文　韻　桂　春　黃偉強(qiáng)　文　宏　韋　恒　鄭慧蕾　曾志羽

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心內(nèi)科，廣西　南寧　530021)

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風(fēng)濕性心臟病二尖瓣組織Th17細(xì)胞軸相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平

文韻桂春1黃偉強(qiáng)文宏韋恒鄭慧蕾曾志羽

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心內(nèi)科，廣西南寧530021)

摘要〔〕目的探討慢性風(fēng)濕性心臟病(RHD)患者心臟二尖瓣瓣膜上Th17細(xì)胞軸相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-21、IL-6、IL-23表達(dá)水平的改變。方法選擇 20例 RHD患者及12例非RHD對照組二尖瓣瓣膜組織(NRHD組)，應(yīng)用蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組化法對IL-17、IL-21、IL-6、IL-23表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果RHD組HE染色可見瓣膜組織部分出現(xiàn)纖維化和鈣化，局灶性散在的慢性炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞為主。免疫組織化學(xué)染色可見慢性炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞存在IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表達(dá)且定位于細(xì)胞質(zhì)中，炎性細(xì)胞主要位于血管旁。RHD組 IL-17、IL-21、IL-6、IL23表達(dá)陽性細(xì)胞比例及其乘積評分均明顯高于NRHD組(P<0.05)。結(jié)論RHD患者瓣膜中Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)明顯增高，高Th17表達(dá)可能是引起RHD持續(xù)瓣膜損害的一個(gè)潛在機(jī)制。

關(guān)鍵詞〔〕風(fēng)濕性心臟?。籘h17細(xì)胞；細(xì)胞因子

1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院西院心內(nèi)科

第一作者：文韻(1990-)，女，在讀碩士，主要從事風(fēng)濕性心臟病、冠心病方面的研究。

風(fēng)濕性心臟病(RHD)是A組β溶血性鏈球菌感染引起的風(fēng)濕熱(RF)的后遺癥，是一種自身免疫性疾病〔1〕，并與細(xì)胞因子相關(guān)聯(lián)〔2,3〕。Th17細(xì)胞作為最新被確認(rèn)的效應(yīng)細(xì)胞系，在防御細(xì)胞外細(xì)菌感染、介導(dǎo)慢性炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究證明，Th17細(xì)胞參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、哮喘等〔4～6〕多種自身免疫性疾病的病理過程。但是Th17細(xì)胞及其效應(yīng)因子在RHD中的表達(dá)目前尚未完全明確。本文擬初步探討Th17細(xì)胞在慢性RHD中的作用，為進(jìn)一步闡明和完善RHD的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料來源隨機(jī)選取廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年10月至2014年3月行二尖瓣置換術(shù)的RHD患者20例為RHD組，男8例，女12例，年齡(50.30±1.786)歲。另外選取12例非RHD行二尖瓣置換術(shù)(退行性二尖瓣后瓣脫垂)患者二尖瓣前瓣瓣葉作對照(NRHD組)，男6例，女6例，年齡(58.58±2.204)歲。兩組選取病例均通過心臟超聲確診。本實(shí)驗(yàn)所選取人體標(biāo)本均通過病人及其家屬知情同意。兔抗人白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-6、IL-23單克隆抗體采用Abcam公司產(chǎn)品，兔抗人IL-21單克隆抗體采用Novus公司產(chǎn)品，S-P免疫組化試劑盒采用北京中杉金橋公司產(chǎn)品，DAB顯色試劑盒采用福州邁新公司產(chǎn)品。

1.2標(biāo)本制備兩組均在術(shù)中建立體外循環(huán),心臟停跳后30 min內(nèi)取材，立即放入4%多聚甲醛固定16 h后，移入脫鈣液中，浸泡至組織脫鈣軟化，常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片厚4 μm,作蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.3HE染色和免疫組化將石蠟切片進(jìn)行HE染色，觀察炎癥細(xì)胞浸潤和組織學(xué)形態(tài)。同時(shí)石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)后再加入3%H2O2去離子水去除內(nèi)源性過氧化物酶，置于正常山羊血清工作液中，室溫下封閉15 min，加入上述各單克隆抗體，4℃過夜后加入生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體。上述每級抗體孵育后，使用PBS充分洗滌。DAB室溫下顯色5～10 min后，蘇木素染核、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.4結(jié)果判定IL-17、IL-21、IL-6、IL-23均以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)不同程度的棕黃色判定為陽性反應(yīng)。以PBS取代一抗作為空白對照。采用許良中等〔7〕的半定量公式判斷染色結(jié)果。隨機(jī)選取5個(gè)典型高倍鏡視野(400倍)計(jì)數(shù)每個(gè)視野下細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)。首先就染色強(qiáng)度打分，以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特性(染色深淺的判定需要與背景著色深淺相比較)計(jì)分：棕褐色判為3分，棕黃色判為2分，淺黃色判為1分，無著色判為0分；再將陽性細(xì)胞所占百分比打分，陽性細(xì)胞比例的計(jì)算方法：陽性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為陽性細(xì)胞11%～50%，3分為陽性細(xì)胞51%～75%，4分為陽性細(xì)胞≥75%。陽性細(xì)胞的百分比與染色強(qiáng)度的乘積>3分為免疫反應(yīng)陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1HE染色RHD組HE染色結(jié)果可見瓣膜組織部分出現(xiàn)纖維化和鈣化，局灶性散在的慢性炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞為主，見圖1。

2.2免疫組化染色慢性炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞存在IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表達(dá)且定位于細(xì)胞質(zhì)中，炎性細(xì)胞主要位于血管旁，見圖2、圖3。RHD組 IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表達(dá)陽性細(xì)胞比例及其乘積評分均明顯高于NRHD組(P<0.05)，見圖4。

圖1　兩組患者二尖瓣膜病理HE染色(×400)

圖2　兩組患者心瓣膜IL-17、IL-21免疫組化表達(dá)(DAB，×400)

圖3　兩組患者心瓣膜IL-6、IL-23免疫組化表達(dá)(DAB，×400)

與NRHD組比較：1)P<0.05圖4　兩組IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表達(dá)

3討論

本文發(fā)現(xiàn)， Th17細(xì)胞自分泌的細(xì)胞因子IL-17和IL-21在人類慢性RHD瓣膜中的表達(dá)與對照組相比明顯增加，同時(shí)促進(jìn)Th17細(xì)胞分化的正向調(diào)節(jié)因子IL-6和IL-23與對照組也存在差異。本研究證實(shí)所有患者風(fēng)濕活動(dòng)屬于慢性穩(wěn)定期，表明該Th17細(xì)胞的表達(dá)不是由鏈球菌急性感染引起的，在慢性RHD疾病穩(wěn)定期，Th17細(xì)胞造成的自身免疫損害占主要優(yōu)勢。同時(shí)，在慢性RHD瓣膜中，Th17相關(guān)細(xì)胞因子在炎癥細(xì)胞上的表達(dá)為局灶性的分布，這與Guilherme等〔3〕的研究結(jié)果風(fēng)濕性病變瓣膜組織有慢性炎癥和炎性細(xì)胞局灶浸潤相一致。

Wang等〔8〕的研究顯示，β鏈球菌感染誘導(dǎo)的組織生長因子(TGF)-β1和IL-6，有助于CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞系的發(fā)育。在他們的研究中，Th17細(xì)胞的免疫是被動(dòng)轉(zhuǎn)移到裸鼠中去的，并且顯示對抗鏈球菌的保護(hù)性免疫依賴于Th17細(xì)胞系。我們的研究結(jié)果也證實(shí)，促進(jìn)Th17細(xì)胞分化的正向調(diào)節(jié)因子IL-6、IL-23在瓣膜中表達(dá)明顯增加，可以認(rèn)為 IL-6和IL-23表達(dá)升高可能促進(jìn)了Th17細(xì)胞的分化。Th17細(xì)胞在對抗鏈球菌和導(dǎo)致自身免疫是必需的。最近，Bas等〔9〕報(bào)道，風(fēng)濕性心臟病患者外周Th17細(xì)胞的百分比和血清中Th17/Treg的比例顯著升高。Guilherme等〔10〕通過分析來源于慢性RHD患者外周T細(xì)胞中的IL-17A基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)來源于RHD患者的外周T細(xì)胞表現(xiàn)出IL-17A過表達(dá)，他們還闡述發(fā)現(xiàn)大量的IL-17和IL-23存在于心瓣膜細(xì)胞中〔11〕。根據(jù)以上研究推測，在風(fēng)濕性心臟病早期，易感個(gè)體中反復(fù)的鏈球菌暴露連同長期和過度的Th17反應(yīng)可能引發(fā)心瓣膜炎，而在風(fēng)濕性心臟病的晚期，Th17細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫作用持續(xù)加重了心臟瓣膜的損害。但這一假設(shè)還需要進(jìn)一步的評估。

由于RHD病因復(fù)雜、影響因素較多以及動(dòng)物模型建立困難等，目前并沒有特別的治療能夠有效防止RHD的進(jìn)展。在全球范圍內(nèi)，每3～4 w肌內(nèi)注射芐星青霉素G(BPG)的二級預(yù)防仍被推薦〔12〕。然而，二級預(yù)防的效果是有限的，因?yàn)槿駼PG的供應(yīng)量和質(zhì)量存在差異，且患者每3～4 w注射BPG的依從率較低〔13〕。因此，需要新的策略防止急性RF的復(fù)發(fā)以及RHD的進(jìn)展。本研究也存在一定的局限性，僅僅使用免疫組化的方法檢測Th17部分相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，且只是研究了在RHD慢性期瓣膜的改變，未研究急性期瓣膜的改變，這也是我們將來研究的內(nèi)容。

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〔2014-12-27修回〕

(編輯徐杰)

通訊作者：曾志羽(1965-)，男，教授，主要從事風(fēng)濕性心臟病、冠心病方面的研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260067)；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂攻科1355005-4-4)

中圖分類號〔〕R593.21〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0061-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.026