龐向東 江 虹 張 琴 蔣天艷

(1. 長江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，重慶 408100； 2. 重慶市無機(jī)特種功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 408100)

三波長分光光度法快速測定青蘋果中的蘋果酸

龐向東1,2江 虹1,2張 琴1,2蔣天艷1,2

(1. 長江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，重慶 408100； 2. 重慶市無機(jī)特種功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 408100)

為建立快速測定青蘋果中蘋果酸的三波長分光光度法，利用孔雀石綠能在弱酸性的Tris—鹽酸緩沖溶液中與蘋果酸反應(yīng)，在可見光區(qū)生成具有3個(gè)明顯正吸收峰(分別位于 568，644，424 nm 波長處)的綠色離子締合物，對用三波長法測定蘋果酸進(jìn)行了研究，并考察了適宜的反應(yīng)條件及吸收光譜特征。結(jié)果表明，用三波長疊加法測定，表觀摩爾吸光系數(shù)(κ)為5.88×104L/(mol·cm)，蘋果酸的質(zhì)量濃度在0.008～1.900 mg/L 時(shí)服從朗伯—比爾定律，定量限為 0.003 2 g/100 g，樣品加標(biāo)回收率為98.23%～102.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～2.4%。該法可用于青蘋果中蘋果酸的測定。

青蘋果；蘋果酸；孔雀石綠；三波長；分光光度法

蘋果酸在改善記憶功能、預(yù)防老年性癡呆、增強(qiáng)鈣的活性及降低抗癌藥物毒副作用等方面具有一定價(jià)值[1]。目前，蘋果酸含量的測定方法主要有：高效液相色譜法[2-4]、氣相色譜法[5]、液質(zhì)聯(lián)用法[6-7]和電化學(xué)法[8-9]等。高效液相色譜法儀器價(jià)格昂貴，且前處理繁瑣、費(fèi)時(shí)；氣相色譜法的前處理也較繁瑣；電化學(xué)法的重現(xiàn)性較差。由于紫外—可見分光光度法儀器價(jià)廉，操作簡便，且未見利用三波長可見分光光度法進(jìn)行蘋果酸測定的報(bào)道。因此，本研究擬以三苯甲烷類染料孔雀石綠為探針，在弱酸性溶液中，采用三波長可見分光光度法測定蘋果酸的含量，旨在建立一種青蘋果中蘋果酸的快速測定方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

紫外—可見—近紅外分光光度計(jì)：U-4100型，日本日立公司；

精密酸度計(jì)：pHS-3C型，上海虹益儀器儀表有限公司；

電子天平：EL104型，上海梅特勒—托利多儀器有限公司；

青蘋果：1#～4#，購自重慶4個(gè)農(nóng)貿(mào)市場；

三羥甲基氨基甲烷：分析純，齊一生物科技(上海)有限公司；

鹽酸：分析純，重慶華東化工有限公司；

孔雀石綠：生物染色劑，上海試劑三廠；

蘋果酸：分析純，重慶藥品食品檢定所；

試驗(yàn)用水：二次蒸鎦水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

(1) 孔雀石綠(malachite green，MAG)溶液：1.0×10-3mol/L。稱取適量孔雀石綠于小燒杯中，用水溶解后，轉(zhuǎn)移至500 mL 容量瓶中，用水定容。

(2) 蘋果酸(malic acid，MAL)標(biāo)準(zhǔn)溶液：134.1 mg/L 貯備液。稱取適量蘋果酸于小燒杯中，用水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，用水稀至刻度，冰箱4 ℃ 保存。使用時(shí)用水稀釋10倍。

(3) Tris(三羥甲基氨基甲烷)—鹽酸緩沖溶液：用0.20 mol/L Tris溶液與0.10 mol/L鹽酸混合，用酸度計(jì)測定，配成 pH 3.0～9.6的系列緩沖溶液。

1.2.2 樣品的處理 取青蘋果1#～4# 各多個(gè)，削皮，去核，榨汁。準(zhǔn)確稱取攪拌均勻的 1# 果汁5.062 3 g，2# 果汁 5.023 6 g，3# 果汁 5.017 4 g 和4# 果汁 5.025 5 g，過濾，濾液分別置于1 000 mL容量瓶中，用水定容，搖勻，即得待測液。

1.2.3 測定波長及pH 值的選擇 取11 支10 mL 具塞比色管，分別準(zhǔn)確加入13.41 mg/L 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL和1.0×10-3mol/L 孔雀石綠溶液2.0 mL，再分別加入pH 值為3.09，3.56，4.07，4.35，5.03，5.49，5.86，6.15，6.45，6.85，7.58 的Tris—鹽酸緩沖溶液1.0 mL，用水稀至10 mL 刻度，搖勻，用1 cm 比色皿，以試劑空白作參比，掃描吸收光譜。根據(jù)光譜圖，確定測定波長。再根據(jù)吸收峰處的吸光度A，作吸光度—pH 曲線圖，確定緩沖溶液的最佳pH 值。

1.2.4 緩沖溶液用量的選擇 在標(biāo)準(zhǔn)溶液和顯色劑溶液濃度不變的情況下，分別加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL 1.2.3 節(jié)選定的pH 值，并按1.2.3 節(jié)的方法掃描吸收光譜，作吸光度—緩沖液用量的曲線圖，確定最佳緩沖液的用量。

1.2.5 顯色劑溶液濃度的選擇 在其它條件不變的情況下，改變1.0×10-3mol/L 孔雀石綠溶液的用量，再按1.2.3 節(jié)方法掃描吸收光譜，作吸光度—顯色劑溶液濃度曲線圖，確定最佳顯色劑溶液的濃度。

1.2.6 加入順序的選擇 在上述選定的條件下，改變各試劑的加入順序，按1.2.3 節(jié)方法掃描吸收光譜，根據(jù)光譜曲線圖，確定最佳加入順序。

1.2.7 測定時(shí)間的選擇 在上述選定的條件下，掃描不同時(shí)間(t)下的吸收光譜，作吸光度—反應(yīng)時(shí)間曲線圖，確定最佳測定時(shí)間。

1.2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 在選定的顯色劑濃度、pH 值、用量及順序的條件下，分別加入13.41 mg/L蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2，0.6，1.0，1.4 mL，再用水稀至刻度，搖勻，在選定的時(shí)間下，用1 cm比色皿，以試劑空白作參比，按選定條件掃描吸收光譜，根據(jù)測定波長下的吸光度及蘋果酸的質(zhì)量濃度，繪制吸光度—蘋果酸質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.9 共存物質(zhì)的影響 在選定的條件下，加入1.0 mL 13.41 mg/L 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3 節(jié)方法配制溶液并掃描吸收光譜；另取若干支10 mL 具塞比色管，在前述溶液的基礎(chǔ)上，分別加入需考察的共存物質(zhì)，再按選定條件掃描吸收光譜，并與未加共存物質(zhì)的譜線比較，判斷共存物質(zhì)是否干擾蘋果酸的測定。

1.2.10 樣品中蘋果酸的測定 取1.2.2 節(jié)中的待測樣液適量，按選定的條件加入顯色劑及緩沖溶液，用水稀至10 mL 刻度，搖勻，按選定條件掃描吸收光譜，根據(jù)樣品的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程，求得樣液中蘋果酸的含量，再求出原始樣液中蘋果酸的含量。各平行測定6份，同時(shí)做加標(biāo)回收試驗(yàn)(n=6)。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)體系的吸收光譜特征

圖1為MAG—MAL 體系的吸收光譜圖。由圖1可知，蘋果酸在可見光區(qū)幾乎無吸收；孔雀石綠在可見光區(qū)有較強(qiáng)吸收，最大吸收波長為616 nm；在孔雀石綠的弱酸性溶液中加入蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液后，因孔雀石綠為堿性染料，可與蘋果酸以靜電引力作用生成二元離子締合物，使可見光區(qū)內(nèi)的光譜曲線上出現(xiàn)3個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，最大吸收峰位于568 nm，次大吸收峰位于644 nm，相對最小的吸收峰位于424 nm。在此3個(gè)波長處，一定濃度范圍的蘋果酸的質(zhì)量濃度與二元締合物的吸光度呈良好的線性關(guān)系。根據(jù)吸光度的加和性，用三波長疊加法測定時(shí)，一定濃度范圍的蘋果酸的質(zhì)量濃度與體系的吸光度仍呈線性關(guān)系，并服從朗伯—比爾定律，且方法的靈敏度5.88×104L/(mol·cm)，是單波長法測定的2.5～4.0 倍。故選擇用三波長法定量檢測蘋果酸的含量。

圖1 吸收光譜

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 pH 值 由圖2可知：在pH 5.5～6.8時(shí)，締合物在644，568，424 nm 波長處的吸光度均較大，且基本處于一個(gè)平臺上，這表明反應(yīng)的適宜pH 范圍為5.5～6.8，在此范圍外，締合物的吸光度均有不同程度降低。當(dāng)采用三波長法測定時(shí)，因三波長處的吸光度疊加值比單波長大，靈敏度更高。因此選擇用pH 6.15 的Tris—鹽酸緩沖溶液。繼而固定其它條件不變，改變pH 6.15 的用量，結(jié)果表明：適宜用量為1.5 mL。

圖2 pH值對吸光度的影響

2.2.2 顯色劑溶液的濃度 由圖3可知：當(dāng)孔雀石綠溶液濃度為2.5×104mol/L 時(shí)，締合物在644，568，424 nm 波長處的吸光度值均較大，當(dāng)用三波長法測定時(shí)，其三波長疊加吸光度比單波長更大，靈敏度更高。故試驗(yàn)用2.5 mL 1.0×103mol/L 孔雀石綠溶液。

圖3 孔雀石綠溶液的濃度對吸光度的影響

2.2.3 試劑加入順序 由表1可知，在選定條件下，當(dāng)加入順序?yàn)門ris—鹽酸緩沖溶液、孔雀石綠溶液、蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，締合物在644，568，424 nm波長處的吸光度值相對最大，當(dāng)用三波長法測定時(shí)，其三波長疊加吸光度更大，靈敏度更高。故試驗(yàn)按此最佳順序進(jìn)行。

表1 試劑加入順序?qū)ξ舛鹊挠绊?/p>

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間及締合物的穩(wěn)定性 由圖4可知，開始時(shí)，締合物的吸光度隨時(shí)間的增加而逐漸增大，至20 min后，吸光度值基本不變。這說明蘋果酸與孔雀石綠的顯色反應(yīng)在20 min 內(nèi)即可完成，生成的締合物穩(wěn)定時(shí)間至少1 h。故試驗(yàn)選在 20 min后測定。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對吸光度的影響

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

于10 mL 具塞比色管中，準(zhǔn)確加入pH 6.15 Tris—鹽酸緩沖溶液1.5 mL和1.0×10-3mol/L 孔雀石綠溶液2.5 mL，再加入適量的 13.41 mg/L 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀至刻度，搖勻，20 min后，用1 cm 比色皿，以試劑空白作參比，采用三波長(644，568，424 nm)疊加法測定溶液的吸光度A。作吸光度—蘋果酸質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。由圖5可知，蘋果酸的質(zhì)量濃度在0.008～1.900 mg/L時(shí)量與締合物的吸光度呈線性關(guān)系，服從朗伯—比爾定律。該方法的一元線性回歸方程為A=-0.001 03+0.439 1ρ，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，根據(jù)朗伯—比爾定律可求得表觀摩爾吸光系數(shù)為5.88×104L/(mol·cm)，再根據(jù)式(1)求出方法的定量限為 0.003 2 g/100 g。

(1)

式中：

Q——定量限，μg/g；

sb——多次測定的空白信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

S——分析方法的靈敏度，μg-1；

m——樣品的質(zhì)量，g。

圖5 蘋果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 共存物質(zhì)的影響

2.5 分析應(yīng)用

取1.2.2 節(jié)中的待測樣液各 0.5 mL，按最佳試驗(yàn)條件配制溶液，并掃描吸收光譜。根據(jù)三波長法的標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程求得樣液及原始樣液中蘋果酸的含量，同時(shí)做加標(biāo)回收試驗(yàn)。測定結(jié)果與HPLC法(GB/T 5009.157—2003)對照，結(jié)果見表2。

表2 樣品分析結(jié)果及回收試驗(yàn)

由表2可知，回收率為98.23%～102.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～2.4%，表明本方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，測定結(jié)果與國標(biāo)法基本一致。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了測定青蘋果中蘋果酸的三波長吸收光譜法。該法具有簡便、快速的特點(diǎn)，并有較高的準(zhǔn)確度和精密度，可用于系列蘋果中蘋果酸的測定。但也存在靈敏度不很高的問題，有待對三元體系進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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Fast ddetermination of malic acid in greenapple by three-wavelength spectrophotometry

PANG Xiang-dong1,2JIANGHong1,2ZHANGQin1,2JIANGTian-yan1,2

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,YangtzeNormalUniversity,Chongqing408100,China; 2.ChongqingKeyLaboratoryofInorganicSpecialFunctionalMaterials,Chongqing408100,China)

A triple wavelength spectrophotometry to measure malice acid in green apples was established in this study. The reaction between malic acid and tris-hydrochloric acid buffer solution of malachite green showed that a green ionic association complex with three positive absorption peak locating in 568 nm, 644 nm and 424 nm, respectively, could be found in visible light generated area. Moreover, the malic acid with triple wavelength spectrophotometry and its related reaction condition and absorption spectral character were investigated. The result showed that the molar absorption coefficient of performance was 5.88×104L/(mol·cm), and the quality concentration of malic acid was found to be 0.008～1.900 mg/L, conforming to Lambert-Beer's Law. It was also found that the limit of quantitation was 0.003 2 g/100 g, and the adding standard recovery rate was 98.23% to 102.9%, with a relative standard deviation at 1.8%～2.4%. This method could be used for the determination of malic acid in green apple.

green apple; malic acid; malachite green; three-wavelength; spectrophotometry

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.017

重慶市教委科技基金資助項(xiàng)目(編號：KJ1401226); 長江師范學(xué)院科技基金資助項(xiàng)目(編號：2015CXX080)

龐向東，男，長江師范學(xué)院副教授。

江虹(1956—)，女，長江師范學(xué)院教授。 E-mail: jianghongch@163.com

2016-09-06