b

（上海交通大學(xué)a.農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院；b.陸伯勛食品安全研究中心，上海200240）

嗜熱鏈球菌對生物活性肽QEPV吸收和利用的研究

程志才a，陳靜a，李婉如a，沈鵬a，戈婕妤a，張少輝ab

（上海交通大學(xué)a.農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院；b.陸伯勛食品安全研究中心，上海200240）

以嗜熱鏈球菌和生物活性肽Gln-Glu-Pro-Val(QEPV)為研究對象，探索了乳酸菌對生物活性肽的吸收和利用。首先，用添加熒光標(biāo)記QEPV的M17培養(yǎng)基培養(yǎng)嗜熱鏈球菌，采用流式細胞術(shù)檢測QEPV能否被嗜熱鏈球菌吸收。其次，測定不同劑量生物活性肽QEPV對嗜熱鏈球菌活菌數(shù)、發(fā)酵液pH值、菌體濃度的影響，以探索嗜熱鏈球菌對生物活性肽的利用情況。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，F(xiàn)AM-QEPV與FITC-QEPV能夠穿過嗜熱鏈球菌細胞膜，推測QEPV能夠被嗜熱鏈球菌吸收、利用。并且0.5 mg/mL的QEPV能有效促進嗜熱鏈球菌的生長繁殖，提高嗜熱鏈球菌的發(fā)酵能力。

生物活性肽；嗜熱鏈球菌；吸收；利用

0 引言

經(jīng)過發(fā)酵的牛奶蛋白能夠釋放出豐富的生物活性肽[1]。瑞士乳桿菌發(fā)酵牛乳產(chǎn)生一系列的生物活性肽[2-4]。這些生物活性肽在不能被腸胃消化酶消化分解的同時[5]，具有良好的免疫調(diào)節(jié)[6]、抗炎[7]、抗氧化[8]、抗衰老[9]等功能。

發(fā)酵乳的生產(chǎn)一般采用多種乳酸菌混合發(fā)酵。任玲玲等研究發(fā)現(xiàn)將瑞士乳桿菌與嗜熱鏈球菌按照不同比例混合其產(chǎn)酸能力均高于等量的單一嗜熱鏈球菌的產(chǎn)酸能力[10]。Muriel Charlet等研究嗜熱鏈球菌與乳桿菌在制作奶酪時的相互作用，發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌有明顯的互惠關(guān)系[11]。瑞士乳桿菌發(fā)酵牛乳產(chǎn)生的生物活性肽可能是這種互惠關(guān)系的橋梁物質(zhì)之一。

本課題結(jié)合流式細胞術(shù)研究嗜熱鏈球菌對瑞士乳桿菌發(fā)酵牛乳產(chǎn)生的生物活性肽QEPV的吸收和利用情況。

1 實驗

1.1材料與設(shè)備

材料：嗜熱鏈球菌，培養(yǎng)環(huán)境：嗜熱鏈球菌在M17培養(yǎng)基中培養(yǎng)，條件為38℃，搖床速度為140 r/min。乳源生物活性肽QEPV，F(xiàn)AM，F(xiàn)ITC，F(xiàn)AM-QEPV以及FITC-QEPV（純度>98%）。

試劑：M17培養(yǎng)基，PBS和MTT試劑，二甲基亞砜（DMSO），瓊脂粉。

設(shè)備：Corning Transwell 96孔板，Mettler-Toledo電子分析天平，上海恒科GRX-9072A型干燥箱，上海盧湘儀GL-22M高速冷凍離心機，ZEALWAY壓力蒸汽滅菌器，上海精宏THZ-320型恒溫振蕩器，上海三信B-1便攜式pH值計，Tecan infinite M200 pro酶標(biāo)儀，Thermo Forma 700 Series-80℃超低溫冰箱，BD C6流式細胞儀。

1.2方法

1.2.1 乳酸菌的純化與保存

取少量冷凍干燥的嗜熱鏈球菌菌粉，接種到M17培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，按照10，102，103，104，105，106濃度梯度進行稀釋，取合適濃度梯度平板涂布到M17瓊脂培養(yǎng)基（M17液體培養(yǎng)基加入質(zhì)量分數(shù)為1.25%瓊脂），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，挑選單菌落富集培養(yǎng)，活化3次使用和保存。

1.2.2 菌體濃度與OD600值標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

取活化的嗜熱鏈球菌，按體積分數(shù)為5%添加量接種到M17培養(yǎng)基中。取對數(shù)生長期前期培養(yǎng)液，按2，4，6，8，10，20，40，100濃度梯度進行稀釋，測定各稀釋度下的OD600與菌落數(shù)（平板涂布法）[12]。建立OD600值與菌落數(shù)的關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 嗜熱鏈球菌吸收熒光標(biāo)記QEPV實驗

分別配制添加質(zhì)量濃度為2 mg/mL的FAMQEPV、質(zhì)量濃度為2 mg/mL的FITC-QEPV的M17培養(yǎng)基，及添加等摩爾量的水、QEPV、FAM與FITC的M17培養(yǎng)基。將3次活化的嗜熱鏈球菌用M17培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.3左右，3 500 r/min離心10 min棄上清，立即將重懸菌體在避光條件下分別用上述培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取培養(yǎng)液，在4℃、3 500 r/min條件下離心10 min，棄上清，繼續(xù)用PBS洗滌菌體3次，去除菌體外熒光標(biāo)記肽。將菌體重懸于等量PBS中，用流式細胞儀檢測。流式細胞儀檢測選取通道為FL1（濾光片：533/30），收集200 000個樣本。

1.2.4 生物活性肽QEPV對嗜熱鏈球菌生長影響實驗

配制添加質(zhì)量濃度為0，0.10，0.25，0.50和1.00 mg/mL生物活性肽QEPV的M17培養(yǎng)基，將3次活化的菌種按照體積分數(shù)5%添加接種到相應(yīng)培養(yǎng)基中，對照為空白培養(yǎng)基添加等量蒸餾水，將培養(yǎng)基的初始OD600值調(diào)整到0.1左右。搖床培養(yǎng)36 h，前期每隔1 h測定一次OD600值，后期每隔2 h測定一次OD600；每隔2 h測定pH值；用MTT法每隔4 h測定活菌數(shù)。

本課題采用操作簡單、被廣泛應(yīng)用于測定菌活性的MTT法測定瑞士乳桿菌活性[13-14]。取1 mL培養(yǎng)液，在4℃(3 500 r/min)條件下離心10 min，去上清液。用1 mL的PBS重懸菌體。取200 L重懸菌液，加入60 uL的1×MTT，在避光條件下繼續(xù)培養(yǎng)嗜熱鏈球菌1 h，在4℃（3 500 r/min）條件下離心10 min，棄上清液，加入200 L DMSO，取200 L測量OD570值。

1.3數(shù)據(jù)分析

利用Origin軟件進行數(shù)據(jù)分析及圖表制作，用SPASS進行顯著性分析。所有數(shù)據(jù)用采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。

2 結(jié)果與討論

本實驗室的前期研究結(jié)果表明瑞士乳桿菌發(fā)酵牛奶、分解酪蛋白產(chǎn)生的生物活性肽QEPV具有抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等多項功能[6-9]。瑞士乳桿菌和嗜熱鏈球菌具有顯著的互惠關(guān)系，生物活性肽QEPV可能是發(fā)揮互惠調(diào)節(jié)作用的中間物質(zhì)。通過MTT測定不同離心速度下收集到的菌活性以選擇合適的離心條件。在4℃（10 min）條件下，分別測定3 000，3 500，4 000和5 000 r/min收集到嗜熱鏈球菌菌體的菌活性，得出最佳離心速度為3 500 r/min。

2.1菌體濃度與OD600值標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

平板涂布48 h后嗜熱鏈球菌稀釋倍數(shù)為105組三個平板上統(tǒng)計的菌落數(shù)161，159，134個；均值為151.33±12.28。計算出原始培養(yǎng)液的活菌數(shù)（CFU）[12]。測定菌液不同稀釋濃度下的OD600值。將不同稀釋度的嗜熱鏈球菌活菌數(shù)（CFU）與對應(yīng)的OD600值進行擬合，作活菌數(shù)與OD600間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 嗜熱鏈球菌活菌數(shù)（CFU）與OD600關(guān)系的擬合曲線

由圖1可以看出，光密度隨著菌體濃度的增大而增大，并呈良好線性關(guān)系，OD600與活菌數(shù)的關(guān)系為：y=7.62229×109x。該結(jié)果與胡志和等在研究酪蛋白水解產(chǎn)物對瑞士乳桿菌生長的影響時得出的結(jié)論相似[15]。

2.2嗜熱鏈球菌對QEPV吸收性

流式細胞術(shù)是一種測量液相中合適體積懸浮細胞或微粒的物理和化學(xué)性質(zhì)的現(xiàn)代分析技術(shù)。流式細胞術(shù)在乳酸菌中研究應(yīng)用廣泛[16]。本課題用質(zhì)量濃度為2 mg/mL的FAM標(biāo)記的QEPV（FAM-QEPV）與對數(shù)生長期中期的嗜熱鏈球菌共培養(yǎng)4 h后除去菌體外的FAM-QEPV，然后用流式細胞儀檢測。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)4 h后，F(xiàn)AM-QEPV組熒光強度顯著高于QEPV組和對照組，說明FAM-QEPV能夠穿過嗜熱鏈球菌細胞膜，被嗜熱鏈球菌吸收。

圖2 流式細胞儀檢測嗜熱鏈球菌吸收FAM標(biāo)記QEPV實驗結(jié)果

為排除因洗滌不完全等因素造成的假陽性，在嗜熱鏈球菌接種到添加FAM-QEPV培養(yǎng)基后立即洗滌菌體，結(jié)果如圖3所示。FAM-QEPV與菌體共培養(yǎng)0 h的熒光強度與QEPV組和對照組沒有產(chǎn)生顯著性差異。說明0 h時FAM-QEPV并沒有被菌體吸收，并且所選擇的洗滌條件在沒有破壞菌體的情況下完全除去了菌體外FAM-QEPV。而用FAM-QEPV培養(yǎng)菌體4 h后，熒光強度顯著高于培養(yǎng)0 h的熒光強度，結(jié)果說明了FAM-QEPV能夠被嗜熱鏈球菌吸收，排除了因洗滌不完全造成的假陽性。

圖3 流式細胞儀檢測培養(yǎng)0 h和4 h后嗜熱鏈球菌吸收FAM標(biāo)記QEPV實驗結(jié)果

為排除FAM熒光素影響了嗜熱鏈球菌對QEPV的吸收性，采用FITC標(biāo)記的QEPV（FITC-QEPV）重復(fù)上述實驗。結(jié)果如圖4所示：添加質(zhì)量濃度為2 mg/mL的FITC-QEPV與菌體共培養(yǎng)4 h后，菌體內(nèi)的熒光強度顯著高于QEPV組和對照組。結(jié)果再次驗證QEPV也能夠穿過嗜熱鏈球菌細胞膜，被嗜熱鏈球菌吸收。

圖4 流式細胞儀檢測嗜熱鏈球菌吸收FITC標(biāo)記的QEPV實驗結(jié)果

綜上所述，F(xiàn)AM標(biāo)記的QEPV和FITC標(biāo)記的QEPV均能能夠穿過嗜熱鏈球菌細胞膜被嗜熱鏈球菌吸收，推測單獨的生物活性肽QEPV也能夠被嗜熱鏈球菌吸收。FAM和FITC在研究蛋白和多肽的吸收和轉(zhuǎn)運等方面應(yīng)用廣泛。FAM常用于標(biāo)記DNA[17]，F(xiàn)ITC常用于檢測細胞凋亡[18]。兩種熒光素相對分子質(zhì)量較小，作為標(biāo)記物較適合多肽或蛋白質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運研究。Shun-lung Fang等通過流式細胞術(shù)檢測FITC標(biāo)記的ECP肽的穿膜性，得到一種新奇的穿膜肽[19]。Ankur Gautam等通過FITC標(biāo)記研究IMT-P8多肽的穿膜效果[20]。M-Lindgren等通過熒光顯微鏡和流式細胞術(shù)檢測羧基熒光素標(biāo)記的多肽在HeLa細胞內(nèi)的位置，得出了HeLa細胞對多種肽的吸收性[21]。本實驗結(jié)果與這些結(jié)果相同，說明生物活性肽能夠穿過細胞膜被乳酸菌吸收。

2.3生物活性肽QEPV對嗜熱鏈球菌生長繁殖的影響

2.3.1 對嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的影響

將嗜熱鏈球菌接種到添加不同質(zhì)量濃度生物活性肽QEPV的培養(yǎng)基中，在38℃下培養(yǎng)36 h，定時測定嗜熱鏈球菌活菌數(shù)，結(jié)果如圖5所示。嗜熱鏈球菌活菌數(shù)隨著培養(yǎng)時間的延長先增大后減小，QEPV質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL組活菌數(shù)在培養(yǎng)初期的增長速度顯著高于其他組，且質(zhì)量濃度0.50 mg/mL組的嗜熱鏈球菌首先進入衰退期，說明QEPV能夠促進嗜熱鏈球菌的增殖和生長。當(dāng)QEPV質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時，培養(yǎng)初期的活菌數(shù)增長速度和活菌數(shù)最大值低于0.50 mg/mL組，推測可能是QEPV濃度過高抑制了嗜熱鏈球菌的增殖和生長。

圖5 不同質(zhì)量濃度的生物活性肽QEPV對嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的影響

2.3.2 生物活性肽QEPV對嗜熱鏈球菌菌體濃度的影響

將嗜熱鏈球菌接種到添加不同濃度生物活性肽QEPV的培養(yǎng)基中，在38℃下培養(yǎng)36 h，定時取200 μL測定OD600，結(jié)果如圖6所示。隨著QEPV濃度的增大，其促進增殖和生長作用增強，當(dāng)QEPV質(zhì)量濃度達到0.50 mg/mL時，菌體濃度增長最快，與其他各組比較具有顯著性差異。當(dāng)QEPV質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時菌體質(zhì)量濃度增長速度低于0.50 mg/mL。說明在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，QEPV能夠有效促進嗜熱鏈球菌增殖和生長；當(dāng)QEPV濃度過高時，可能會抑制菌體增殖。

圖6 添加不同質(zhì)量濃度生物活性肽QEPV對嗜熱鏈球菌菌體質(zhì)量濃度的影響

2.3.3 生物活性肽QEPV對嗜熱鏈球菌發(fā)酵能力的影響

嗜熱鏈球菌發(fā)酵過程產(chǎn)生大量的乳酸，通過測定培養(yǎng)基的pH值能間接反映乳酸的質(zhì)量濃度。實驗中測定了嗜熱鏈球菌培養(yǎng)液pH值隨時間的變化，結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同質(zhì)量濃度生物活性肽QEPV對嗜熱鏈球菌發(fā)酵能力（pH值）的影響

測定結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時間延長，各組pH值均出現(xiàn)顯著性降低。QEPV質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL組與其他組相比pH值降低速度最快，而且具有顯著性差異。當(dāng)QEPV的質(zhì)量濃度上升到1.00 mg/mL時，在相同時間點pH值下降速度低于其他各組。這個結(jié)果再次說明在一定濃度范圍內(nèi)QEPV能夠有效促進嗜熱鏈球菌的生長繁殖和發(fā)酵能力，高質(zhì)量濃度的QEPV反而抑制嗜熱鏈球菌的生長繁殖和發(fā)酵能力。

發(fā)酵過程中pH值變化和菌體質(zhì)量濃度變化結(jié)果均表明0.50 mg/mL的QEPV能夠顯著促進嗜熱鏈球菌的增殖和生長，顯著增強嗜熱鏈球菌的發(fā)酵能力。但當(dāng)QEPV的質(zhì)量濃度增加到1.00 mg/mL時對嗜熱鏈球菌的作用效果低于0.50 mg/mL QEPV組。推測可能是隨著QEPV質(zhì)量濃度的增加導(dǎo)致培養(yǎng)液的滲透壓升高，反而對嗜熱鏈球菌的增殖、生長和發(fā)酵產(chǎn)生了抑制作用。胡志和等研究了乳鐵蛋白及乳鐵素對嗜酸乳桿菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白的最適添加濃度為2.50 mg/mL，乳鐵素的最適添加質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL，當(dāng)乳鐵蛋白和乳鐵素質(zhì)量濃度過高時其促增殖作用減小[22]。上述結(jié)果也說明在標(biāo)準(zhǔn)乳酸菌培養(yǎng)基中額外添加具有生物活性的蛋白質(zhì)和多肽應(yīng)注意使用質(zhì)量濃度，過多可能會對乳酸菌的生長繁殖和發(fā)酵能力產(chǎn)生抑制作用。

另外，圖5和圖6的結(jié)果都表明發(fā)酵20 h后，各組間的活菌數(shù)及菌體濃度差異不顯著，即各組間嗜熱鏈球菌總菌體數(shù)量無差異，說明添加的生物活性肽QEPV量沒有顯著改變各組培養(yǎng)基的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)。共培養(yǎng)初期，所有組培養(yǎng)液中含有滿足嗜熱鏈球菌生長發(fā)育所需的豐富營養(yǎng)物質(zhì)，但在4 ～16 h，QEPV質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL組的活菌數(shù)、菌體濃度及發(fā)酵pH值均與對照組差異顯著，說明QEPV并非作為普通的營養(yǎng)物質(zhì)被嗜熱鏈球菌利用。由于QEPV不具有影響其生物活性的空間構(gòu)象，其在體內(nèi)外獨立發(fā)揮調(diào)節(jié)菌體生長發(fā)育等功能性作用的可能性小。結(jié)合嗜熱鏈球菌對QEPV具有良好的吸收性，推測QEPV作為對嗜熱鏈球菌有益的生物活性物質(zhì)，優(yōu)先被嗜熱鏈球菌吸收、利用而發(fā)揮促生長等作用。

3 結(jié)束語

本課題采用流式細胞術(shù)采用FAM標(biāo)記和FITC標(biāo)記的生物活性肽QEPV與對數(shù)生長期的菌體共培養(yǎng)，研究嗜熱鏈球菌對QEPV的吸收性。結(jié)果表明，無論是FAM標(biāo)記，還是FITC標(biāo)記的QEPV均能夠被嗜熱鏈球菌吸收進入菌體，說明嗜熱鏈球菌對生物活性肽QEPV具有良好的吸收性。采用MTT法測定不同QEPV濃度對嗜熱鏈球菌體濃度，活菌數(shù)和發(fā)酵液pH值的影響。結(jié)果表明，質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL的QEPV能夠顯著促進嗜熱鏈球菌的生長、繁殖和發(fā)酵。而質(zhì)量濃度1.00 mg/mL QEPV對嗜熱鏈球菌生長、繁殖和發(fā)酵的促進作用降低，說明高質(zhì)量濃度的QEPV對嗜熱鏈球菌的生長、繁殖和發(fā)酵有一定的抑制作用。結(jié)合QEPV不具有空間構(gòu)象并且QEPV能夠被嗜熱鏈球菌吸收進入菌體，推測QEPV作為對嗜熱鏈球菌有益的生物活性物質(zhì)，優(yōu)先被嗜熱鏈球菌吸收、利用而發(fā)揮促生長等作用。

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Absorption and utilization of bioactive peptide QEPV byStreptococcus thermophilus

CHENG Zhi-caia,CHEN Jinga,LI Wan-rua,SHEN Penga,GE Jie-yua,ZHANG Shao-huiab
（Shanghai Jiao Tong University a.School of Agriculture and Biology;b.Bor S.Luh Food Safety Research Center,Shanghai 200240,China)

This study was focused on the absorption and utilization of bioactive peptide Gln-Glu-Pro-Val(QEPV)byStreptococcus ther?mophilus.First,Streptococcus thermophiluswas cultured with FAM-QEPV or FITC-QEPV,then flow cytometry technology was applied for detection of FAM-QEPV or FITC-QEPV in vivo.The utilization of milk-derived peptide QEPV byStreptococcus thermophilusof in?vestigated by studying the effect of QEPV on the relative number of living cells,the pH of culture solution and the concentration of bacteri?um.The results show that QEPV could significantly promote the growth ofStreptococcus thermophilusat the concentration of 0.50 mg/ml. The results of flow cytometry show that FAM-QEPV and FITC-QEPV could be absorbed byStreptococcus thermophilus.We can prelimi?nary come to the conclusion that QEPV could be absorbed byStreptococcus thermophiles.

bioactive peptide;streptococcus thermophilus;absorption;utilization

Q93-33

A

1001-2230（2016）11-0004-04

2016-06-29

程志才（1990-），男，碩士研究生，主要研究方向為乳品科學(xué)。

張少輝