劉 冬 葉紅玲 李 萍 譚 煒

(1. 安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 安慶 246003；2. 安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051)

沙門柏干酪青霉多糖提取工藝優(yōu)化及其抗凍傷活性研究

劉 冬1葉紅玲1李 萍1譚 煒2

(1. 安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 安慶 246003；2. 安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051)

利用單因素和Box-Behnken試驗(yàn)對(duì)沙門柏干酪青霉胞內(nèi)多糖提取工藝(水料比、提取溫度和提取時(shí)間)進(jìn)行優(yōu)化，并評(píng)價(jià)胞內(nèi)多糖的抗凍傷活性。結(jié)果表明：最適水料比、提取溫度和提取時(shí)間分別為36.7∶1(mL/g)、89.6 ℃和123 min，在該條件下多糖得率約為12%。另外，胞內(nèi)多糖抗凍傷活性與甘油相當(dāng)，1%～2%的多糖可顯著提高短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌的存活率。

沙門柏干酪青霉；多糖；提取條件；冷凍保護(hù)劑

沙門柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)是Camembert 干酪的主要成熟劑，它生長(zhǎng)在 Camembert干酪的表面，呈白色[1]。在干酪成熟過程中，沙門柏干酪青霉分泌大量的脂肪酶和蛋白水解酶促進(jìn)干酪的成熟，并形成Camembert干酪典型的風(fēng)味和特有的組織結(jié)構(gòu)[2]。目前，關(guān)于P.Camemberti的研究主要集中在其對(duì)干酪品質(zhì)的影響[3-4]以及Camembert干酪成熟過程中不同成熟劑菌群間的協(xié)同作用等方面[5-6]。此外，研究人員[7]發(fā)現(xiàn)P.Camemberti可分泌右旋磷霉素，并具有抑制病原菌的作用；Bizet 等[8]對(duì)P.Camemberti菌絲營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其富含糖類、脂類、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，其中糖類總含量為33.3%。目前，關(guān)于P.Camemberti胞內(nèi)多糖提取條件優(yōu)化的研究，未見報(bào)道。本研究擬以沙門柏干酪青霉菌絲體為材料，采用單因素和Box-Behnken試驗(yàn)對(duì)胞內(nèi)多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并評(píng)價(jià)沙門柏干酪青霉胞內(nèi)多糖對(duì)冷凍干燥處理過程中雙歧桿菌的保護(hù)作用，旨在提高沙門柏干酪青霉胞內(nèi)多糖的提取率，并為該多糖在益生菌冷凍保護(hù)劑領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

沙門柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)：美國(guó)Mad Millie公司；

短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve1.2213)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis1.1853)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum1.1852)：哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司；

液氮：安慶市華興化工氣體有限公司；

牛肉浸膏、酵母膏、大豆蛋白、蛋白胨：生化試劑；

葡萄糖、95%乙醇、濃硫酸和苯酚等其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

分析天平：ATX224型，島津儀器(蘇州)有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：752型，上海光學(xué)儀器有限公司；

CO2培養(yǎng)箱：311型，美國(guó)Thermo公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，常州國(guó)勝電器有限公司；

超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2FD型，上海博訊儀器公司；

冷凍干燥機(jī)：FD-1B-50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：ST40R型，美國(guó)Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沙門柏干酪青霉菌絲的制備 在液體PDA培養(yǎng)基中接種3～5塊沙門柏干酪青霉菌碟，于28 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)72 h。過濾得菌絲球，去除瓊脂塊，以蒸餾水洗滌3～5遍后，在50 ℃下干燥至恒重得菌絲體備用。

1.2.2 胞內(nèi)多糖提取工藝 取菌絲(m)置于研缽中，倒入適量液氮研碎。按水料比例30∶1(mL/g)添加70 ℃的熱水并將菌絲全部轉(zhuǎn)到燒杯中，將燒杯置于70 ℃水浴鍋中保溫90 min。冷卻至室溫，過濾得濾液(V0)，然后加入3倍體積的乙醇(95%)于6 ℃冷藏12 h。在6 ℃，10 000 r/min條件離心10 min，收集多糖沉淀，用適量蒸餾水(V)復(fù)溶[9]。

1.2.3 多糖含量測(cè)定及得率計(jì)算 采用苯酚—硫酸法[10]制作多糖測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。取濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL分別加入25 mL比色管中，補(bǔ)蒸餾水至1 mL，以1 mL蒸餾水作空白對(duì)照。分別依次加入6%苯酚1 mL，濃硫酸5 mL，室溫靜置30 min。于490 nm下，測(cè)定吸光度值(A)，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。以葡萄糖濃度為X軸，A值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=1.023 1C-0.007 2，R2=0.999 2。將多糖稀釋適當(dāng)倍數(shù)(n)，取1 mL樣品參考標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測(cè)得吸光度值，代入方程(1)得多糖濃度。

(1)

式中：

P——多糖得率，%；

n——多糖稀釋倍數(shù)；

C——多糖濃度，mg/mL；

V——多糖溶液體積，mL；

m——菌絲質(zhì)量，g；

1 000——質(zhì)量單位換算系數(shù)。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

(1) 水料比的選擇：固定提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間為90 min，稱取菌絲置于研缽中，倒入液氮，研碎。分別以10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1(mL/g)的水料比，參考“1.2.2胞內(nèi)多糖提取工藝”步驟提取胞內(nèi)多糖。按照“1.2.3多糖含量測(cè)定及得率計(jì)算”方法獲得不同水料比條件下的多糖得率。

(2) 提取溫度的選擇：固定提取時(shí)間為90 min，水料比為40∶1(mL/g)，稱取菌絲置于研缽中，倒入液氮研碎。分別以60，70，80，90，100 ℃的水，參考“1.2.2胞內(nèi)多糖提取工藝”步驟提取胞內(nèi)多糖。按照“1.2.3多糖含量測(cè)定及得率計(jì)算”方法獲得不同提取溫度下的多糖得率。

(3) 提取時(shí)間的選擇：固定水料比為40∶1(mL/g)，提取溫度為90 ℃，稱取菌絲置于研缽中，倒入液氮，研碎。分別提取30，60，90，120，150 min，參考“1.2.2胞內(nèi)多糖提取工藝”步驟提取胞內(nèi)多糖。按照“1.2.3多糖含量測(cè)定及得率計(jì)算”方法獲得不同提取時(shí)間條件下的多糖得率。

1.2.5 Box-Behnken試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上利用Design expert 10設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)，并在最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 雙歧桿菌冷凍試驗(yàn) 按2 g/L的接種量將短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌冷凍菌粉分別接于50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。將雙歧桿菌培養(yǎng)物移至50 mL滅菌離心管中，于10 000 r/min 6 ℃下離心10 min，用適量無(wú)菌水洗滌3次，分別用5 mL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甘油和多糖溶液復(fù)溶雙歧桿菌菌體，置于-80 ℃下預(yù)凍3 h，然后置于真空冷凍干燥機(jī)中在-50 ℃，-20 Pa下干燥12 h，得雙歧桿菌菌粉備用。

1.2.7 雙歧桿菌計(jì)數(shù)及活菌存活率計(jì)算 雙歧桿菌活菌計(jì)數(shù)參考Ye等[11]報(bào)道的方法進(jìn)行，取冷凍前后的雙歧桿菌進(jìn)行10倍稀釋，分別接種于含0.05% LiCl的固體MRS培養(yǎng)基上，置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h計(jì)數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)設(shè)3個(gè)平行。雙歧桿菌存活率按式(2)計(jì)算：

(2)

式中：

S——雙歧桿菌存活率，%；

N1——冷凍前液體菌懸液中雙歧桿菌活菌數(shù)；

N2——冷凍后菌粉中雙歧桿菌活菌數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 水料比對(duì)多糖得率的影響

由圖1可知，水料比在10∶1～40∶1(mL/g)時(shí)，多糖得率與水料比成正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)水料比大于40∶1(mL/g)時(shí)多糖得率呈下降趨勢(shì)。即適宜的水料比在30∶1～40∶1 (mL/g)范圍內(nèi)，此時(shí)多糖得率在8.0%～8.1%。

2.2 提取溫度對(duì)多糖得率的影響

由圖2可知，當(dāng)提取溫度在60～90 ℃時(shí)，多糖得率隨提取溫度升高而增加，并在90 ℃達(dá)到最大值10.23%。當(dāng)提取溫度大于90 ℃時(shí)，多糖得率與溫度的增加呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，類似的現(xiàn)象在Zhu[12]和Ma[13]等的報(bào)道中也被觀察到。

圖1 水料比對(duì)多糖得率的影響

圖2 提取溫度對(duì)多糖得率的影響

2.3 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

提取時(shí)間是影響多糖提取得率的重要因素，因?yàn)樘崛∫簼B透到干物料中以及多糖被浸提出來(lái)并擴(kuò)散到提取液中均需充足的時(shí)間[12]。由圖3可知，在30～120 min時(shí)，多糖得率與提取時(shí)間的增加呈正相關(guān)性，而后隨著提取時(shí)間的增加多糖得率基本保持穩(wěn)定。即適宜的提取時(shí)間為120 min，此時(shí)多糖得率為10.2%。此外，水料比、提取溫度和提取時(shí)間之間往往存在交互作用[14-15]，且為獲得多糖的最佳提取參數(shù)，在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上用Box-Behnken試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化提取條件。

2.4 Box-Behnken試驗(yàn)

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

表1 因素水平表

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

表3 二次多項(xiàng)式模型回歸系數(shù)估計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果方差分析?

Table 3 Estimated regression coefcients for the quadratic polynomial model and the analysis of variance for the experimental results

模型參數(shù)系數(shù)估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)誤差平方和F值P值模型--32.6658.46<0.0001常數(shù)項(xiàng)12.060.11---A0.670.0883.6558.720.0001B0.210.0880.365.820.0466C0.610.0883.0048.350.0002AB-0.0750.120.0230.360.5661AC-0.730.122.1033.870.0007BC-0.450.120.8113.050.0086A2-1.960.1216.09259.30<0.0001B2-0.680.121.9531.370.0008C2-0.830.122.9046.730.0002失擬項(xiàng)--0.0820.310.8167誤差--0.35

?R2=0.987，AdjR2=0.97，PredR2=0.944，CV=2.39%。

選擇水料比、提取溫度和提取時(shí)間為變量，并確定它們的水平(見表1)。按表2所列組合進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。利用Design expert 10.0進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。水料比、提取溫度和提取時(shí)間均對(duì)多糖得率有顯著影響，且影響程度從大到小依次為水料比>提取溫度>提取時(shí)間。另外，水料比與提取溫度的交互項(xiàng)、提取溫度與提取時(shí)間的交互項(xiàng)以及三因素的平方項(xiàng)也對(duì)多糖得率有顯著影響?；貧w方程為：

Y=12.06+0.67A+0.21B+0.61C-0.075AB-0.73AC-0.45BC-1.96A2-0.68B2-0.83C2。

(3)

模型的方差分析結(jié)果見表3，方程(3)的Pmodel<0.000 1、Plose=0.816 7>0.05、R2=0.987、AdjR2=0.970、PredR2=0.944，CV(變異系數(shù))=2.39%<5%。這些表明方程(3)顯著、無(wú)失擬因素存在，能較好地反應(yīng)所達(dá)三因素與多糖得率之間的真實(shí)關(guān)系[13]，而且具有良好的重現(xiàn)性[14]。由方程(3)任選A、B和C中的2因素為變量另一因素固定為“0水平”點(diǎn)，作圖。多糖得率隨水料比、提取溫度和提取時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，且方程(3)存在最大值點(diǎn)(圖4～6)。由方程(3)得多糖得率預(yù)測(cè)最大值為12.2%，此時(shí)水料比、提取溫度和提取時(shí)間分別為36.72∶1(mL/g)、89.59 ℃和122.88 min。為方便驗(yàn)證試驗(yàn)的進(jìn)行，選擇在水料比為36.7∶1(mL/g)，提取溫度為89.6 ℃和提取時(shí)間為123 min條件下，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得多糖得率為12.1%，預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)結(jié)果基本一致，進(jìn)一步確認(rèn)了模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，即在最優(yōu)條件下可以得到較高的提取率。

圖4 水料比和提取時(shí)間交互作用響應(yīng)面和等高線圖

圖5 水料比和提取溫度交互作用響應(yīng)面和等高線圖

圖6 提取時(shí)間和提取溫度交互作用響應(yīng)面和等高線圖

2.5 多糖對(duì)冷凍干燥雙歧桿菌的保護(hù)作用

冷凍干燥是益生菌菌粉生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟，然而冷凍和干燥過程均會(huì)對(duì)益生菌造成損傷，致使益生菌存活率明顯下降[15-16]。為保證益生菌的活力在冷凍干燥過程中使用保護(hù)劑提高益生菌的存活率。保護(hù)劑按照化學(xué)結(jié)構(gòu)分為11類，常用的保護(hù)劑為糖類和醇類，如羥乙基淀粉和甘油[15]。多糖也可作為冷凍保護(hù)劑減少冷凍干燥對(duì)細(xì)胞的損傷[15]，沙門柏干酪青霉胞內(nèi)多糖對(duì)冷凍干燥雙歧桿菌存活率的影響見表4。未添加保護(hù)劑的雙歧桿菌存活率在3.28%～3.60%時(shí)，結(jié)果顯示冷凍干燥對(duì)雙歧桿菌造成了較大的損傷。以甘油作為保護(hù)劑可顯著提高雙歧桿菌的存活率，這與李德斌等[16]的報(bào)道一致。與空白相比，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～2%的多糖可顯著提高短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌的存活率，最高存活率分別達(dá)31.27%，30.40%，30.66%。另外，添加相同濃度的甘油和多糖的雙歧桿菌存活率基本一致，表明等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甘油和多糖對(duì)3種雙歧桿菌的保護(hù)作用相當(dāng)。即沙門柏干酪青霉胞內(nèi)多糖可作為雙歧桿菌冷凍干燥保護(hù)劑的潛在選項(xiàng)。

表4 多糖對(duì)冷凍干燥過程中雙歧桿菌存活率的影響?

? *表示處理組與空白組相比雙歧桿菌存活率在P<0.01下存在顯著差異。

3 結(jié)論

利用單因素和Box-Behnken試驗(yàn)對(duì)沙門柏干酪青霉胞內(nèi)多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得最適水料比、提取溫度和時(shí)間分別為36.7∶1(mL/g)、89.6 ℃和123 min，在此條件下多糖得率為12.1%。該胞內(nèi)多糖可降低冷凍干燥處理對(duì)雙歧桿菌造成的損傷，顯著提高雙歧桿菌的存活率，其效果與等濃度的甘油相當(dāng)。然而，起抗凍傷作用的胞內(nèi)多糖具體組分及其抗凍傷機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

[1] 盧曉明, 左芳雷, 王潔婷, 等. Camembert干酪青霉Penicilliumcamemberti的分離鑒定[J]. 食品研究與開發(fā), 2011, 32(2): 143-147.

[2] MACEJ O, JOVANOVIC S, DENIN J. Characteristics of camembert-type cheese ripening produced from milk in which complex between casein and whey protein is formed[J]. Journal of Agricultural Sciences, 2001, 46(1): 57-69.

[3] GALLI B D, MARTIN J G P, DA SILVA P P M, et al. Sensory quality of Camembert-type cheese: Relationship between starter cultures and ripening molds[J]. International Journal of Food Microbiology, 2016, 234: 71-75.

[4] DIAS G, MIRANDA TAVARES G, FERNANDES DE CARVALHO A, et al. Effect of the addition of a supplementary culture on the physical-chemical and sensory characteristics of Camembert-type cheese[J]. Revista do Instituto Adolfo Lutz (Impresso), 2012, 71(3): 500-506.

[5] PANGALLO D,AKOVN, KORENOVJ, et al. Microbial diversity and dynamics during the production of May bryndza cheese[J]. International journal of food microbiology, 2014, 170: 38-43.

[6] LESSARD M H, VIEL C, BOYLE B, et al. Metatranscriptome analysis of fungal strains Penicillium camemberti and Geotrichum candidum reveal cheese matrix breakdown and potential development of sensory properties of ripened Camembert-type cheese[J]. BMC Genomics, 2014, 15(235): 2-13.

[7] 孫楊, 姜平, 孫東陽(yáng), 等. 右旋磷霉素手性轉(zhuǎn)化菌株的篩選與鑒定[J]. 中國(guó)抗生素雜志, 2011, 36(6): 421-425.

[8] BIZET C, DESOBRY S, FANNI J, et al. Composition and physical properties of thePenicilliumcamembertimycelium[J]. Le Lait, 1997, 77(4): 461-466.

[9] 李敏杰, 熊亞, 韓何波. 白靈菇多糖提取工藝優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械, 2014, 30(5): 225-228.

[11] YE Ming, LIU Dong, ZHANG Rong, et al. Effect of hawk tea (LitseacoreanaL.) on the numbers of lactic acid bacteria and flavour compounds of yoghurt[J]. International Dairy Journal, 2012, 23(1): 68-71.

[12] ZHU Cai-ping, LIU Xiao-lin. Optimization of extraction process of crude polysaccharides from Pomegranate peel by response surface methodology[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 92(2): 1 197-1 202.

[13] MA Ting-ting, SUN Xiang-yu, TIAN Cheng-rui, et al. Polysaccharide extraction fromSphallerocarpusgracilisroots by response surface methodology[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 88: 162-170.

[14] LIU Yong, GONG Gui-li, ZHANG Jiao, et al. Response surface optimization of ultrasound-assisted enzymatic extraction polysaccharides fromLyciumbarbarum[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 110(38): 278-284.

[15] 任艷, 陳明, 邵玉宇, 等. 真空冷凍干燥過程中保護(hù)劑對(duì)乳酸菌的保護(hù)機(jī)理[J]. 中國(guó)乳品工業(yè), 2013, 41(9): 41-45.

[16] 李德斌, 趙敏. 雙歧桿菌凍干菌粉制備過程中保護(hù)劑的研究[J]. 中國(guó)乳品工業(yè), 2011, 39(11): 32-34.

Optimization for the extraction of polysaccharides fromPenicilliumcamembertiand its antifreeze activity

LIU Dong1YEHong-ling1LIPing1TANWei2

(1.AnqingVocationalTechnicalCollege,Anqing,Anhui, 246003,China;2.AnhuiProvincialFoodandDrugInspectionandResearchInstitute,Hefei,Anhui, 230051,China)

In this paper, the single-factor and Box-Behnken experiments were employed to optimize the extraction parameters of intracellular polysaccharide (IPS) fromPenicilliumcamemberti, i.e. liquid-solid ratio, extraction time and temperature, and the antifreeze activity of IPS was also evaluated. The results showed that the IPS could be best extracted with liquid-solid ratio 36.7∶1 (mL/g) at 89.6 ℃ for 123 min, and the yield of it was about 12%. In addition, the antifreeze activity of IPS was almost equal to glycerol, and the livabilities ofBifidobacteriumbreve,Bifidobacteriuminfantis,Bifidobacteriumbifidumwere significantly improved by 1%～2% IPS.

Penicilliumcamemberti; polysaccharide; extraction condition; cryoprotectants

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.039

安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：KJ2014A148)；安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：KJ2015A368)；安徽省教育振興計(jì)劃重大教學(xué)改革研究項(xiàng)目(編號(hào)：2015zdjy181)；安徽省教質(zhì)量工程項(xiàng)目(編號(hào)：2015jtxx157)；教育部高職教育創(chuàng)新發(fā)展行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：XM-16)

劉冬(1982—)，男，安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，博士。 E-mail:liudong1595693@163.com

2016—10—08