?

采用倒置顯微鏡法定量浮游植物的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性*

(1：暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系，廣州 510632)

(2：廣東省水庫藍(lán)藻水華防治中心，廣州 510632)

摘要：浮游植物種類組成細(xì)胞密度或生物量的現(xiàn)存量反映其在水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，準(zhǔn)確地對(duì)水體中浮游植物進(jìn)行定量是水質(zhì)評(píng)價(jià)和生態(tài)功能分析的基礎(chǔ).針對(duì)目前國(guó)際上推薦使用的倒置顯微鏡法(即Uterm?hl計(jì)數(shù)法)，通過采集處于不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和水體條件(水庫和實(shí)驗(yàn)圍隔)中的浮游植物，分析樣品的顯微計(jì)數(shù)量、水體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)對(duì)浮游植物密度和多樣性等指標(biāo)穩(wěn)定性的影響，同時(shí)比較了多個(gè)水體中同一采樣點(diǎn)的重復(fù)(或平行)樣品之間浮游植物定量數(shù)據(jù)的差別，從而對(duì)倒置顯微鏡法進(jìn)行較為系統(tǒng)的評(píng)估.結(jié)果表明，基于浮游植物的顯微鏡計(jì)數(shù)效率與定量數(shù)據(jù)穩(wěn)定性的綜合考慮，選擇計(jì)數(shù)400個(gè)個(gè)體即可基本保證定量數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性；在依賴生物量或稀有種進(jìn)行水質(zhì)評(píng)價(jià)時(shí)，處于不同營(yíng)養(yǎng)水平的水體均需要增加樣品的平行數(shù)來提高定量數(shù)據(jù)的可靠性，貧營(yíng)養(yǎng)型水體中單個(gè)采樣的重復(fù)或平行樣品更為必要；兩種定量方法所得群落數(shù)據(jù)計(jì)算的辛普森指數(shù)無顯著差異，說明兩種方法所獲得結(jié)果均能反映浮游植多樣性；通過樣品濃縮法和倒置顯微鏡法所獲得的浮游植物生物量和細(xì)胞密度均具有顯著差異，因樣品濃縮法在樣品處理過程中造成浮游植物損失，使通過樣品濃縮法所得的浮游植物群落生物量及細(xì)胞密度偏小；相比濃縮法，倒置顯微鏡法沉淀濃縮的水樣體積小，樣品處理和計(jì)數(shù)耗時(shí)短，更適宜用于應(yīng)急監(jiān)測(cè)。

關(guān)鍵詞：浮游植物；倒置顯微鏡計(jì)數(shù)；細(xì)胞密度；生物量；多樣性

浮游植物是水域生態(tài)系統(tǒng)中重要組成部分，其數(shù)量與種類多樣性是水質(zhì)監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[1-3].在每種浮游植物具有相同物理性質(zhì)情況下，理論上我們從采集一定體積的水樣經(jīng)固定濃縮后在顯微鏡下計(jì)數(shù)，然后根據(jù)浮游植物細(xì)胞的形態(tài)按最近似的幾何形態(tài)測(cè)量必要的量度，可以較為準(zhǔn)確地計(jì)算出浮游植物的體積和生物量，這正是傳統(tǒng)濃縮法的原理[4-6].然而由于不同種類的浮游植物具有相同物理性質(zhì)這一假設(shè)通常難以滿足，特別是對(duì)于貧營(yíng)養(yǎng)水體的種類多樣性很高時(shí)，浮游植物的個(gè)體之間細(xì)胞大小、形態(tài)與比重相差很大，計(jì)數(shù)過程中的隨機(jī)取樣具有偏向性，導(dǎo)致最終計(jì)算的浮游植物細(xì)胞密度與生物量有很大偏差，種類豐富度和多樣性指數(shù)也存在明顯的偏差，當(dāng)這些數(shù)據(jù)用于群落分析與水質(zhì)比較時(shí)難以保障結(jié)論的可靠性[7].陳純等系統(tǒng)地分析了浮游植物定量過程中生物量計(jì)算可能產(chǎn)生的誤差[8]，Zarauz等比較分析了活體樣品與加固定劑樣品在生物量上的差別[9].樣品濃縮法經(jīng)過沉淀、濃縮、再隨機(jī)取樣鏡檢等多個(gè)步驟方能完成計(jì)數(shù)工作，每一步驟都會(huì)產(chǎn)生誤差，并耗時(shí)較長(zhǎng).針對(duì)傳統(tǒng)的樣品濃縮法存在的問題，Uterm?hl提出了倒置顯微鏡計(jì)數(shù)方法，也稱為沉淀杯方法或Uterm?hl計(jì)數(shù)法[10].從1978年起聯(lián)合國(guó)教科文組織將倒置顯微鏡計(jì)數(shù)方法編入浮游植物手冊(cè)，該方法已成為國(guó)際上浮游植物計(jì)數(shù)和種類調(diào)查的常規(guī)方法.在理論上，倒置顯微鏡計(jì)數(shù)方法是對(duì)原水進(jìn)行顯微鏡計(jì)數(shù)，減少了濃縮過程的損失，可提供較好的數(shù)據(jù)質(zhì)量.由于需要倒置顯微鏡和特殊的沉淀杯等限制，多數(shù)發(fā)展中國(guó)家仍以傳統(tǒng)的濃縮法為主[11].由于對(duì)倒置顯微鏡法的使用還十分有限，多數(shù)計(jì)數(shù)人員對(duì)該方法及基于該方法所獲得的數(shù)據(jù)可靠性缺少了解，也是限制該方法在我國(guó)推廣的一個(gè)因素。

在倒置顯微鏡計(jì)數(shù)方法中，通過在計(jì)數(shù)杯中直接沉淀達(dá)到濃縮的目的.先將魯哥試劑固定的水樣搖勻后注入沉降管中，蓋好蓋玻片靜置沉淀，靜置時(shí)間在24 h以上[12-13]，或根據(jù)使用的沉降管的高度選擇靜置時(shí)間，確保藻細(xì)胞完全沉降，靜水狀態(tài)下微小浮游植物下沉1cm需要4h[14].再將沉淀好的水樣上清液移除，蓋好蓋玻片(不能有氣泡)，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)沉淀在計(jì)數(shù)杯底座載玻片上的浮游植物[10].Lund等針對(duì)沉淀杯體積建議了沉淀時(shí)間：100ml需沉淀18h，10ml需沉淀3h，1ml需沉淀1h[14].而Willén推薦的沉淀時(shí)間則較長(zhǎng)[15]。

本研究的水樣采集于3座不同營(yíng)養(yǎng)水平水庫的敞水區(qū)以及3種不同處理組的實(shí)驗(yàn)圍隔，這些樣品提供了多樣化的浮游植物群落類型.本文對(duì)沉淀濃縮過程在浮游植物定量結(jié)果中的影響進(jìn)行分析，為采用倒置顯微鏡法的人員和實(shí)驗(yàn)室了解和掌握該方法在沉淀體積、沉淀時(shí)間、計(jì)數(shù)個(gè)體數(shù)等具體操作以及改善數(shù)據(jù)可靠性等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 采樣地點(diǎn)與采樣方法

浮游植物定量樣品采集于3個(gè)不同營(yíng)養(yǎng)水平的大型水庫及3組不同處理的實(shí)驗(yàn)圍隔，3座水庫分別為廣東省廣州市從化區(qū)處于貧中營(yíng)養(yǎng)水平的流溪河水庫(23°45′N，113°46′E)、廣東省茂名市處于中營(yíng)養(yǎng)水平的高州水庫(22°2′N，111°1′E)和廣東省江門市處于富營(yíng)養(yǎng)水平的大沙河水庫(22°30′N，112°21′E)[16].實(shí)驗(yàn)圍隔3個(gè)處理組分別為添加營(yíng)養(yǎng)鹽組、添加魚類組和1個(gè)對(duì)照組，每個(gè)處理組均有5個(gè)平行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)圍隔的體積為90m3[17]。

于2013年5月對(duì)3座水庫進(jìn)行一次性定量分析樣品的采集，同時(shí)測(cè)定了水體的相關(guān)理化指標(biāo)及葉綠素a濃度[18].3座水庫浮游植物定量分析樣品用采水器在敞水區(qū)表層0.5m處采得，采集水樣的體積為10L，混合均勻后分裝350ml和1000ml聚乙烯塑料瓶各5個(gè).350ml的5瓶水樣編號(hào)為a、b、c、d、e，每瓶加3.5ml魯哥試劑固定，采用倒置顯微鏡法進(jìn)行定量計(jì)數(shù)；5個(gè)1000ml水樣加福爾馬林試劑固定，采用樣品濃縮法進(jìn)行定量計(jì)數(shù).2013年7月對(duì)15個(gè)實(shí)驗(yàn)圍隔進(jìn)行一次性采樣，每個(gè)圍隔在表層0.5m處采集350ml水，每瓶水樣加3.5ml魯哥試劑固定，以待下一步的沉淀濃縮和鏡檢。

魯哥試劑配方：20g KI和10g I2溶于200ml蒸餾水[10]。

1.2 樣品處理及計(jì)數(shù)方法

所有水樣的處理和計(jì)數(shù)方法保持一致.根據(jù)水庫的營(yíng)養(yǎng)水平選擇沉淀杯體積：流溪河水庫的樣品選擇50ml沉淀杯，靜置沉降15h；高州水庫的樣品選擇10ml沉淀杯，靜置沉淀3h；大沙河水庫的樣品選擇3ml沉淀杯，靜置沉淀1.5h；圍隔樣品選擇10ml沉淀杯，靜置沉淀3h.通過靜置沉淀濃縮后，移去沉降管及里面的清液，將濃縮在計(jì)數(shù)框底座載玻片上的浮游植物在倒置顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

將計(jì)數(shù)框底座載玻片置于倒置顯微鏡下進(jìn)行浮游植物鏡檢和計(jì)數(shù).首先在10×10倍鏡下對(duì)載玻片上所有體積較大的浮游植物(>20μm)進(jìn)行計(jì)數(shù)；然后在10×40倍鏡下對(duì)較小浮游植物(2～20μm)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)的視野數(shù)量以能計(jì)數(shù)500個(gè)個(gè)體為止，同時(shí)計(jì)數(shù)時(shí)將這500個(gè)個(gè)體分為5個(gè)100的計(jì)數(shù)段，且保證視野在載玻片上均勻分布[9].在計(jì)數(shù)過程中，如碰到某些個(gè)體一部分在視野中，部分在視野外，可只對(duì)出現(xiàn)在視野上半圈的浮游植物計(jì)數(shù)，而出現(xiàn)在下半圈的浮游植物不計(jì)數(shù)，如全部計(jì)數(shù)會(huì)導(dǎo)致定量結(jié)果偏高[5].采用5種個(gè)體計(jì)數(shù)等級(jí)：1代表100個(gè)個(gè)體計(jì)數(shù)量，即從用上述方法在10×40倍下計(jì)數(shù)的5個(gè)100的計(jì)數(shù)段中隨機(jī)抽取一個(gè)計(jì)數(shù)段的個(gè)體；2代表200個(gè)個(gè)體計(jì)數(shù)量，即從用上述方法在10×40倍鏡下計(jì)數(shù)的5個(gè)100的計(jì)數(shù)段中隨機(jī)抽取2個(gè)計(jì)數(shù)段的個(gè)體；3代表300個(gè)個(gè)體計(jì)數(shù)量，即從用上述方法在10×40倍鏡下計(jì)數(shù)的5個(gè)100的計(jì)數(shù)段中隨機(jī)抽取3個(gè)計(jì)數(shù)段的個(gè)體；4代表400個(gè)個(gè)體計(jì)數(shù)量，即從用上述方法在10×40倍鏡下計(jì)數(shù)段中隨機(jī)抽取4個(gè)計(jì)數(shù)段的個(gè)體；5代表500個(gè)個(gè)體計(jì)數(shù)量，即從用上述方法在10×40倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)計(jì)數(shù)段的個(gè)體.在10×40倍下計(jì)數(shù)的個(gè)體計(jì)算出密度加上在10×10倍鏡下進(jìn)行整片計(jì)數(shù)的細(xì)胞密度即樣品的細(xì)胞密度，每個(gè)樣品有5種計(jì)數(shù)等級(jí)產(chǎn)生的細(xì)胞密度值，即a1～a5、b1～b5、c1～c5、d1～d5、e1～e5。

1.3 浮游植物鑒定和群落細(xì)胞密度、群落生物量及辛普森多樣性指數(shù)計(jì)算

浮游植物種類鑒定主要參照有關(guān)文獻(xiàn)的描述及圖鑒[19]。

基于倒置顯微鏡法，每個(gè)樣品分別鏡檢5個(gè)計(jì)數(shù)段的浮游植物，并分別計(jì)算鏡檢每個(gè)計(jì)數(shù)段所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞密度.藻細(xì)胞密度計(jì)算公式為：

(1)

式中，N為原水的藻細(xì)胞密度(cells/ml)，V為沉降水樣的體積(ml)，D為載玻片直徑(mm)，d為計(jì)數(shù)鏡頭直徑(mm)，n為計(jì)數(shù)鏡頭數(shù)，C為計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)(cells)。

在常見的浮游植物生物量計(jì)算方法中，可歸納為4種不同的生物量計(jì)算方法：標(biāo)準(zhǔn)法、細(xì)分法、粗分法和資料法[20-21].粗分法克服了細(xì)分法繁瑣耗時(shí)的缺陷，在保證數(shù)據(jù)具有較高可靠性的前提下有效節(jié)省了時(shí)間和人力，是計(jì)算浮游植物生物量的高效方法，所以在本研究中兩種定量方法均采用粗分法進(jìn)行生物量計(jì)算[8]。

計(jì)算鏡檢每個(gè)計(jì)數(shù)段所對(duì)應(yīng)的浮游植物群落辛普森多樣性指數(shù)(Simpson’s diversity index，D)，測(cè)定各水庫中鏡檢每個(gè)計(jì)數(shù)段所對(duì)應(yīng)的浮游植物群落物種多樣性.計(jì)算公式為：

(2)

式中，Ni為i物種的個(gè)體數(shù)，N為總個(gè)體數(shù)[22]。

1.4 浮游植物定量數(shù)據(jù)的均值及偏差計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 不同計(jì)數(shù)量的浮游植物細(xì)胞密度、生物量與群落多樣性

對(duì)計(jì)數(shù)量為隨機(jī)化抽取的a1、a2、a3、a4、a5定量數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)浮游植物細(xì)胞密度隨著計(jì)數(shù)個(gè)體數(shù)的增加趨于穩(wěn)定，偏差減小(圖1).計(jì)數(shù)a4的生物量數(shù)據(jù)基本趨于穩(wěn)定，且偏差相對(duì)a1、a2、a3、平行所得數(shù)據(jù)偏差較小(圖1).計(jì)數(shù)量與浮游植物種類數(shù)偏差呈負(fù)相關(guān)性，即隨計(jì)數(shù)量的增加，浮游植物種類數(shù)偏差降低(圖2)。

圖1 不同計(jì)數(shù)量下浮游植物豐度與生物量的比較Fig.1 Cell density and biomass of phytoplankton under different counting individuals

圖2 不同計(jì)數(shù)量下浮游植物種類數(shù)的比較Fig.2 Observed species richness of phytoplankton under different counting individuals

2.2 平行水樣浮游植物定量的重復(fù)性

根據(jù)2.1節(jié)數(shù)據(jù)分析，每個(gè)水樣計(jì)數(shù)4個(gè)計(jì)數(shù)段時(shí)生物量、細(xì)胞密度和種類豐富度接近計(jì)數(shù)5個(gè)計(jì)數(shù)段個(gè)體下的值，并且數(shù)據(jù)偏差比計(jì)數(shù)1、2、3個(gè)計(jì)數(shù)段的偏差小.因此，在Lund等推薦的這一計(jì)數(shù)量(400個(gè)體)下，進(jìn)行不同水庫同一采樣點(diǎn)的平行水樣定量結(jié)果比較(圖3)，3座水庫的5個(gè)平行樣品之間的細(xì)胞密度、生物量、辛普森指數(shù)都有較大差別.單個(gè)(瓶)浮游植物樣品的細(xì)胞密度與5個(gè)(瓶)浮游植物樣品的平均細(xì)胞密度之間最大相差24.36%；單個(gè)(瓶)浮游植物樣品的生物量與5個(gè)(瓶)浮游植物樣品的平均生物量之間最大相差70.38%；浮游植物群落辛普森指數(shù)最大相差37.13%。

圖3 每個(gè)樣品計(jì)數(shù)400個(gè)個(gè)體下各水庫的5個(gè)平行樣品中浮游植物細(xì)胞密度、生物量、辛普森指數(shù)Fig.3 Cell density， biomass and Simpson index of phytoplankton from three reservoirs under counting 400 units

圖4給出了3座水庫各自計(jì)數(shù)4個(gè)計(jì)數(shù)段及計(jì)數(shù)5個(gè)計(jì)數(shù)段所對(duì)應(yīng)的浮游植物群落種類稀疏曲線，它們提供不同樣品所對(duì)應(yīng)群落結(jié)構(gòu)的比較.計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)不同時(shí)，觀測(cè)到的浮游植物種類不同.兩座營(yíng)養(yǎng)水平較高的水庫(大沙河水庫和高州水庫)計(jì)數(shù)4個(gè)計(jì)數(shù)段和計(jì)數(shù)5個(gè)計(jì)數(shù)段所觀測(cè)到的種類數(shù)基本達(dá)到穩(wěn)定，而營(yíng)養(yǎng)水平較低的流溪河水庫中計(jì)數(shù)4個(gè)計(jì)數(shù)段和計(jì)數(shù)5計(jì)數(shù)段所觀測(cè)到的種類數(shù)均未達(dá)到漸進(jìn)線。

2.3 細(xì)胞密度、生物量與數(shù)據(jù)質(zhì)量

對(duì)計(jì)數(shù)400個(gè)個(gè)體的浮游植物定量數(shù)據(jù)進(jìn)行偏差分析，以了解浮游植物細(xì)胞密度和生物量對(duì)定量數(shù)據(jù)偏差的影響分析.生物量偏差與浮游植物細(xì)胞密度、生物量之間均有顯著相關(guān)性(圖5).水體浮游植物細(xì)胞密度的高低對(duì)定量計(jì)數(shù)結(jié)果的穩(wěn)定性有著較為明顯的影響，細(xì)胞密度越高，定量計(jì)數(shù)結(jié)果數(shù)據(jù)穩(wěn)定性越低.浮游植物生物量與生物量偏差有顯著正相關(guān)性，說明浮游植物生物量越高，定量計(jì)數(shù)結(jié)果的穩(wěn)定性越低。

2.4 樣品濃縮法及倒置顯微鏡法的數(shù)據(jù)對(duì)比

根據(jù)樣品濃縮法相關(guān)文獻(xiàn)及上文結(jié)論，對(duì)倒置顯微鏡法計(jì)數(shù)400個(gè)個(gè)體及樣品濃縮法計(jì)數(shù)4片平行的定量數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析(one-way ANOVA)，兩種定量計(jì)數(shù)方法所得的生物量數(shù)據(jù)有顯著差異(P流溪河水庫<0.001，P高州水庫<0.001，P大沙河水庫<0.001)；兩種定量數(shù)據(jù)方法所得的浮游植物細(xì)胞密度數(shù)據(jù)有顯著差異(P流溪河水庫<0.001，P高州水庫<0.005，P大沙河水庫<0.001)；兩種定量方法所得的辛普森指數(shù)無顯著差異(P流溪河水庫=0.551，P高州水庫=0.601，P大沙河水庫=0.812).樣品濃縮法所得的浮游植物生物量和細(xì)胞密度要小于倒置顯微鏡法計(jì)算所得的生物量和細(xì)胞密度，但兩種方法得到的辛普森指數(shù)相近(圖6)。

圖6 兩種定量計(jì)數(shù)方法所得的浮游植物生物量、細(xì)胞密度及辛普森指數(shù)對(duì)比Fig.6 Comparison of biomass， cell density and Simpson index of three phytoplankton communities counted by two methods

3 討論

3.1 計(jì)數(shù)量對(duì)浮游植物細(xì)胞密度、生物量與群落多樣性的影響

倒置顯微鏡法的計(jì)數(shù)量控制為在10×40倍鏡下鏡檢不少于400個(gè)個(gè)體即可[24].本研究采用的是10×10倍下鏡檢整片浮游植物計(jì)數(shù)板，10×40倍鏡下隨機(jī)選取視野鏡檢多于400個(gè)個(gè)體.10×10倍鏡下鏡檢整片浮游植物計(jì)數(shù)板可以減少大個(gè)體浮游植物及稀有種無法被鏡檢的概率，稀有種對(duì)定量結(jié)果影響較大，因此10×10倍下鏡檢整片浮游植物計(jì)數(shù)板非常必要[8]。

在本文計(jì)數(shù)方法下，浮游植物計(jì)數(shù)個(gè)體數(shù)的增加對(duì)定量數(shù)據(jù)的影響并不明顯，但在一定范圍內(nèi)隨計(jì)數(shù)個(gè)體數(shù)的增加可檢出更多種類，浮游植物細(xì)胞密度和生物量偏差均減小，所以鏡檢計(jì)數(shù)的個(gè)體數(shù)增加可使定量結(jié)果更加接近真實(shí)值并提高定量結(jié)果的可信度.但本文數(shù)據(jù)分析表明，一般情況下計(jì)數(shù)400個(gè)個(gè)體即可使細(xì)胞密度、生物量的偏差較小，從而保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性。

3.2 平行樣品數(shù)與浮游植物定量偏差的關(guān)系

在實(shí)際研究中經(jīng)常出現(xiàn)不同研究人員在相同時(shí)間、同一水體、同一地點(diǎn)采樣測(cè)得的數(shù)據(jù)有較大偏差的現(xiàn)象.造成這種偏差的原因可能有多方面，其中計(jì)數(shù)方法和樣品平行性差異被認(rèn)為是主要的.浮游植物群落的特點(diǎn)，如密度、生物量也是影響生物量偏差的重要因素.密度和總生物量的提高會(huì)增加這類偏差，說明浮游植物密度越高的水體由單個(gè)樣品計(jì)數(shù)計(jì)算出的浮游植物定量數(shù)據(jù)不穩(wěn)定性也越高.倒置顯微鏡法所鏡檢的樣品未經(jīng)虹吸濃縮和濃縮液轉(zhuǎn)移處理，理論上所得的定量數(shù)據(jù)能夠相對(duì)準(zhǔn)確地反映出浮游植物現(xiàn)存量.但在浮游植物種類較多的情況下，倒置顯微鏡法所鑒定出的浮游植物種類數(shù)可能會(huì)低于樣品濃縮法所鑒定出的種類數(shù).倒置顯微鏡法對(duì)一些自然水體中稀有浮游植物種類的檢測(cè)不夠，倒置顯微鏡法一次鏡檢的最大水樣體積是100ml，并且根據(jù)營(yíng)養(yǎng)水平的增加減少沉淀鏡檢樣品體積，這樣會(huì)造成鏡檢到稀有種的概率降低[14].稀疏曲線提供分析和比較不同樣品種類數(shù)的方法，這種方法在開展多樣性分析時(shí)更為有效.從我們對(duì)采樣水庫平行樣品之間的比較來看，樣品的可重復(fù)性因水體的性質(zhì)變化而變化，貧營(yíng)養(yǎng)水體樣品重復(fù)性相對(duì)較低.導(dǎo)致平行樣品定量數(shù)據(jù)之間存在差別的原因，一方面與水樣之間的可重復(fù)性有關(guān)，另一方面與沉淀過程的可重復(fù)性有關(guān).為此可以通過增加鏡檢平行樣品的方法來彌補(bǔ)種類多樣性方面研究的不足.為提高浮游植物定量數(shù)據(jù)的可靠性，在條件允許的情況下采集平行樣品是必要的，可靠的水質(zhì)等級(jí)評(píng)價(jià)和劃分更需要以足夠的平行水樣來保證數(shù)據(jù)質(zhì)量和評(píng)價(jià)結(jié)果的可靠性。

3.3 沉淀體積及時(shí)間的確定

為保證不影響正常鏡檢，避免藻類重疊而影響計(jì)數(shù)，倒置顯微鏡法的沉淀體積需根據(jù)待檢測(cè)水樣的營(yíng)養(yǎng)水平及藻細(xì)胞密度而定，寡中營(yíng)養(yǎng)水平水體沉淀50ml(如流溪河水庫)，中營(yíng)養(yǎng)水平水體沉淀10ml(如高州水庫)，中富營(yíng)養(yǎng)水平水體沉淀3ml(如大沙河水庫).為了避免計(jì)數(shù)框高沉降柱對(duì)浮游植物細(xì)胞的黏附作用引起的誤差，盡量減少使用100ml的高沉降柱(20cm高)，可通過增加計(jì)數(shù)個(gè)體數(shù)來提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。

Lund等推薦的沉淀時(shí)間為：100ml沉淀18h，10ml沉淀3h，1ml沉淀1h[14].而Willén則推薦：10ml沉淀8h，50ml或100ml沉淀48h[15].但對(duì)于不同水體強(qiáng)行要求沉淀時(shí)間并不合適，應(yīng)根據(jù)觀測(cè)目的和水樣的不同適當(dāng)調(diào)整沉降時(shí)間[10].另外，通過魯哥試劑染色的浮游植物細(xì)胞重量會(huì)增加，沉降速率也有所增加，可適當(dāng)減少沉降時(shí)間以便提高監(jiān)測(cè)效率。

3.4 樣品濃縮法及倒置顯微鏡法的對(duì)比

兩種定量計(jì)數(shù)方法計(jì)算所得的辛普森指數(shù)無顯著差異，說明兩種方法所得結(jié)果均能反映浮游植物群落結(jié)構(gòu)的整體指標(biāo).但樣品濃縮法通過沉淀、濃縮、再隨機(jī)取樣鏡檢等多個(gè)步驟方能完成計(jì)數(shù)工作，每一步都有誤差產(chǎn)生.樣品濃縮法一般取1000ml樣品在聚乙烯瓶中靜置沉淀后再進(jìn)行虹吸濃縮，1000ml聚乙烯瓶的內(nèi)壁面積及沉淀高度遠(yuǎn)高于沉淀杯的沉降柱內(nèi)壁面積及沉淀高度，因此樣品濃縮法在沉降過程、虹吸過程無法避免浮游植物的損失，使通過樣品濃縮法所得的浮游植物群落生物量及細(xì)胞密度與倒置顯微鏡法相比偏小。

倒置顯微鏡法中使用的Uterm?hl計(jì)數(shù)框密封性較好，水分蒸發(fā)對(duì)浮游植物計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性基本無影響.對(duì)樣品濃縮法而言，為避免水分蒸發(fā)的影響，則要求計(jì)數(shù)者對(duì)每片樣品的計(jì)數(shù)在1h內(nèi)完成.濃縮法監(jiān)測(cè)規(guī)范通常要求計(jì)數(shù)2片平行，但4片平行才能保證定量結(jié)果的穩(wěn)定性[7]，然而采用倒置顯微鏡法計(jì)數(shù)400個(gè)體通常需要2h左右.由此可見，倒置顯微鏡法與傳統(tǒng)樣品濃縮法相比，沉淀及計(jì)數(shù)時(shí)間都較短，更適合用于水華暴發(fā)等臨時(shí)性應(yīng)急水質(zhì)監(jiān)測(cè)。

4 結(jié)論

1) 倒置顯微鏡法對(duì)原水樣進(jìn)行鏡檢時(shí)，減少了濃縮及取樣過程中產(chǎn)生的誤差，能夠較準(zhǔn)確地計(jì)數(shù).倒置顯微鏡法計(jì)數(shù)通過增加計(jì)數(shù)個(gè)體數(shù)可提高定量數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，計(jì)數(shù)400個(gè)個(gè)體時(shí)數(shù)據(jù)基本穩(wěn)定。

2) 浮游植物樣品的沉淀體積要根據(jù)水體的營(yíng)養(yǎng)水平及浮游植物細(xì)胞密度而定，為不影響鏡檢計(jì)數(shù)可行性和減少高沉降柱帶來的誤差，建議寡營(yíng)養(yǎng)水體選擇50ml沉淀杯，中營(yíng)養(yǎng)水體選擇10ml沉淀杯，富營(yíng)養(yǎng)水體選擇3ml沉淀杯。

3) 倒置顯微鏡法與傳統(tǒng)樣品濃縮法相比，沉淀及計(jì)數(shù)時(shí)間都較短，更適合用于水華暴發(fā)等臨時(shí)性應(yīng)急水質(zhì)監(jiān)測(cè)。

4) 相比傳統(tǒng)的濃縮法，倒置顯微鏡法采用了統(tǒng)一的計(jì)數(shù)量，這為方法的統(tǒng)一與標(biāo)準(zhǔn)提供了定量控制，也為長(zhǎng)期觀測(cè)數(shù)據(jù)的可比性奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)5

[1]Bianchi F, Acri F, Aubry FBetal. Can plankton communities be considered as bio-indicators of water quality in the Lagoon of Venice？MarinePollutionBulletin, 2003, 46: 964-971。

[2]Reynolds CS. Ecology of Plankton. Cambridge: Cambridge University Press, 2006。

[3]Richardson TL, Gibson CE, Heaney SIetal. Temperature, growth and seasonal succession of phytoplankton in Lake Baikal, Siberia.FreshwaterBiology, 2000, 44: 431-40。

[4]王冀, 王建. 浮游植物的采集、計(jì)數(shù)與定量方法. 水庫漁業(yè), 1982, 4: 58-63。

[5]孫軍, 劉東艷, 錢樹本. 浮游植物生物量研究Ⅰ. 浮游植物生物量細(xì)胞體積轉(zhuǎn)化法. 海洋學(xué)報(bào), 1999, 1(2): 75-85。

[6]Sun J, Liu D. Geometric models for calculating cell biovolume and surface area for phytoplankton.JournalofPlanktonResearch, 2003, 25(11): 1331-1346。

[7]牛海玉, 陳純, 韓博平. 基于濃縮法的浮游植物定量數(shù)據(jù)穩(wěn)定性與可靠性分析. 湖泊科學(xué), 2015, 27(5): 776-782. DOI 10. 18307/2015. 0503。

[8]陳純, 李思嘉, 胡韌等. 四種浮游植物生物量計(jì)算方法的比較分析. 湖泊科學(xué), 2013, 25(6): 927-935. DOI 10. 18307/2013. 0617。

[9]Zarauz L, Irigoien X. Effects of Lugol’s fixation on the size structure of natural nano-microplankton samples, analyzed by means of an automatic counting method.JournalofPlanktonResearch, 2008, 30(11): 1297-1303。

[10]Edler L, Elbr?chter M. The Uterm?hl method for quantitative phytoplankton analysis. In: Karlson B, Cusack C, Bresnan E eds.Microscopicandmolecularmethodsforquantitativephytoplanktonanalysis. Paris: UNESCO, 2010: 110。

[11]金相燦. 湖泊富營(yíng)養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范: 第2版. 北京: 中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社, 1990: 239-245。

[12]McDermott G, Raine R. Settlement bottle method for quantitative phytoplankton analysis. Microscopic and molecular methods for quantitative phytoplankton analysis. Paris: UNESCO, 2010: 21-24。

[13]Rott E, Salmaso N, Hoehn E. Quality control of Uterm?hl-based phytoplankton counting and biovolume estimates-an easy task or a Gordian knot？Hydrobiologia, 2007, 578(1): 141-146。

[14]Lund JWG, Kipling C, LeCren ED. The inverted microscope method of estimating algal numbers and the statistical basis of estimations by counting.Hydrobiologia, 1958, 11(2): 143-170。

[15]Willén E. A simplified method of phytoplankton counting.BritishPhycologicalJournal, 1976, 11(3): 265-278。

[16]林秋奇, 胡韌, 段舜山等. 廣東省大中型供水水庫營(yíng)養(yǎng)現(xiàn)狀及浮游生物的響應(yīng). 生態(tài)學(xué)報(bào), 2003, 23(6): 1102-1108。

[17]陳曉玲, 程丹, 李慧明等. 南亞熱帶水庫中盔形溞牧食對(duì)浮游植物群落影響的圍隔試驗(yàn). 水生態(tài)學(xué)雜志, 2012, 33(3): 20-26。

[18]林少君, 賀立靜, 黃沛生等. 浮游植物中葉綠素a提取方法的比較與改進(jìn). 生態(tài)科學(xué), 2005, 24(1): 9-11。

[19]胡鴻鈞, 魏印心. 中國(guó)淡水藻類: 系統(tǒng)分類及生態(tài). 北京: 科學(xué)出版社, 2006。

[20]Hillebrand H, Dürselen CD, Kirschtel Detal. Biovolume calculation for pelagic and benthic microalgae.JournalofPhycology, 1999, 35(2): 403-424。

[21]王驥, 王建. 浮游植物的葉綠素含量、生物量、生產(chǎn)量相互換算中的若干問題. 武漢植物學(xué)研究, 1984, 2(2): 249-258。

[22]Heip C, Engels P. Comparing species diversity and evenness indices.JournaloftheMarineBiologicalAssociationoftheUnitedKingdom, 1974, 54(3): 559-563。

[23]R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. 2008, ISBN 3-900051-07-0, URL http: //www. R-project. org。

[24]孫軍, 劉東艷, 錢樹本. 一種海洋浮游植物定量研究分析方法Uterm?hl方法的介紹及其改進(jìn). 黃渤海海洋, 2002, 20(2): 105-112。

J.LakeSci.(湖泊科學(xué))， 2016， 28(1)： 141-148

?2016 byJournalofLakeSciences

Data quality analysis of phytoplankton counted with the inverted microscopy-based method

NIU Haiyu1， XIAO Lijuan1，2& HAN Boping1，2**

(1：DepartmentofEcology，JinanUniversity，Guangzhou510632，P.R.China)

(2：GuangdongCenterforProtectionandControlofCyanobacterialBloomsinReservoirs，Guangzhou510632，P.R.China)

Abstract：Phytoplankton standing stock largely characterizes the structure and function of aquatic ecosystems and thus， it needs to be well quantified for measuring the ecological function. Inverted microscopy method (i.e. Uterm?hl’s counting method) has been widely applied， but not in developing countries limited by investment for inverted microscopy. Phytoplankton samples collected from three reservoirs with distinct trophic states and three treatments of experimental enclosures were used to demonstrate data quality in using the method. The potential effects of the counting individual and cell abundance， community biomass and cell density in replicates of water samples on the data quality were statistically analyzed. As suggested in the original method by Lund (1958)， counting 400 individuals for each plate of meso-and eutrophic water sample is required to balance the stability of data， but we found counting 500 individuals for oligotrophic water is needed. When collecting replicate water samples is possible， especially those used for assessing the water quality， three or five replicates of water samples are strongly suggested to be collected to reduce the standard deviation， especially in oligotrophic water. There was no significant difference in Simpson index between two quantitative methods， indicating that both methods have resulted in a similar measurement of phytoplankton diversity. There were significant differences in both measured biomass and cell density between the two methods because of cells loss during concentrating samples. Compared to the concentrated water sample-based method， inverted microscopy method takes a shorter total time for counting and sedimentation， and is preferred for use in the emergency monitoring。

Keywords：Phytoplankton； Uterm?hl method； cell density； biomass； richness

通信作者*；E-mail：tbphan@jnu.edu.cn。

基金項(xiàng)目收修改稿.牛海玉(1990～)，女，碩士研究生；E-mail：niuniu-nhy@163.com。;牛海玉1，肖利娟1，2，韓博平1，2

DOI10.18307/2016.0116