謝宇鋒，陳赟，馮軍，楊宗保，吳云天，王曙輝

1.深圳福田區(qū)中醫(yī)院針灸推拿科，廣東 深圳 518000；2.廈門大學醫(yī)學院，福建 廈門 361005

◆實驗研究◆

御寒暖胃膏穴位貼敷對慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜TNF-α、PCNA的影響

謝宇鋒1，陳赟1，馮軍1，楊宗保2，吳云天1，王曙輝1

1.深圳福田區(qū)中醫(yī)院針灸推拿科，廣東 深圳 518000；2.廈門大學醫(yī)學院，福建 廈門 361005

目的：研究御寒暖胃膏貼敷胃經穴對慢性萎縮性胃炎（CAG）大鼠胃黏膜腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、增殖細胞核抗原（PCNA）表達的影響，探討御寒暖胃膏貼敷胃經穴對慢性萎縮性胃炎癌前病變CAG大鼠胃黏膜損傷修復的作用機制。方法：大鼠隨機分為正常組、模型組、御寒暖胃膏貼敷胃經穴組、藥物對照組，采用綜合干預方法復制慢性萎縮性胃炎癌前病變大鼠模型，肉眼下觀察大鼠胃黏膜損傷指數，光鏡下觀察胃黏膜組織的病理變化，采用酶聯(lián)免疫分析法測定胃黏膜細胞中TNF-α、PCNA的表達水平。結果：與正常組比較，模型組的大鼠胃黏膜組織病理學檢查提示存在腺體的萎縮和一定程度的細胞異型增生，大鼠胃黏膜細胞中TNF-α、PCNA的表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，御寒暖胃膏貼敷胃經穴組和藥物對照組大鼠胃黏膜組織的病理損傷得到修復，大鼠胃黏膜細胞中TNF-α、PCNA的表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；結論：御寒暖胃膏貼敷胃經穴可以促進CAG大鼠胃黏膜損傷的修復，該作用可能是通過調節(jié)胃黏膜細胞TNF-α、PCNA的表達水平來實驗的。

慢性萎縮性胃炎；御寒暖胃膏；穴位貼敷；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）；增殖細胞核抗原；動物實驗；大鼠

慢性萎縮性胃炎(Chronic Atrophic Gastritis，CAG)作為胃癌的癌前病變，是慢性胃炎向胃癌發(fā)展的必經階段，也是防治胃癌的關鍵節(jié)點。本課題組運用中醫(yī)外治法經典著作《理瀹駢文》所記載的“御寒暖胃膏”貼敷胃經穴足三里、中脘干預慢性萎縮性胃炎患者，能夠較好地改善患者的臨床癥狀，并在一定程度上促進慢性萎縮性胃炎胃黏膜腺體萎縮、細胞型增生的逆轉，為進一步明確御寒暖胃膏貼敷胃經穴對慢性萎縮性胃炎的作用，并闡述其可能的作用機制，為臨床開展御寒暖胃膏貼敷胃經穴治療慢性萎縮性胃炎提供科學的實驗依據，本課題組開展了以下實驗，具體介紹如下。

1 材料

1.1 實驗動物 合格SD(Sprague-Dawley Rat)大鼠28只，雄性，清潔級，8周齡，體重200～250 g，購于江西中醫(yī)藥大學實驗動物中心(JZDWNO：2013-1056)。大鼠飼養(yǎng)于墊鋸木屑的飼料籠中，每籠10只，控制室溫22℃，相對濕度50%，采用自然光暗周期，自由飲水，檢疫3周后分組實驗。

1.2 試劑與藥品 御寒暖胃膏組成為：生姜160 g，凡士林48 g，乳香、沒藥各3 g，川椒6 g，所有中藥均購自深圳市福田區(qū)中醫(yī)院中藥房，并且于深圳市福田區(qū)中醫(yī)院中藥煎藥房制成膏藥；維酶素片(河北環(huán)海藥業(yè)有限公司，批號：20120214)；N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)(日本東京化成株式會社)。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 將28只大鼠按體重排序，然后按隨機數字表法隨機分為4組，每組7只，分別為：正常組、模型組、御寒暖胃膏貼敷胃經穴組(下稱：穴位貼敷組)、藥物對照組。

2.2 藥品制備

2.2.1 御寒暖胃膏的制備 (1)膏藥的組成：生姜800 g，凡士林240 g，乳香、沒藥各15 g，川椒30 g。(2)膏藥的制備方法：①研磨藥粉：將乳香、沒藥、川椒分別研碎成粉末(100目篩)，按份量稱好以備用。②制備姜汁：將生姜榨成汁，并將生姜汁倒入燒懷中，用酒精燈加熱至沸騰。③溶化藥物：首先加熱融化凡士林，然后加入乳香、沒藥，并不斷用玻棒攪拌至乳香、沒藥融化為止，然后與煮沸后的姜汁混勻，再加熱至滴水不化。④冷卻撒藥：熄火待膏藥溫度降至60℃時，將備好的藥粉往膏中撒布并繼續(xù)攪拌，冷卻備用。

2.2.2 維酶素灌胃液的制備 將維酶素藥片整片放入玻璃研磨皿中研磨成粉，按比例加入純凈水，將藥物配成21.6 mg/mL的溶液(人的維酶素給藥劑量是2.4 g/天，人與大鼠的換算系數0.018，則大鼠的劑量為216 mg/kg，根據大鼠體重換算灌胃量)，然后按照大鼠的體重，按1 mL/100 g的用量予以灌胃，每天1次。

2.2.3 MNNG溶液的制備 MNNG溶液每周先用純凈水配成1 g/L濃度的儲存液，避光4℃保存，用時將其配成150 μg/mL的飲用液，并置于光屏蔽瓶中讓大鼠自由飲用。

2.2.4 2%的水楊酸鈉溶液的制備 使用天秤稱取水楊酸鈉和純凈水，按1∶48的比例配成2%的水楊酸鈉溶液，以備造模使用。

2.2.5 30%乙醇溶液的制備 使用天秤稱取無水乙醇和純凈水，按3∶7的比例配成30%的乙醇溶液，以備造模使用。

2.3 模型復制方法 按照嚴茂祥[2]報道的綜合造模方法，將SD大鼠分組后，除正常對照組外，其余3組大鼠采取嚴茂祥的綜合方法復制CAG癌前病變動物模型，為期20周。①在飲水中加入MNNG溶液進行造模，讓大鼠自由飲用，正常組自由飲用自來水；②2%水楊酸鈉溶液灌胃：單天1次，按10 mL/kg的劑量給大鼠灌胃，灌胃前后禁食禁水1 h；③30%酒精溶液灌胃，隔天1次，按10 mL/kg的劑量給大鼠灌胃，灌胃前后禁食禁水1 h；④對造模動物每天均用專用夾子夾尾1次，使其保持激怒、爭斗狀態(tài)，持續(xù)1 h；⑤饑飽失常法：2天足量喂食，1天停食，循環(huán)實施。

3 干預方法

3.1 正常組 喂飼標準飼料，不予任何處理。

3.2 模型組 第21周開始，每天捆綁1 h，并予膠布貼敷肚子及雙下肢，每只每天按1 mL/100 g的用量經口灌服純凈水。

3.3 穴位貼敷組 ①選穴與取穴：胃經穴分別選取足三里與梁門。②貼敷方法：第21周開始，每天將各組大鼠捆縛于鼠板，將膏藥涂于所選部位上，直徑為0.3 cm，厚度為0.2 cm，外用醫(yī)用膠布固定，每天1h。③每只每天按1 mL/100 g的用量經口灌服純凈水。

3.4 藥物對照組 維酶素溶液，按21.6 mg/kg的藥量給藥，每天1次，每天捆綁1 h，并予膠布貼敷肚皮及雙下肢。

從第21周開始，各組按照上述方案共干預8周。

4 動物處理及標本采集

4.1 動物處理 經過8周干預結束后，大鼠處理前24 h禁食不禁水，稱量體重后，在超凈工作臺下，按照0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉。麻醉后腹部朝上置于鼠板上，用手術刀迅速打開大鼠腹腔，取出胃部。用眼科剪刀沿胃大彎剪開胃并翻轉。用冰1%DEPC 0.9%氯化鈉溶液漂洗胃內容物，采用吸水紙將組織的水分吸干，取全小彎側上至食管下至十二指腸的胃組織以備病理切片用；鈍性分離胃竇黏膜，裝在凍存管中，并用液氮冷凍，后儲存于-80℃冰箱內以備用。

4.2 病理切片標本采集 從上述備用組織中取1 cm×0.5 cm大小的組織塊0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，然后將所取的標本放入10%甲醛溶液內固定24～48 h，常規(guī)進行石蠟包埋，不同濃度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，厚4 μm。

4.3 ELISA標本采集 從上述備用組織中剪取胃腺部1 cm× 1 cm大小的組織塊，稱重。用眼科剪將所取的組織塊盡量剪碎，用移液管加入0.1 M冰PBS緩沖液(按：組織塊重量：緩沖液體積=1∶9)。將所獲得的組織混懸液使用勻漿機在冰上以10000 r/min研磨成10%的組織勻漿(勻漿時間10 s/次，間隔30 s，反復3～5次)。將所獲得的勻漿液移入干凈的離心管中，并使用冷凍離心機，以4℃、3000 rpm離心15 min。然后將離管內的上清轉移至新的潔凈EP管中，放入-80℃冰箱備用。

5 檢測指標與方法

5.1 檢測指標 胃黏膜的病理形態(tài)學，在上4組動物的胃體部切取5 mm×7 mm大小的胃組織，用10%福爾馬林固定液固定1周后，常規(guī)石蠟包埋切片，E染色，光鏡下觀察。

5.2 檢測方法 按照大鼠胃黏膜細胞腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、增殖細胞核抗原(PCNA)的ELISA試劑盒使用說明書中的操作步驟進行操作。

6 統(tǒng)計學方法

7 結果

7.1 各組胃黏膜組織病理學的變化情況 圖1 ～8光鏡顯示：正常組大鼠各層胃組織結構完整，上皮細胞、腺體大小形均勻、排列有序，腺上皮與腺管分界清楚，固有腺及黏膜無擴張淤血，黏膜肌層無增生，未見病理性核分裂象(圖1 ～2)。模型組大鼠黏膜層腺管形態(tài)及大小不規(guī)側，存囊狀擴張的腺管，腺管結構紊亂，細胞核大小不等，在高倍鏡下細胞核比例增大、濃染，細胞核呈桿狀或類圓形，排列參差不齊，可見核分裂象(圖3 ～4)；穴位貼敷組、藥物對照組大鼠胃黏膜生長較模型組有所好轉，其黏膜厚度與皺壁有所恢復，黏膜未見明顯水腫、萎縮、炎癥，腺體排列較整齊，腺體囊狀擴張較少，未見明顯萎縮，高倍鏡下細胞核大小較均勻，排列整齊，未見病理性核分裂象(圖5 ～8)。 00)

圖1 正常組(×100)

圖2 正常組(×400)

圖3 模型組(×100)

圖4 模型組(×400)

圖5 穴位貼敷組(×100)

圖6 穴位貼敷組(×400)

圖7 藥物對照組(×100)

圖8 藥物對照組(×4

7.2 各組大鼠胃黏膜TNF-α水平比較 見表1 。與正常組相比，模型組的大鼠胃黏膜TNF-α增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；與模型組比較，穴位貼敷組、藥物對照組的大鼠胃黏膜TNF-α降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表1 各組大鼠胃黏膜TNF-α水平比較() ng/L

表1 各組大鼠胃黏膜TNF-α水平比較() ng/L

各組經方差分析示：F=53.66，P=0.000；與正常組比較，①P=0.000；與模型組比較，②P=0.000

組別正常組模型組穴位貼敷組藥物對照組n7777 TN F-α 143.04±25.67 313.35±28.99①157.59±24.10②206.55±27.38②

7.3 各組大鼠胃黏膜PCNA水平比較 見表2 。與正常組比較，模型組的大鼠胃黏膜PCNA水平增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；與模型組比較，穴位貼敷組、藥物對照組的大鼠胃黏膜PCNA水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表2 各組大鼠胃黏膜PCNA水平的比較() ng/mL

表2 各組大鼠胃黏膜PCNA水平的比較() ng/mL

各組經方差分析示，F(xiàn)=22.27，P=0.000；與正常組比較，①P=0.000；與模型組比較，②P=0.000

組別正常組模型組穴位貼敷組藥物對照組n7777 PCN A 2.88±0.38 4.55±0.28①3.33±0.46②3.81±0.37②

8 討論

御寒暖胃膏來源于清代中草藥外治專家吳師機所著的《理瀹駢文》一書，該書大力推崇和發(fā)展膏藥穴位貼敷這一外治法，記載“御寒暖胃膏，主治：胃傷，不思飲食，胸腹脹痛，嘔噦惡心，噫氣吞痠，怠惰嗜臥，并治腰背冷痛。用法：糝花椒貼中脘處，藥物：生姜汁熬牛膠化開，以乳香、沒藥、黃丹收?！苯Y合本方的配伍，不難看出本方具有溫中和胃、活血祛瘀之效，且其所描述的癥狀與CAG的臨床表現(xiàn)極為相似，雖然在中醫(yī)學中并無CAG癌前病變這一病名，但早在《靈樞·經脈》就有記載：“足陽明之脈，是動則病，食則嘔，胃脘痛”。本病病因主要與飲食不節(jié)、情志失司、素體虛弱、用藥不當等因素有關。其病機為本虛標實、虛實夾雜，本虛為脾胃虛弱，邪實重在氣滯血瘀，病位在胃，涉及脾、腎、肝；血瘀是本病發(fā)生的重要致病因素；因此，本病的中醫(yī)治療應在溫中健脾、益氣和胃的基礎上，佐以活血化瘀。正與本方的攻效甚為相符。因此，本研究團隊進行了大膽嘗試，取得了較為理想的效果，并開展了相關的機制研究，以探索其作用途徑。

慢性萎縮性胃炎其病理表現(xiàn)主要是以胃黏膜上皮和腺體萎縮、黏膜變薄或伴有腸腺化生、不典型增生為特征。CAG作為胃癌的癌前病變，其發(fā)生與胃癌的發(fā)生一樣是受多基因調節(jié)、多步驟漸進的過程，在致病因素的持續(xù)作用下導致原癌基因、抑癌基因、DNA修復基因、細胞黏附分子、端粒/端粒酶、細胞周期調節(jié)因子和生長因子/受體系統(tǒng)等多個基因的結構和表達異常，這些改變的積累最終導致正常胃黏膜的細胞增殖和凋亡失去平衡，從而導致由正常上皮細胞轉變成癌前病變甚至胃癌細胞。TNF之所以獲得這樣的命名，是因在最初發(fā)現(xiàn)時其是一種可致腫瘤快速出血壞死的物質，但后續(xù)的研究也提示其個有促腫瘤作用。相關的研究認為TNF-α促腫瘤作用的機制是多途徑的，可能與其過度表達并與受體結合通過多條信號通路抑制細胞凋亡及促進細胞增殖，其中以NF-κB途徑的研究較為深入，如：TNF-α可以調節(jié)端粒酶活性，通過NF-κB中的p65導致人類端粒酶催化亞基(hTERT)從胞質易位到核，最終推動細胞無限增殖[2]；通過NF-κB途徑誘導激活的胞苷脫氨酶大量產生，引起腫瘤相關基因如p53和c-myc基因突變[3]。TNF-α在腫瘤微環(huán)境中還可以導致DNA損傷，增加致瘤性[4]。PCNA又稱周期素，在啟動細胞增殖中起著要作用，參與細胞周期調控、復制、修復和凋亡等細胞分化的全過程[5]；此外，PCNA還是對DNA復制起重要調節(jié)作用的DNA聚合酶δ的輔助蛋白之一，其表達的異常，可以直接導致DNA的復制發(fā)生異常，使致畸率大提高[6]，PCNA表達主要見于細胞增殖周期中的S期和G2早期，過度陽性表達表明細胞處于活躍的增殖狀態(tài)[7]。由此可見，TNF-α、PCNA作為調節(jié)細胞增殖與凋亡的重要活性因子，在腫瘤及癌前病變的發(fā)展過程中起著重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)：在CAG大鼠的胃黏膜組織病理學檢查提示存在細胞異型增生，大鼠胃黏膜TNF-α水平升高，PCNA呈現(xiàn)高表達，由此可見，CAG大鼠胃黏膜細胞的異常增生，可能與致病因素導致胃黏膜損傷，激發(fā)TNF-α等炎性因子的釋放，并啟動胃黏膜損傷修復，但長時間、多因素的作用下導致其過度表過，抑制細胞凋亡、促進細胞增殖，從而導胃黏膜細胞處理活躍的增殖狀態(tài)，表現(xiàn)為PCNA高表達，最終導致胃黏膜細胞的異型增生。但穴位貼敷組和口服維酶素片可以在一定程度上逆轉胃黏膜細胞的異常增生，且可以下調TNF-α、PCNA水平。國內外學者的研究顯示，足陽明經穴對與胃相關的中樞及外周神經電生理、胃運動、胃分泌等均有明顯調整作用[8～9]，以穴位為基礎的干預方法，可以實現(xiàn)對胃腸道活性因子的調節(jié)，并實驗胃黏膜的損傷修復[10～12]。在本課題組的早期研究也證實，與非經非穴點相比，御寒暖胃膏貼敷于胃經之足三里穴和中脘穴對CAG大鼠胃黏膜損傷的修復作用、血流量等的影響差異均有統(tǒng)計學意義[13]?？梢娧ㄎ毁N敷組可能是御寒暖胃膏作用于胃經穴，并激發(fā)經氣并調節(jié)胃腑黏膜的運動、分泌等功能，如本研究發(fā)現(xiàn)的下調TNF-α、PCNA表達，從而實現(xiàn)對CAG大鼠胃黏膜的修復，減輕胃黏膜的慢性炎癥，最終達到抑制細胞過度增殖的作用。

綜上所述，穴位貼敷組對慢性萎縮性胃炎癌前病變的干預作用機制明確，該方法值得臨床應用。

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（責任編輯：劉淑婷）

Effect of Yuhan Nuanwei Cream Acupoints Stiking Therapy on Gastric Mucosa TNF-α，PCNA of Mice with Chronic Atrophic Gastritis

XIE Yufeng，CHEN Yun，F(xiàn)ENG Jun，YANG Zongbao，WU Yuntian，WANG Shuhui

Objective：To study the effect of Yuhan Nuanwei cream(YNC)acupoints stiking therapy on gastric mucosa tumor necrosis factor-α (TNF-α)and proliferating cell nuclear antigen(PCNA)expression of mice with chronic atrophic gastritis (CAG)，so to discuss the renovation mechanism of YNC on CAG precancerous lesions.Methods：The mice were divided into normal group，model group，YNC group，drug control group.Duplicate mice model with CAG precancerous lesions by the method of comprehensive intervention，observe gastric mucosallesion index of mice with the naked eyes，observe pathological change of gastric mucosa tissue under light microscope，measure expression level of TNF-α and PCNA in gastric mucosa cells by the method of enzyme-linked immunoassay.Results：Comparing with normal group，mice gastric mucosa histopathological examinations in model group reminded that there exist gland atrophy and some degree of cell atypical hyperplasia，the expression level of TNF-α and PCNA in mice gastric mucosa cell are increased，differences being significant(P＜0.05). Comparing with model group，pathological damage of mice gastric mucosa tissue in YNC group and drug control group obtained obvious repair，the expression level of TNF-α and PCNA in mice gastric mucosa cell were dropped， differences being significant(P＜0.05).Conclusion：The therapy of YNC acupoints stiking therapy can promote the renovation of CAG mice gastric mucosallesion.This fuction may be experimented by regulating the expression levelof TNF-α and PCNA in mice gastric mucosa cell.

Chronic atrophic gastritis；Yuhan Nuanwei cream；Acupiontis stiking therapy；Tumor necrosis factor-α (TNF-α)；Proliferating CellNuclear Antigen(PCNA)

R285.5

A

0256-7415（2016）05-0300-05

10.13457/j.cnki.jncm.2016.05.112

2015-12-25

深圳市科技研發(fā)資金項目（JCYJ20130401105615482）

謝宇鋒（1983-），男，主治醫(yī)師，研究方向：針灸治療疼痛及脾胃相關病癥。

馮軍，E-mail：szfdzyfj@163.com。