WEI Xiao-qun -,3 ,3 -,3

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東 廣州 510642；2. 廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 廣州 510623；3. 廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510623)

葡萄酒中乙醛氣相—質(zhì)譜測定方法的建立

WEI Xiao-qun1,2,3ZHENGXuan2GUOQing-yuan2,3LINGLi2,3ZENGGuang-feng2,3HUANGJin2CAIChun2

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東 廣州 510642；2. 廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 廣州 510623；3. 廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510623)

建立氣相色譜—質(zhì)譜測定葡萄酒中乙醛含量的方法，并考察提取溶劑、解析pH、衍生化實(shí)際用量等因素對定量結(jié)果的影響。結(jié)果表明：該方法檢測限為0.12 mg/kg，線性范圍為0.2～100.0 mg/kg(R2=0.999 4)，樣品三水平加標(biāo)回收率為89.3%～113.0%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.28%～9.42%(n=6)，適用于葡萄酒中乙醛總量的測定。

乙醛；葡萄酒；氣相色譜—質(zhì)譜

葡萄酒中醛類物質(zhì)是重要的風(fēng)味物質(zhì)，其中乙醛占據(jù)了90%[1]。葡萄酒中低含量的乙醛具有一種愉快的水果香氣，但濃度較高時，會產(chǎn)生一種青草或類似青蘋果的異味[2]。乙醛對微生物的生長既有促進(jìn)作用也會產(chǎn)生抑制作用，主要取決于其濃度的大小，可見乙醛對于葡萄酒具有重要意義。但同時醛類化合物對人體健康有潛在的危害，甲醛、乙醛已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARCL995)確定為可能會引起致癌的 2B(Group 2B)類物質(zhì)[3]，但美國食品和藥物管理局(FDA)將乙醛歸為“一般認(rèn)為安全(generally regard as safe)類物質(zhì)，且目前歐盟也將乙醛列為合法的食品風(fēng)味添加劑。國內(nèi)外目前尚無葡萄酒中乙醛的限量標(biāo)準(zhǔn)。

在葡萄酒中，乙醛以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)形式存在，目前中國關(guān)于葡萄酒中乙醛測定方法有多種。化學(xué)法即碘量滴定法用于測定總?cè)?，?shí)測總量高于乙醛含量；酶法(乙醛脫氫酶法)測定受某些金屬離子影響；氣質(zhì)聯(lián)用法和頂空氣相色譜法主要用于黃酒或葡萄酒中游離態(tài)乙醛含量的檢測[4-5]；高效液相色譜法主要用于乙醛總量的測定，但該法容易受基質(zhì)干擾[6-9]。應(yīng)用衍生化法可以有效提取游離態(tài)和結(jié)合態(tài)乙醛，而且氣相色譜質(zhì)譜法能夠排除基質(zhì)干擾，因而本研究擬采用衍生化—?dú)庀嗌V—質(zhì)譜法對葡萄酒中乙醛的含量進(jìn)行測定，以期更好解決乙醛總量測定和基質(zhì)干擾的問題，建立適用于釀酒行業(yè)中乙醛含量的檢測和鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(帶EI源)：Agilent7890A-5975C型，美國Agilent科技公司；

渦旋混合器：MS3 basic型，德國IKA集團(tuán)。

1.1.2 試驗(yàn)材料

5 g/L的2,4-二硝基苯肼溶液(C6H6N4O4，簡稱DNPH，CAS：119-26-6)：準(zhǔn)確稱取0.5 g(精確到0.001 g)2,4-二硝基苯肼(色譜純)，加入30 mL鹽酸(優(yōu)級純)和30 mL乙腈(色譜純)溶解，然后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度線，此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用；

12%的乙醇溶液：量取12 mL無水乙醇(色譜純)于100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度線；

4 mol/L的氫氧化鈉溶液：準(zhǔn)確稱取8 g氫氧化鈉(精確到0.001 g，分析純)于燒杯中，加入40 mL水溶解，轉(zhuǎn)移到50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度線；

25%的硫酸溶液：準(zhǔn)確量取12.5 mL濃硫酸(優(yōu)級純)于已有35 mL水的燒杯中，冷卻后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度線。

乙醛標(biāo)準(zhǔn)儲備液：1 000 mg/L乙醛(溶劑為甲醇)，該溶液應(yīng)在-18 ℃冰箱中保存。

樣品：市售紅葡萄酒、白葡萄酒、起泡葡萄酒。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品測定 用移液管準(zhǔn)確量取0.50 mL葡萄酒樣品，于15 mL離心管中(起泡酒需預(yù)先脫氣)，加入0.20 mL 4 mol/L 的氫氧化鈉溶液，室溫下靜置20 min。然后加入0.2 mL 25%的硫酸溶液和0.5 mL 5 g/L的2,4-二硝基苯肼溶液，室溫避光衍生6 h。衍生結(jié)束后，加入5 mL環(huán)己烷，渦旋提取2 min，4 500 r/min離心5 min。下層溶液用5 mL環(huán)己烷重復(fù)提取1次。合并2次提取液用環(huán)己烷定容至10 mL，過0.22 μm濾膜于進(jìn)樣瓶中，供上機(jī)分析。

脫氣：將樣品酒樣約300 mL倒入1 000 mL錐形瓶中，蓋塞(橡皮塞)，在室溫條件下，輕輕搖動、開塞放氣(開始有“砰砰”聲)，蓋塞。反復(fù)操作，直至無氣體逸出為止。

1.2.2 乙醛2,4-二硝基苯腙標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備 分別量取0.50 mL標(biāo)準(zhǔn)工作液于15 mL離心管中，然后加入0.5 mL 5 g/L的2,4-二硝基苯肼溶液，室溫避光衍生6 h。衍生結(jié)束后，加入5 mL環(huán)己烷，渦旋提取2 min，4 500 r/min離心5 min。下層溶液用5 mL環(huán)己烷重復(fù)提取1次。合并2次提取液用環(huán)己烷定容至10 mL，過0.22 μm濾膜于進(jìn)樣瓶中，供上機(jī)分析。

1.3 儀器條件

1.3.1 氣相色譜條件 色譜柱：DB-5ms毛細(xì)管柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)或性能類似的分析柱。程序升溫：初始溫度130 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至280 ℃，保持3 min。進(jìn)樣口溫度：280 ℃。接口溫度：280 ℃。載氣：He(純度>99.999%)，1.2 mL/min，恒流。進(jìn)樣量：1 μL。進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源溫度：230 ℃。四極桿溫度：150 ℃。電離方式：EI。溶劑延遲：8 min。質(zhì)譜掃描方式：選擇離子采集模式(SIM)。選擇監(jiān)測離子(SIM)：定量離子m/z224，定性離子m/z79，122，152。保留時間，第一個乙醛衍生物的保留時間為(11.386±0.200) min，第二個乙醛衍生物的保留時間為(11.626±0.200) min。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生產(chǎn)物

乙醛和2,4-二硝基苯肼反應(yīng)，生成乙醛-2,4-二硝基苯腙。由于反應(yīng)產(chǎn)物具有異構(gòu)體，在毛細(xì)管氣相色譜柱中的色譜行為呈現(xiàn)雙峰(見圖1)，離子碎片完全相同。異構(gòu)體在標(biāo)準(zhǔn)品以及紅葡萄酒、白葡萄酒、起泡酒中的峰面積比例見表1。由表1可知，在不同食品基質(zhì)中這兩種異構(gòu)體的比例是不變的，因而可采取單峰定量法，也可采用雙峰定量法。反應(yīng)產(chǎn)物存在順反異構(gòu)[10]。

圖1 乙醛和2,4-二硝基苯肼反應(yīng)產(chǎn)物色譜質(zhì)譜圖

Figure 1 Acetaldehyde and 2,4-dinitrophenylhydrazine reaction chromatography mass spectra

表1 兩種異構(gòu)體在標(biāo)液以及紅葡萄酒、白葡萄酒、起泡酒中的峰面積比例

Table 1 The peak area ratio of the two isomers in the standard solution,red wine, white wine and sparkling wine %

樣品峰1面積峰2面積標(biāo)液 39.0460.96紅葡萄酒39.4560.55白葡萄酒39.1660.84起泡酒 39.2360.77

2.2 影響因素

2.2.1 提取溶劑的影響 試驗(yàn)比較了環(huán)己烷、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、異辛烷、乙醚對衍生物乙醛-2，4-二硝基苯棕的萃取效果，結(jié)果(見圖2)表明使用環(huán)己烷作為萃取劑效果最好。故該方法確定提取溶劑為環(huán)己烷。

2.2.2 前處理pH的影響 在pH低于3.5時乙醛與葡萄酒中的SO2容易結(jié)合生成結(jié)合態(tài)的乙醛—二氧化硫加合物，該物質(zhì)在堿性環(huán)境時轉(zhuǎn)化為游離態(tài)的乙醛和SO2。試驗(yàn)考察了強(qiáng)堿性條件(即pH為10～14)解離20 min對乙醛衍生化效率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)pH為10和11時，獲得的衍生化產(chǎn)物峰面積相對較低；當(dāng)pH在12～14時，添加等溶度乙醛可獲得較高且接近的衍生物峰面積，說明在該pH范圍內(nèi)衍生化效率并無顯著變化，因而選擇13作為前處理pH。

圖2 溶劑對衍生物提取效果的影響

圖3 解離pH對乙醛衍生化效率的影響

2.2.3 前處理時間的影響 堿性環(huán)境下，結(jié)合態(tài)乙醛釋放出來需要一定的時間，對于結(jié)合態(tài)乙醛含量較高的酒樣，解離時間太短會造成解離不充分，影響測定結(jié)果。試驗(yàn)選取解離時間分別為5，10，20，30，40 min，結(jié)果(見圖4)表明，解離時間為20 min時所得的產(chǎn)物響應(yīng)值最高。

圖4 前處理時間對乙醛衍生化效率的影響

Figure 4 Effect of different pretreatment time on the efficiency of acetaldehyde derivatives

2.2.4 衍生劑用量的影響 分別使用0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，濃度為5 g/L的2,4-二硝基苯肼溶液對衍生化效率的影響，結(jié)果(見圖5)顯示，隨著衍生化實(shí)際使用量的升高，衍生化效率越高，當(dāng)衍生化試劑超過0.5 mL后，衍生化效率趨于平穩(wěn)，說明在該試驗(yàn)條件下衍生試劑最佳用量為0.5 mL。的定量差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定的結(jié)果扣除本底后與標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果差別不大。這是因?yàn)樵摲椒ㄏ♂尡稊?shù)較大，稀釋后基質(zhì)影響可忽略。因此，在確定方法檢出限時，可使用標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，以3倍信噪比(S/N=3)對應(yīng)的濃度乘以稀釋倍數(shù)換算為方法的檢出限。

圖5 衍生試劑用量對衍生化效率的影響

Figure 5 Influence of the amount of derivatization reagent on the efficiency of acetaldehyde derivatives

表2 紅葡萄酒基質(zhì)加標(biāo)與空白加標(biāo)測定對比

表3 白葡萄酒基質(zhì)加標(biāo)與空白加標(biāo)測定對比

2.3 方法的線性范圍和回收率

該方法的檢出限采用試劑空白添加標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋進(jìn)行測定得到，以3倍信噪比(S/N=3)對應(yīng)的濃度確定為方法的檢出限，因而該方法葡萄酒中乙醛的檢出限為0.06 mg/L。

該方法的稀釋倍數(shù)為20倍，方法測定的線性范圍為：0.2～100.0 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 4，校準(zhǔn)曲線方程為y=7.194×104x+2.929×103。

該方法通過在樣品基質(zhì)中加標(biāo)的方法測定回收率的方法來驗(yàn)證方法的正確度。因?yàn)闊o法找到空白基質(zhì)，且樣品中乙醛含量不一，故在3種葡萄酒基質(zhì)加標(biāo)回收時選擇了約10%～20%常見含量、常見含量、2倍常見含量和5倍常見含量進(jìn)行回收率試驗(yàn)，加標(biāo)時每個水平重復(fù)進(jìn)行6次平行單獨(dú)測定，結(jié)果表明方法的總體平均回收率為89.3%～113.0%，方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.28%～9.42%，能夠滿足日常檢測需要。

2.4 實(shí)際樣品的測定

使用該方法對通過進(jìn)口法檢委托的27個葡萄酒樣品進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果見表4。由表4可知，不同類型的葡萄酒中乙醛的本底差別較大，其中葡萄酒中乙醛的含量在1～3 mg/kg，白葡萄酒和起泡葡萄酒的含量在20 mg/kg以上，當(dāng)檢測結(jié)果超過檢測限時需要增大稀釋倍數(shù)，使之落在線性范圍之內(nèi)。

3 結(jié)論

該研究建立了氣相色譜—質(zhì)譜測定葡萄酒中乙醛含量的方法，研究了兩個衍生化產(chǎn)物、提取溶劑、解析pH、衍生化實(shí)際用量等因素對定量結(jié)果的影響。結(jié)果表明，該方法檢測限為0.12 mg/kg，線性范圍為0.2～100.0 mg/kg，r2=0.999 4，樣品加標(biāo)回收率為89.3%～113.0%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.28%～9.42%(n=6)，適用于紅葡萄酒、白葡萄酒、起泡葡萄酒中乙醛含量的測定，該方法可用于其它酒類中乙醛含量的測定。本研究的不足之處在于操作略嫌繁瑣。

表4 葡萄酒樣品的測定結(jié)果與信息

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Determination of acetaldehyde in wine by gas chromatography-mass spectrometry

韋曉群1,2,3鄭 璇2郭慶園2,3凌 莉2,3曾廣豐2,3黃 瑾2蔡 純2

(1.SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong510642,China; 2.GuangdongInspectionandQuarantineTechnologyCenter,Guangzhou,Guangdong510623,China; 3.GuangdongKeyLaboratoryofImportandExportTechnicalMeasuresofAnimal,PlantandFood,Guangzhou,Guangdong510623,China)

A method for determination of acetaldehyde in wine by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was established, in which the influence factor on the detected results were studied, such as extraction agent, desorption pH, derivatization reagents. As a result, the limit of determination (LOD) of vanillin and ethyl-vanillin was 0.12 mg/kg. linearity range was 0.2～100.0 mg/kg(R2=0.999 4), The spiked recovery was between 89.3%～113.0%, and the RSD ranged from 1.28%～9.42%(n=6). This method was applicable for determination of acetaldehyde in wine.

acetaldehyde; wine; GC—MS

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.016

國家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目(編號：2015IK065)

韋曉群(1979-)，男，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)副研究員，博士。 E-mail:weixq@iqtc.cn

2016—08—20