喻 琴綜述，王 麗審校

（西南醫(yī)科大學：1基礎(chǔ)醫(yī)學院；2附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川瀘州 646000）

非酒精性脂肪性肝病動物模型研究進展

喻 琴1綜述，王 麗2審校

（西南醫(yī)科大學：1基礎(chǔ)醫(yī)學院；2附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川瀘州 646000）

非酒精性脂肪性肝??；脂肪性肝炎；動物模型

非酒精性脂肪性肝病 （nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指由非酒精因素和其他不明病因所致的，以大量脂肪堆積于肝細胞內(nèi)為主要特征的臨床病理綜合征，可從單純性脂肪肝發(fā)展至脂肪性肝炎、肝纖維化，甚至導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生。其病理改變主要有肝細胞脂肪變性、肝細胞氣球樣變、以淋巴細胞為主的炎細胞浸潤和纖維化等[1]。近年來，隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國的NAFLD發(fā)病率成逐年上升趨勢，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，其病因和發(fā)病機制復(fù)雜，目前仍未完全闡明，其主要環(huán)節(jié)可能是胰島素抵抗（IR）和氧化應(yīng)激，此外，脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素、內(nèi)脂素及腫瘤壞死因子-α等多種脂肪細胞因子也參與了肝臟脂肪變性、炎細胞浸潤及纖維化改變[2]。為深入研究其發(fā)病機制，有效地預(yù)防和治療NAFLD，建立理想的能涵蓋人體病理改變的動物模型極為重要。本文就近幾年國內(nèi)外常見的NAFLD動物模型的優(yōu)缺點及最新研究進展做一綜述，以期為根據(jù)不同實驗?zāi)康倪x擇相應(yīng)的實驗動物模型提供參考，且為以后建立更穩(wěn)定的與人類病變更為相似的模型打下基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)外用于科研的NAFLD動物模型主要有營養(yǎng)失調(diào)性模型、藥物中毒性模型、基因敲除或基因突變性模型、復(fù)合性模型，茲介紹如下。

1 營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝模型

目前 ，營養(yǎng)失調(diào)性模型仍是最常見的NAFLD模型，即給予動物高脂、高糖飼料喂養(yǎng)建立的脂肪肝模型。其主要發(fā)病機理是營養(yǎng)過剩，食物中脂類、膽固醇或（和）糖類過量，無法完全吸收利用，脂類堆積于肝臟而引發(fā)脂肪肝，進一步出現(xiàn)炎癥改變及纖維化?？山I養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝模型的動物種屬很多，主要包括大鼠、小鼠 、家兔 、雞 、豬等 ，其中大鼠最為常見 。

1.1 大 鼠

大鼠是建立脂肪肝動物模型最常用的動物種屬。不同的飼料配方（高脂高糖飼料）均可成功建立非酒精性脂肪肝模型。

1.1.1 高脂飼料誘發(fā)模型

目前，國內(nèi)外學者大多采用基礎(chǔ)飼料加豬油或膽固醇或蛋黃喂養(yǎng)大鼠建立高脂飼料脂肪肝模型。劉云龍等[3]用基礎(chǔ)飼料加15%豬油、13%雞蛋黃粉、5%全脂奶粉和2%白砂糖喂養(yǎng)雄性SD大鼠12周，成功建立脂肪肝模型，并用此模型研究綠原酸對高脂飼料誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝大鼠細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響[3]。樊希承等[4]用含10%豬油、1%膽固醇、0.3%膽鹽的高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠，7周后大鼠肝實質(zhì)細胞發(fā)生脂肪變性，造模成功，并應(yīng)用此模型觀察脂肪肝的逆轉(zhuǎn)狀況，評價脂肪肝轉(zhuǎn)歸的影響因素，發(fā)現(xiàn)多數(shù)單純性脂肪肝如能早期診治，可以阻止脂肪肝的進一步發(fā)展并使其逆轉(zhuǎn)，抗脂肪肝治療好于自然恢復(fù)。此類模型存在的主要缺點是造模時間長、病變輕。但由于造模方法簡便、重復(fù)性好、動物死亡率低且與臨床高脂血癥或肥胖引起的脂肪肝相似，造模停止后病變逆轉(zhuǎn)緩慢便于藥物干預(yù)研究，目前仍是國內(nèi)外最常用的NAFLD模型。

此外，也有學者采用高脂液體飼料喂養(yǎng)大鼠造模，此種模型造模所需時間較大鼠自由進食高脂固體飼料短，發(fā)病機制與人體高脂血癥引起的脂肪肝相似，但每天灌胃較為繁瑣，且如操作不當易損傷動物食道或引起動物窒息死亡。

1.1.2 高糖飼料誘發(fā)模型

Kawasaki等[5]用富含果糖的飲食喂養(yǎng)5周齡的Wistar大鼠5周，肝細胞出現(xiàn)明顯的大泡性脂肪變 、肝臟與體重的比值增加、肝臟甘油三脂濃度增加，造模成功，其形成機制與我國部分人群不良飲食習慣導(dǎo)致的脂肪肝類似。有不少學者采用禁食+高糖的方法建立脂肪肝模型，多將雄性Wistar大鼠禁食48 h后給予高糖飼料（雙糖、淀粉），2 d后形成單純性脂肪肝。該脂肪肝模型的形成可能與肝臟合成脂肪酸的循環(huán)失衡和甘油三酯的合成與分泌失衡有關(guān)。此模型具有造模時間短、成功率高、便于觀察的特點；但最大的缺陷在于禁食48 h后再進食與人體自然發(fā)病機制不相符，也因此限制了其應(yīng)用。

1.2 其他動物種屬

除了大鼠，小鼠、家兔、雞和豬也可用于建立NAFLD模型。盡管小鼠生命周期較短，不太適合長時間給藥觀察，但由于體型小，易于飼養(yǎng)和管理，仍有越來越多的高脂誘導(dǎo)小鼠脂肪肝模型被建立。Seung等[6]用兩種脂肪含量不同（45%和60%）的高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠建立脂肪肝模型，并研究一氧化氮合酶在脂肪肝模型中的分布情況，15周后成功建立NAFLD模型，且60%脂肪熱量組的肝細胞小泡性脂肪變比45%脂肪熱量組的更嚴重，同時觀察到一氧化氮合酶在脂肪肝模型組中的分布比正常組多，這為后續(xù)的肥胖、糖尿病及NAFLD的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。此外，也有人用兔、雞和豬建立營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝模型，有學者以高脂飼料喂養(yǎng)雄性新西蘭家兔，建模成功[7]，這種模型體積大，適合臨床影像學檢查，這是其他小型動物不具有的特點；國外學者曾用高脂糊狀飼料喂養(yǎng)3周齡的雄性白色來航雞，6個月后雞肝組織出現(xiàn)大、小泡混合性脂肪變性以及大范圍的炎癥浸潤[8]，此種模型建模時間長，限制了其應(yīng)用；有少數(shù)人用豬建立營養(yǎng)失調(diào)性NAFLD模型[9]，雖然豬與人類的NAFLD病史更為相似，但是飼養(yǎng)成本較高，目前應(yīng)用也不多。

2 藥物中毒性脂肪肝模型

目前國內(nèi)外常用四氯化碳（CC14）、四環(huán)素、乙硫氨酸等藥物建立中毒性非酒精性脂肪肝模型。

2.1 四氯化碳誘發(fā)模型

四氯化碳是最早用于建立中毒性脂肪肝模型的化學物質(zhì)，是一種肝毒性藥物，可造成急性肝損傷，其主要機制可能是通過誘導(dǎo)CYP2E1激活及嚴重脂質(zhì)過氧化反應(yīng)造成肝細胞結(jié)構(gòu)和功能破壞。給予大鼠皮下注射四氯化碳0.5 mL/kg，每周3次，短時間內(nèi)即可觀察到中重度大泡性肝細胞脂肪變，伴炎癥及壞死。此外，以四氯化碳灌胃也可建立脂肪肝模型，并在此基礎(chǔ)上進行藥物研究[10]。

2.2 四環(huán)素誘發(fā)模型

四環(huán)素是一種抗生素類化學藥物，可用于誘發(fā)動物脂肪肝，主要通過干擾線粒體DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，影響線粒體脂肪酸β-氧化，繼而造成肝細胞脂肪變性。Yin等[11]給2組雄性CD-1（ICR）BR Swiss大鼠一次性口服四環(huán)素0.1 g/kg或1 g/kg后，高劑量組大鼠在24 h即可見肝細胞小泡性脂肪變，并發(fā)現(xiàn)脂肪酸的β-氧化受抑制，也應(yīng)用此模型做NAFLD基因方面的研究，其他學者采用腹腔注射四環(huán)素的方法也獲得了類似結(jié)果[12]。

2.3 乙硫氨酸誘發(fā)模型

乙硫氨酸可使肝臟蛋白質(zhì)合成發(fā)生障礙，進而使載脂蛋白的復(fù)合物生成減少，導(dǎo)致三酰甘油蓄積于肝臟，引起脂肪肝。Leclercq I等人給予白鼠腹腔注射乙硫氨酸0.02 mmol/kg/ d，連續(xù)7 d后處死白鼠，肝組織病理學切片顯示出現(xiàn)了肝細胞小泡性脂肪病變。近年來，國內(nèi)學者用乙硫氨酸灌胃的方法也成功建立小鼠脂肪肝模型[13]。

以上幾種中毒性模型具有建模迅速、方法簡便、病變明顯的優(yōu)點，但其發(fā)病機制、病理、病理生理改變與人體非酒精性脂肪肝差異較大，且多數(shù)藥物毒性強，動物死亡率高，研究者可根據(jù)其研究目的和研究條件決定是否建立此類模型。

3 基因敲除或基因突變性脂肪肝模型

脂肪肝的形成不僅受飲食等環(huán)境因素的影響，也與遺傳學因素密切相關(guān)，基因水平的變化可造成肝細胞脂肪變性。通過人為地對動物進行基因敲除或使其基因突變可建立非酒精性脂肪肝模型。

3.1 FLS小鼠模型

Soga等用同系交配的方法建立了一個新種系的小鼠，即FLS（fatty liver shionogi）小鼠，這種基因突變小鼠可自發(fā)形成脂肪肝，甚至發(fā)展成肝癌，但不伴有肥胖和糖尿病。新生 FLS小鼠肝細胞內(nèi)含有大小不等的脂滴，隨鼠齡增長，脂滴進行性增大，肝內(nèi)甘油三酯（triglyceride，TG）的含量明顯增加，達到正常小鼠的5倍，易自發(fā)形成肝細胞癌。雜交實驗提示FLS小鼠的脂肪肝具有多基因特征，可用于研究肝脂肪變性進展成肝癌的病因和發(fā)病機制。

3.2 ADK-/-小鼠模型

Boison等用破壞腺苷激酶（adenosine kinase，ADK）基因的方法成功建立出生后致死性NAFLD模型。ADK-/-小鼠胚胎發(fā)育正常，出生后4 d即發(fā)生肝細胞小泡性脂肪變，并于2周內(nèi)死亡。該模型建立所需時間短，但最大的缺陷在于模型是快速致死性的，不能用于藥物療效觀察等方面的研究，實際應(yīng)用受限。

3.3 ArKO小鼠模型

Chow等[14]通過敲除芳香酶基因Cyp9（aromatase knockout，ArKO）建立了小鼠脂肪肝模型[14]，研究發(fā)現(xiàn)雌激素α受體激動劑可改善小鼠脂肪肝變性。芳香酶基因Cyp9敲除后，小鼠不能合成內(nèi)源性雌激素，導(dǎo)致腹腔內(nèi)脂肪細胞的體積和數(shù)量顯著高于野生型同窩鼠，提示雌激素在維持脂肪代謝中具有重要作用[15]。

3.4 肝細胞特異性PTEN缺陷小鼠模型

磷酸酶及強力蛋白同源蛋白（phosphataseandtensinhomologdetectedon chromosometen，PTEN）是一種位于10號染色體上的抑癌基因，是以磷酯酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PIP3） 為基質(zhì)的磷酸酶[16]，PTEN缺陷細胞表現(xiàn)為其生長和代謝亢進，易于癌變。Horie Y等[17]特異性敲除小鼠肝細胞PTEN基因，建立NAFLD模型，在此模型可見肝細胞脂肪變性和風帆樣腫大、淋巴細胞及中性粒細胞為主的炎細胞浸潤、旁竇狀隙纖維化和出現(xiàn)Mallory小體等酷似人NAFLD的病理學改變[17]，重現(xiàn)“單純性脂肪肝-脂肪性肝炎-肝纖維化”的NAFLD自然經(jīng)過。脂肪肝的形成與過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ及Akt-SREBP1c信號傳導(dǎo)途徑的激活和脂聯(lián)蛋白（adiponectin）、脂肪細胞蛋白酶（adipsin）、激活蛋白2（activatorprotein 2）、脂肪酸合成酶（fattyacidsynthetase，F(xiàn)AS）以及乙酰輔酶A羧化 （acetyl-CoA carboxylase，ACC）等脂肪酸合成酶相關(guān)基因的表達增加有關(guān)；此外，氧化應(yīng)激的增加可引起細胞膜脂質(zhì)過氧化引發(fā)的肝細胞損害而造成脂肪性肝炎。由于此類模型復(fù)制出的NAFLD與人類病變極為相似，因此，近年來，該模型備受矚目。大鼠與人類的同源性高于小鼠，如果未來對大鼠進行特異性PTEN基因敲除建立脂肪肝模型，其復(fù)制出的疾病與人類NAFLD將更加相似，對于研究其發(fā)病機制及防治也將更為有利。

盡管目前許多基因工程動物模型價格昂貴，但其能夠從整體水平、組織器官水平及細胞和分子水平進行研究，為NAFLD的發(fā)病機制、藥物篩選等研究提供比較理想的實驗體系，未來諸如此類的模型將會越來越多。

4 復(fù)合脂肪肝模型

由于上述三類單一模型的發(fā)病機制和組織病理改變等疾病特征均與人體NAFLD存在一定差異。近年來，許多研究者聯(lián)合應(yīng)用營養(yǎng)、藥物和基因誘發(fā)模型，以期使復(fù)合模型的疾病特征與人體NAFLD更接近，更能反映疾病從單純性脂肪肝向脂肪性肝炎進展，脂肪性肝炎向肝纖維化進展的過程。建立復(fù)合模型的常見方法包括:高脂飲食+四氯化碳[18]，ob/ob小鼠+蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）飲食[19]，ApoE-/-小鼠+高脂飲食[20]，PPARα-/-小鼠+MCD飲食等，用這些方法均能復(fù)制出發(fā)病機制、病理組織學變化及發(fā)病經(jīng)過與人類酷似的NAFLD模型。由于復(fù)合模型最大程度地模擬了人類NAFLD的復(fù)雜性，病理變化顯著，是一種極具潛力的非酒精性脂肪肝模型。

5 幾種非酒精性脂肪肝動物模型優(yōu)缺點比較

不同致病因素所致脂肪肝動物模型的形成機制及病理改變各異，各有其優(yōu)點和缺陷。

營養(yǎng)失調(diào)性模型建模方法簡便、重復(fù)性好，與人類NAFLD的致病機制相似，能出現(xiàn)胰島素抵抗、代謝綜合征等全身代謝紊亂表現(xiàn)，肝臟病變多具有漸進性發(fā)展的特點，但建模所需時間較長；藥物中毒性模型建模迅速、方法簡便、病變明顯，但其發(fā)病機制、病理改變與人體NAFLD差異較大，且藥物毒性強，動物死亡率高；基因敲除或基因突變性模型能自發(fā)形成脂肪肝，且伴肥胖、胰島素抵抗等代謝綜合征，能從整體水平、組織器官水平及細胞和分子水平進行研究，但價格昂貴，且部分模型缺乏NAFLD的自然演變過程；復(fù)合模型能最大程度地模擬人類NAFLD的復(fù)雜性，病理變化顯著，其不足在于與單一模型相比，建模過程稍復(fù)雜。

6 展 望

經(jīng)過國內(nèi)外研究者數(shù)十年的努力，NAFLD動物模型的研究有了很大進展，許多模型已用于NAFLD發(fā)病機理、藥物療效觀察、臨床影像學等研究，且在基礎(chǔ)和臨床領(lǐng)域均取得一定成績。好的NAFLD動物模型應(yīng)具有以下特點：符合人類脂肪肝發(fā)病機制、形成過程及病變特征，建模快，動物死亡率低，復(fù)制率高，重復(fù)性好，方法簡便。許多復(fù)合模型雖然能很大程度地反映NAFLD“單純性脂肪肝-脂肪性肝炎-肝纖維化”的典型疾病過程，但至今仍缺乏能完全涵蓋人類NAFLD疾病特征的單一動物模型。今后的研究應(yīng)在完善已有模型的基礎(chǔ)上，更多地致力于基因工程模型的改造和建立，探索新的造模方法，使動物模型更貼近人類NAFLD的特點，以期對疾病進行更深入的研究，闡明其發(fā)病機制，更好地防治NAFLD。

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（2015-11-05收稿）

R332

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.03.031

喻 琴（1991-），女，碩士生，E-mail：534138116@qq.com。