李燕　朱君

[摘 要] 目的：探討白細(xì)胞介素（IL-1β）與雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細(xì)胞Activin A、Follistatin、Cripto表達(dá)的影響。方法：取25例子宮內(nèi)膜異位癥手術(shù)患者增生期內(nèi)膜標(biāo)本，經(jīng)實(shí)驗(yàn)分離內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，分為4組，分別為IL-1β組（IL-1β500pg/mL）、雌激素組（10-6mol/L 雌激素）、IL-1β+雌激素組（IL-1β500pg/mLl與10-6mol/L雌激素）、空白對(duì)照組（FD培養(yǎng)液）。RT-qPCR和ELISA法，測(cè)定4組Activin A、Follistatin、Cripto的mRNA與蛋白表達(dá)。結(jié)果：IL-1β+雌激素組Activin A、Cripto mRNA表達(dá)水平較其余3組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Follistatin mRNA表達(dá)水平比空白對(duì)照組、雌激素組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但與IL-1β組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-1β+雌激素組Activin A、Follistatin 蛋白分泌比其余3組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Cripto蛋白分泌高于空白對(duì)照組更高（P<0.05）；但與IL-1β組、雌激素組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：IL-1β、雌激素可對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥增生期在位內(nèi)膜Activin A、Follistatin、Cripto的分泌表達(dá)產(chǎn)生影響。

[關(guān)鍵詞] IL-1β；雌激素；子宮內(nèi)膜異位癥；Activin A；Follistatin；Cripto

中圖分類號(hào)：R711.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5200（2016）01-104-03

DOI：10.11876/mimt201601034

子宮內(nèi)膜異位癥是由于活性子宮內(nèi)膜組織（間質(zhì)和腺體）在子宮腔以外的部位出現(xiàn)、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、反復(fù)出血，患者多表現(xiàn)為不孕、痛經(jīng)、盆腔包塊等[1]。該病發(fā)病機(jī)制目前尚不統(tǒng)一，主要有體腔上皮化生學(xué)說(shuō)、經(jīng)血逆流學(xué)說(shuō)、炎癥學(xué)說(shuō)等[2-4]。近年提出的在位內(nèi)膜決定論認(rèn)為內(nèi)膜是內(nèi)異癥發(fā)病基礎(chǔ)[5]。有研究者指出[6-7]，與正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜Activin A及相關(guān)因子（Follistatin、Cripto）表達(dá)相比，子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜存在較大差異。鑒于炎癥反應(yīng)在內(nèi)異癥發(fā)生中發(fā)生作用，本文選取白細(xì)胞介素（IL-1β）與雌激素，分析IL-1β與雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細(xì)胞ActivinA及相關(guān)因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

自新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院2014年1月-2015年5月接診子宮內(nèi)膜癥患者中取25例患者增生期內(nèi)膜標(biāo)本。入選標(biāo)準(zhǔn)：患者經(jīng)術(shù)后病理和陰道超聲診斷，確診為子宮內(nèi)膜癥；月經(jīng)周期規(guī)律；術(shù)前6個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)任何激素類藥物；患者均簽訂知情同意書(shū)。入選患者年齡23～44歲，平均年齡為（32.51±2.47）歲，根據(jù)美國(guó)生育協(xié)會(huì)分期標(biāo)準(zhǔn)，9例為Ⅳ期，16例為Ⅲ期。在位子宮內(nèi)膜主要通過(guò)診斷性刮宮或者宮腔鏡獲取。

1.2 儀器與試劑

電子天平（上海天平儀器廠）；高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司，型號(hào)：TG20-WS）；超凈工作臺(tái)（成都思博特實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：SJ-CJ-1FD）；顯微鏡（上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：DYS-809）。

F-12培養(yǎng)基、胎牛血清、蒸餾水、膠原酶IV、牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液（PBS）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒、瓊脂糖、DEPC等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 子宮內(nèi)膜標(biāo)本漂洗、過(guò)濾、沉降、去除上清液，以含10%胎牛血清FD培養(yǎng)液培養(yǎng)。觀察90%左右瓶壁已經(jīng)長(zhǎng)滿了細(xì)胞，即可行傳代，采用第三代細(xì)胞完成后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 分組 在各子宮內(nèi)膜標(biāo)本內(nèi)依次加入相應(yīng)處理液，分別為：1）IL-1β組：加入500pg/mL濃度IL-1β；2）雌激素組：加入10-6mol/L濃度雌激素；3）IL-1β+雌激素組：向完全培養(yǎng)液中，加入IL-1β500pg/mL與10-6mol/L雌激素；4）空白對(duì)照組：僅10%胎牛血清FD培養(yǎng)液。

1.3.3 Activin A、Follistatin、Cripto測(cè)定 根據(jù)Trizol說(shuō)明書(shū)行細(xì)胞總RNA提取，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀行熒光定量PCR擴(kuò)增，ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量。ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液上清液中Activin A、Follistatin、Cripto蛋白水平，操作均嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求實(shí)施。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本文所有統(tǒng)計(jì)、檢測(cè)數(shù)據(jù)均經(jīng)Excel錄入并采用SPSS11.5軟件處理分析，數(shù)據(jù)均采用標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以單因素方差分析，采用Bonferroni檢驗(yàn)，并行組間比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR測(cè)定Activin A、Follistatin、Cripto的mRNA表達(dá)水平

IL-1β+雌激素組Activin A、Cripto mRNA表達(dá)水平顯著高于其余3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Follistatin mRNA表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組、雌激素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與IL-1β組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.2 ELISA測(cè)定Activin A、Follistatin、Cripto蛋白水平

IL-1β+雌激素組Activin A、Follistatin 蛋白分泌顯著高于其余3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Cripto蛋白分泌顯著高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與IL-1β組、雌激素組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

Activin A屬于TGF-β超家族，其在子宮內(nèi)膜分化、增生、月經(jīng)周期調(diào)控等各個(gè)方面均有參與，同時(shí)也是引發(fā)子宮內(nèi)膜癥和推動(dòng)其發(fā)展主要因子[8]。Activin A與細(xì)胞靶基因啟動(dòng)子區(qū)相互結(jié)合，根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子類型差異，實(shí)現(xiàn)抑制或者促進(jìn)靶基因表達(dá)[9]。Rocha AL等[10]在報(bào)道中指出，Activin A是促使子宮內(nèi)膜異位癥增生期在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖主要因素。除此之外，Activin A還具有促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）增強(qiáng)效果，且通過(guò)MAPK、P38依賴機(jī)制對(duì)VEGF及其受體表達(dá)進(jìn)行上調(diào)，幫助血管快速形成[11]。本研究選取子宮內(nèi)膜異位癥增生期內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，運(yùn)用IL-1β以及雌激素進(jìn)行作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Activin A mRNA與蛋白分泌與空白對(duì)照組比較，均表現(xiàn)出非常明顯依賴性增加，并且當(dāng)其受到IL-1β與雌激素同時(shí)刺激時(shí)，Activin A mRNA與蛋白分泌表達(dá)水平，遠(yuǎn)超過(guò)IL-1β組與雌激素組表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

Follistatin是Activin A抑制因子，其通過(guò)與Activin A相互結(jié)合，對(duì)Activin A與ActRⅡ結(jié)合造成阻礙，從而達(dá)到拮抗Activin A信號(hào)通路作用[12]。已有報(bào)道證實(shí)，在腦膜炎、敗血癥等各種炎癥性疾病中，均發(fā)現(xiàn)有Activin A與Follistatin表達(dá)顯著增加情況[13]。Follistatin表達(dá)增加，可能僅僅致使Activin A出現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)[14]。本研究中，IL-1β與雌激素同時(shí)刺激時(shí)，F(xiàn)ollistatin mRNA與蛋白分泌表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組，但雌激素組Follistatin mRNA與蛋白分泌與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明，雌激素并不能夠?qū)ollistatin mRNA與蛋白分泌表達(dá)水平造成影響，估計(jì)是上述負(fù)反饋調(diào)節(jié)導(dǎo)致。

Cripto是一種小分子糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，屬于EGF-CFC家族，其是當(dāng)前學(xué)界公認(rèn)，參與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展主要因子[15]。Cripto可通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路、激活PI3K/Akt與MAPK信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)細(xì)胞快速增殖、侵襲等，引起和推動(dòng)子宮內(nèi)膜異位癥變化[16]。近期有研究報(bào)道[17]，與正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜相比，子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜增生期Cripto mRNA表達(dá)會(huì)出現(xiàn)明顯下降，但在分泌期卻會(huì)表現(xiàn)出顯著上升，這一理論提出，提出了多種因素均可對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜增生期Cripto表達(dá)與分泌造成影響，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入探討。

目前，子宮內(nèi)膜異位癥治療主要采用性激素抑制藥物，藥物副反應(yīng)使患者生育、經(jīng)期均受到影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-1β與雌激素共同作用，可對(duì)Activin A、Follistatin、Cripto表達(dá)水平及蛋白分泌帶來(lái)影響。通過(guò)對(duì)Activin A、Follistatin、Cripto等因子表達(dá)和分泌進(jìn)行調(diào)控，而不對(duì)雌激素水平進(jìn)行抑制，是否能夠有效改善子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖、侵襲等，并以此實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥治療。

參 考 文 獻(xiàn)

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