要包括腫瘤浸潤深度、是否轉(zhuǎn)移及TNM分期等）無明顯相關(guān)性（P>0.05）。RegⅣ在胃印戒細胞癌和粘液腺癌中的表達陽性率分別為40.0%（12/30）和43.3%（13/30）。結(jié)論 RegⅣ在胃黏膜腸化生杯狀細胞、胃印戒細胞癌及粘液腺癌中顯示頻繁的免疫反應(yīng)性， 提示RegⅣ可能參與胃腺癌的“腸”途徑發(fā)生機制。

【關(guān)鍵詞】 胃癌；再生基因4；免疫組化；組織芯片

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.05.016

胃癌是起源于胃上皮的惡性腫瘤， 是影響和威脅人類健康的重要疾病之一；胃癌的發(fā)生、發(fā)展受機體內(nèi)、外環(huán)境等多種因素的影響， 一般經(jīng)歷萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生、腺癌的發(fā)展階段。

再生基因家族是近期研究的熱點之一， 是一群主要在消化系統(tǒng)發(fā)揮作用的小分子分泌蛋白， 它們在組織損傷、炎癥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮多種功能[1]。2001年研究學者首先從炎癥性腸病庫中分離出再生基因4（regenerating islet-derived family member 4， RegⅣ）， 其選擇性表達于胃腸道上皮細胞和胰腺組織， 可能與組織炎癥和腫瘤的發(fā)生有關(guān)[2]。L等[3]發(fā)現(xiàn)RegⅣ在結(jié)直腸腺瘤的分化起始中扮演重要角色。Li等[4]推測RegⅣ的過表達可能是結(jié)直腸癌的早期事件， 且與MUC2和EGFR的磷酸化正相關(guān)。因此， 探討RegⅣ的表達情況及介導的信號通路可能是攻克人類胃腸道腺癌的有效措施之一。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 收集2007年6月～2009年6月廈門大學附屬中山醫(yī)院普外科胃癌切除術(shù)后組織蠟塊標本共73例， 其中男58例， 女15例， 年齡28～84歲， 中位年齡59歲。所有標本按Lauren分型劃分：腸型胃癌31例， 彌漫型胃癌42例；按WHO組織病理分型劃分：管狀腺癌23例， 乳頭狀腺癌3例， 低分化腺癌15例， 印戒細胞癌15例， 粘液腺癌11例， 類癌6例；按TNM分期劃分：Ⅰ期4例、Ⅱ期13例、Ⅲ期32例、Ⅳ期24例。所有病例均經(jīng)病理證實， 且術(shù)前均未經(jīng)過放、化療和免疫治療。

另90例胃癌組織芯片（每例含平均直徑2 mm的2個組織芯， 分別為癌灶及癌旁非癌組織）， 由上海芯超生物科技有限公司合成， 各組織類型均經(jīng)病理證實， 未予放、化療等特殊治療。

1. 2 免疫組織化學染色方法 本院標本經(jīng)常規(guī)固定脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片；組織芯片由上海芯超生物科技有限公司合成。RegⅣ抗體（SANTA CRUZ公司）工作濃度按1∶30稀釋， 突觸素（Synaptophysin， Syn）和嗜鉻粒蛋白A（Chromogranin A， CgA）抗體均為即用型抗體。EDTA修復(fù)液及檸檬酸修復(fù)液分別修復(fù)RegⅣ抗原和Syn、CgA抗原。滴加3% H2O2， 后滴加即用型非免疫正常山羊血清。滴加稀釋后的RegⅣ抗體及Syn、CgA抗體， 置于4℃冰箱孵育過夜。最后與顯色試劑盒反應(yīng)， 出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性反應(yīng)。實驗中均設(shè)陰、陽性對照及石蠟切片蘇木精-伊紅（HE）染色。

1. 3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。WHO組織分型和Laurens分型間比較分別用Kruskal-Wallis H 檢驗和Mann-whitney U 檢驗， 檢驗水準α= 0.05；不同臨床病理學特征間陽性率采用χ2檢驗、Fisher確切概率法或Spearman等級相關(guān)分析法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2. 1 胃癌與胃非癌組織中RegⅣ的表達 RegⅣ在腸型胃癌（杯狀細胞可見圖1）、粘液腺癌、胃印戒細胞癌的癌細胞中呈頻繁的胞漿染色陽性[分別為100.0%（3/3）、90.9%（10/11）和93.3%（14/15）]。6例胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌無一例見RegⅣ表達。而RegⅣ在胃黏膜腸化生上皮細胞呈穩(wěn)定的胞漿染色強陽性（陽性率100%）。

圖1 RegⅣ在腸型胃腺癌中的表達

注：A：RegⅣ在胃中分化管狀腺癌的癌細胞中呈強陽性表達（×200）； B：為對照（HE染色， ×200）

2. 2 不同胃癌組織分型中RegⅣ的表達 相對于乳頭狀、管狀腺癌， RegⅣ在彌漫浸潤型胃癌（粘液腺癌、印戒細胞癌）中顯示更頻繁的免疫反應(yīng)性， 提示RegⅣ的表達與胃癌的組織分型相關(guān)（P<0.05）。但通過對比胃癌的侵襲、浸潤參數(shù)等數(shù)據(jù)， 發(fā)現(xiàn)RegⅣ的表達與胃癌的浸潤深度、轉(zhuǎn)移及TNM分期無明顯相關(guān)性（P>0.05）。

2. 3 胃黏膜組織芯片中RegⅣ的表達 所有癌旁胃黏膜腸化生杯狀細胞均顯示RegⅣ強陽性表達（陽性率100%）（見圖2A、B）， RegⅣ在胃印戒細胞癌和胃粘液腺癌中的表達陽性率分別為40.0%（12/30）和43.3%（13/30）（見圖2C、D）， 30例胃管狀腺癌無一例出現(xiàn)RegⅣ表達（無一例可見杯狀細胞， 陽性率0）。

圖2 RegⅣ在胃癌組織芯片的表達

注：A， B：癌旁萎縮性胃炎：重度腸化生上皮細胞呈RegⅣ強陽性表達（×50， ×100）；C， D：胃粘液腺癌：癌細胞呈RegⅣ陽性表達（×50， ×100）；G， H：（×400）

3 討論

本次研究中， RegⅣ在胃癌前病變（腸上皮化生、不典型增生）呈穩(wěn)定的強陽性表達， 而在胃上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化（粘液腺癌、印戒細胞癌）表達有所減弱；結(jié)合其他學者發(fā)現(xiàn)在胃、結(jié)腸腺瘤中RegⅣ的表達上調(diào)， 推測RegⅣ可能為胃腸道癌前病變及腺瘤的良好生物學標志物。在3例可見杯狀細胞的高至中分化腸型胃腺癌中， 其癌細胞均呈RegⅣ陽性表達；杯狀細胞未見的腸型胃腺癌中無一例呈RegⅣ陽性表達；結(jié)合來源腸粘蛋白表型的胃腺癌與異位表達的CDX2有關(guān)， 及CDX2通過與RegⅣ基因的5端直接作用而啟動RegIV的轉(zhuǎn)錄[5]， 可以推測RegⅣ與胃腺癌的腸表型密切相關(guān)。雖然其作用機制至今未明， 相關(guān)學者總結(jié)RegⅣ可能作為一種生長因子、抗凋亡因子而參與調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)腫瘤細胞的增殖與分化[6]。

研究顯示RegⅣ在不同分化類型的胃腺癌中的表達差異顯著：RegⅣ在粘液腺癌、印戒細胞癌等低分化腺癌中的表達陽性率明顯高于中至高分化的腸型胃腺癌， RegⅣ的表達與胃癌的分化程度有關(guān)。腸上皮化生向杯狀不典型增生的轉(zhuǎn)化與印戒細胞癌的發(fā)生關(guān)系密切， 作者發(fā)現(xiàn)RegⅣ在這些組織細胞中呈頻繁的胞漿染色陽性， 故推測RegⅣ蛋白可能是一種粘液分泌性癌瘤的良好生物學標志物。

在本次免疫組織化學染色研究中， 通過探討RegⅣ在各種胃癌、胃非癌組織中的表達情況及規(guī)律， 作者發(fā)現(xiàn)RegⅣ頻繁表達于胃黏膜腸化生上皮、腸型胃腺癌（杯狀細胞可見）及低分化腺癌中（雖然經(jīng)歷先上調(diào)后輕微下調(diào)的變化趨勢）， 從而推測RegⅣ可能通過“腸”途徑參與胃腺癌的發(fā)生機制， 其可能成為胃腸道癌前病變和粘液性癌瘤的良好生物學標志物。因此， 進一步探討RegⅣ所介導的胃腸道腫瘤發(fā)生、發(fā)展的具體機制將為腫瘤的診斷和治療帶來重大而深遠的意義。

參考文獻

[1] Zhang YW， Ding LS， Lai MD. Reg gene family and human diseases. World J Gastroenterol， 2003， 9（12）：2635-2641.

[2] Hartupee JC， Zhang H， Bonaldo MF， et al. Isolation and characterization of a cDNA encoding a novel member of the human regenerating protein family： RegⅣ. Biochim Biophys Acta， 2001， 1518（3）：287-293.

[3] L B， Xu J， Zhu Y， et al. Systemic analysis of the differential gene expression profile in a colonic adenoma-normal SSH library. Clin Chim Acta， 2007， 378（1-2）：42-47.

[4] Li XH， Zheng Y， Zheng HC， et al. REGⅣ overexpression in an early stage of colorectal carcinogenesis： an immunohistochemical study. Histol Histopathol， 2010， 25（4）：473-484.

[5] Naito Y， Oue N， Hinoi T， et al. RegⅣ is a direct target of intestinal transcriptional factor CDX2 in gastric cancer. PLoS ONE， 2012， 7（11）：e47545.

[6] Numata M， Oshima T. Significance of regenerating islet-derived typeⅣ gene expression in gastroenterological cancers. World J Gastroenterol， 2012， 18（27）：3502-3510.

[收稿日期：2015-10-23]