段 月 劉敦華 李世瑤 趙宇慧 房 想

(寧夏大學(xué)，寧夏 銀川 750021)

不同生長期枸杞多糖變化規(guī)律及特性研究

段 月 劉敦華 李世瑤 趙宇慧 房 想

(寧夏大學(xué)，寧夏 銀川 750021)

以不同生長期枸杞為研究對(duì)象，采用液相色譜分析多糖組成；以Vc為對(duì)照，比較分析不同生長期枸杞中枸杞多糖清除羥自由基、超氧陰離子、DPPH和ABTS的活力；采用流變儀分析不同生長期枸杞多糖的流變學(xué)特征。結(jié)果表明，不同生長期枸杞多糖的單糖組成相同，但其單糖摩爾比差別顯著；頭茬果多糖的體外抗氧最強(qiáng)；青果期、轉(zhuǎn)色期、頭茬枸杞、普通夏果和秋季果的多糖粘度分別為1.02，1.26，1.53，1.49，1.37 Pa·s。該研究為今后枸杞多糖在不同生長期積累變化及形成機(jī)理提供理論依據(jù)。

枸杞多糖；單糖組成；流變學(xué)特性；抗氧化活性

枸杞是中國傳統(tǒng)的中草藥亦可做食材，寧夏枸杞皮厚多汁，入口甘甜，馳名中外。枸杞果實(shí)是主要的入藥和食用部分，枸杞多糖是枸杞果實(shí)最主要的功能活性成分之一[1-2]。研究表明，枸杞多糖具有抗衰老[3]、降血脂[4]、降血糖[5]、抗腫瘤[6-7]、提高免疫力[8]等作用，枸杞多糖具有水溶性，是一種以—O—連接的糖結(jié)合蛋白高分子聚合物，由6種中性單糖和1種酸性單糖組成[9-10]。國內(nèi)外研究[11-13]較多的是以成熟干燥的枸杞果實(shí)分析某一品種或地域枸杞多糖的提取、分離、純化、單糖組成及抗氧化活性等。還未見研究枸杞果實(shí)在不同生長期多糖變化、流變特性及清除自由基活度等。

本研究擬采用動(dòng)態(tài)研究分析枸杞果實(shí)不同生長期枸杞多糖的含量積累及各個(gè)階段多糖特性的變化，包括單糖組成、流變特性和清除羥自由基、超氧陰離子、DPPH和ABTS的活度變化，旨在探明枸杞果實(shí)不同生長期多糖的積累以及特性的變化情況，確定積累量最大的時(shí)期及特性最優(yōu)生長期，為更深入研究枸杞多糖提供理論基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 采樣和材料

以賀蘭山腳下農(nóng)場(chǎng)大面積種植13年生的寧杞1號(hào)為試驗(yàn)材料，從開花坐果到成熟，將花后第 9、15天(5月25日、6月1日)采的樣稱青果期；第25、30天(6月10日、6月15日)采的樣稱著色期(黃果期)；第34、35天(6月19日、6月20日)采樣稱生長期；將6月19～22日采摘的枸杞稱為頭茬枸杞；將7月9～20日采摘的枸杞稱為普通夏果；將10月2～5日采摘的枸杞稱為秋季果。

1.2 主要試劑和儀器

葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、木糖、阿拉伯糖單糖標(biāo)準(zhǔn)品：≥99%，美國Sigma-Aldrich公司；

3，5-二硝基水楊酸，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸、磷酸二氫鉀、水楊酸、硫酸亞鐵、ABTS溶液、DPPH溶液、Tris—HCl緩沖液、鄰苯三酚：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

乙腈、甲醇:色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

分析天平：AL204型，梅特勒-托利多儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：T6型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-Ⅲ型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

二列八孔電熱恒溫水浴鍋：HH?S21-Ni6型，北京長安永創(chuàng)科學(xué)儀器有限公司；

真空凍干試驗(yàn)機(jī)：JDG-0.2型，蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司；

色譜工作站：T2100P型，上海通微分析技術(shù)有限公司；

色譜柱：VenusilXBPC18型，上海本昂科學(xué)儀器有限公司；

流變儀：AR1500ex型，美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖、總糖和還原糖含量的測(cè)定 采用3，5-二硝基水楊酸法[14]。

1.3.2 單糖組成的測(cè)定

(1) 枸杞多糖的提?。簩⒉煌L期鮮枸杞于熱風(fēng)干燥箱中45 ℃恒溫干燥至恒重，粉碎過60目篩，用石油醚60 ℃水浴冷凝回流脫色，再用80%的乙醇70 ℃恒溫水浴1～4 h除去還原糖，將濾渣收集到燒瓶中，加入蒸餾水250 mL，于100 ℃水浴鍋中浸提1.5 h，重復(fù)4次，收集濾液。將沸水浸提得到的多糖溶液放置于1 000 mL的圓底燒瓶中，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空濃縮到100 mL。Sevag法脫蛋白，80%醇沉，凍干(預(yù)凍溫度-50 ℃，壓強(qiáng)50 Pa，加入板溫度40 ℃)，多糖于蒸餾水中溶解，3 μm膜過濾后注入TOYOPEARL DEAE-650M瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行純化，洗脫液分別為蒸餾水，0.5，1.0，1.5，2.0 mol/L NaCl溶液，分別洗脫5 h，洗脫速率為1.5 mL/min。蒸餾水洗脫2 h后開始收集解析液，10 min/管。合并相應(yīng)的溶液，濃縮、透析后凍干得不同生長期的枸杞多糖。

(2) 枸杞多糖的水解：準(zhǔn)確稱取制得的不同階段枸杞多糖各30 mg，分別置于10 mL具塞試管內(nèi)，加入2 mol/L 三氟乙酸2 mL，于100 ℃烘箱中水解8 h，水解液用4 mol/L 氫氧化鈉溶液中和至pH為7，離心，取清液，定容到10 mL。

(3) 配置單糖標(biāo)品：稱取葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、木糖、阿拉伯糖單糖標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg溶于10 mL的容量瓶中定容(用水定容)至刻度線，得對(duì)照單糖標(biāo)品溶液，取單糖標(biāo)品溶液各1 mL置于10 mL的容量瓶中混合，定容到10 mL，即得單糖混合標(biāo)品。吸取混合單糖標(biāo)品1 mL分別稀釋成1，2，4，5，8，10 mL 6個(gè)濃度的單糖混合溶液，每種標(biāo)品依次含有20.0，10.0，5.0，4.0，2.5，2.0 μg。

(4) 樣品和單糖標(biāo)品的柱前衍生化：精密吸取混合對(duì)照標(biāo)品液和多糖水解溶液各1 mL與0.5 mol/L PMP甲醇溶液0.5 mL及0.3 mol/L NaOH 溶液0.5 mL 混合，充分振搖，80 ℃水浴條件下反應(yīng)30 min并且不時(shí)地?fù)u動(dòng)，冷卻至室溫后，加入0.3 mol/L HCl 0.5 mL 進(jìn)行中和，分別取1 mL衍生化的溶液置于10 mL的離心管中，加入5 mL氯仿萃取，4 500 r/min離心15 min，棄去有機(jī)層，重復(fù)萃取5次，得上層清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過3次，準(zhǔn)備上液相[15-16]。

(5) 色譜條件：SP-120-5C18-AP色譜柱(4.6 mm ID×150 mm)；流動(dòng)相：A相為0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 6.98)，B相為乙睛；洗脫梯度(0 min，0% B；10 min，18% B；20 min，25% B)；紫外吸收檢測(cè)器，檢測(cè)波長250 nm；柱溫30 ℃，流速為1 mL/min。每次進(jìn)樣20 μL。

(6) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將1.3.2(3)配置的6個(gè)濃度的單糖混合溶液按照1.3.2(4)的方法用PMP衍生化處理，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積(mV)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各單糖的線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 7 種單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 流變性的測(cè)定 采用AR1500EX流變儀，選用直徑為40 mm不銹鋼錐板系統(tǒng)，在25 ℃下平衡20 min后，室溫下測(cè)各階段濃度為0.2 mg/mL枸杞多糖的粘度[17-18]。

1.3.4 枸杞多糖體外抗氧化活性的測(cè)定

(1) 清除羥自由基的活性：將2 mmol/L FeSO4溶液、1 mmol/L H2O2溶液和6 mmol/L的水楊酸溶液各3 mL放入25 mL比色管中，震蕩搖勻，放入水浴鍋中37 ℃水浴20 min。將不同生長期、不同濃度的多糖樣液各1 mL加入到編號(hào)的比色管中，另取一支試管加入1 mL純水作對(duì)照，分別定容至10 mL，在37 ℃下水浴20 min，取出后在510 nm條件下測(cè)定，樣液吸光度值記作A1，對(duì)照樣品的吸光度值記作A0，每個(gè)試樣作3個(gè)平行樣，取其平均值[19]。根據(jù)式(1)計(jì)算樣液羥自由基(·OH) 的清除率。

(1)

式中：

P——·OH清除率，%；

A1——樣液吸光度值；

A0——對(duì)照樣品的吸光度值。

(2) 清除超氧陰離子的活性：將各個(gè)階段枸杞多糖分別配成0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL溶液待測(cè)液備用。取0.05 mmol/L的Tris—HCl緩沖液4.5 mL，置于25 ℃水浴中預(yù)熱，分別加入待測(cè)液1 mL和25 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.4 mL，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，加入8 mmol/L HCl 1 mL終止反應(yīng)，299 nm處測(cè)定吸光度，空白對(duì)照組以相同體積的蒸餾水代替樣品?？瞻椎奈舛扔涀鰽0，樣液的吸光度值記作A1，每個(gè)試樣作3個(gè)平行樣，取其平均值[20]。根據(jù)式(1)計(jì)算超氧陰離子清除率。

(3) 清除DPPH自由基的活性：取各階段不同濃度的多糖溶液2 mL，加入0.16 mmol/L DPPH溶液2 mL在暗處室溫放置反應(yīng)30 min，以60%的乙醇溶液凋零，在517 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)i，空白試驗(yàn)中用蒸餾水代替試樣，測(cè)得吸光度值A(chǔ)0。每個(gè)試樣做3次平行試驗(yàn)，取其平均值[21]。DPPH自由基清除率按式(2)計(jì)算：

(2)

式中：

P——DPPH自由基清除率清除率，%；

Ai——加入DPPH后多糖溶液的吸光度；

Aio——未加DPPH的多糖溶液的吸光度；

Ao——未加多糖溶液的DPPH吸光度。

(4) 清除ABTS自由基的活性：將濃度為6 mmol/L ABTS+溶液10 mL和5 mmol/L K2S2O8溶液20 mL混合于陰暗處反應(yīng)15 h，得ABTS自由基溶液。按照體積比為1∶20 的比例將不同樣液與制得的ABTS+自由基溶液反應(yīng)，靜置反應(yīng)5 min，在745 nm處測(cè)得吸光值A(chǔ)1，以蒸餾水代替樣液作空白對(duì)照A0，每個(gè)樣液做3次平行試驗(yàn)，取其平均值[22]。根據(jù)式(1)計(jì)算樣液對(duì)ABTS+的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長期多糖的含量

由圖1可知，枸杞果實(shí)生長發(fā)育過程中，總糖、還原糖和多糖的含量呈正相關(guān)，都呈逐漸增加的趨勢(shì)。果實(shí)發(fā)育的前19 d，多糖含量積累十分緩慢，總糖和還原糖積累速率漸增；19～24 d總糖和還原糖含量迅速積累，總糖的日增量為0.384 g/100 g，還原糖的日增量為0.38 g/100 g，此時(shí)多糖的含量變化仍不明顯；24～29 d后，總糖和還原糖的積累速率加快，總糖的日增量為0.524 g/100 g，還原糖的日增量為0.454 g/100 g，多糖的積累量加快，日增量達(dá)到0.07 g/100 g；29～34 d總糖的日增量為0.568 g/100 g，還原糖的積累速率減小，日增量為0.384 g/100 g，多糖積累速率則達(dá)到最快，日增量為0.184 g/100 g。

圖1 不同生長期總糖、還原糖和多糖含量變化圖

Figure 1 Changes of total sugar, reducing sugar and polysaccharide in different growth stages

由表2可知，普通夏果總糖和還原糖的含量最高，頭茬枸杞略少，秋季果則遠(yuǎn)不入夏季果含量高。就多糖含量來看，頭茬枸杞多糖含量最高，其次是普通夏果，秋季果的多糖含量最少。

在枸杞果實(shí)藥用價(jià)值中，總糖、還原糖及多糖含量起重要作用。對(duì)枸杞總糖、多糖和還原糖含量的測(cè)定結(jié)果表明，糖的大量累積都是在進(jìn)入轉(zhuǎn)色期后。不同采收期總糖、還原糖及多糖含量也存在差異，說明不同采收期枸杞多糖結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可能存在差異。如果以總糖和還原糖含量評(píng)價(jià)枸杞，以普通夏果最優(yōu)，以多糖含量評(píng)價(jià)枸杞，頭茬枸杞最優(yōu)。

表2 不同生長期枸杞總糖、還原糖和多糖含量

Table 2 The contents of total sugar, reducing sugar and polysaccharide in different picking periods g/100 g

生長期總糖還原糖多糖頭茬果 11.209.681.52普通夏果11.329.841.48秋季果 9.628.391.23

2.2 不同生長期枸杞多糖的單糖組成

由圖2可知，7種單糖標(biāo)準(zhǔn)品得到很好的分離。以保留時(shí)間定性分析，以峰面積和進(jìn)樣的濃度做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)曲和峰面積進(jìn)行不同物質(zhì)的定量分析。與圖2對(duì)照得出，不同生長期枸杞多糖的單糖均由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖7種單糖組成(圖略)。 不同生長期枸杞多糖的7種單糖組成見表3。由表3可知，各個(gè)生長期枸杞多糖單糖組成有顯著差異。各個(gè)時(shí)期單糖組成摩爾比可以得出青果期多糖主要以半乳糖和阿拉伯糖組成，轉(zhuǎn)色期多糖主要以半乳糖醛酸、葡萄糖和阿拉伯糖組成，成熟枸杞多糖主要以半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成。甘露糖含量均較低，阿拉伯糖含量均較高，甘露糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖于生長期含量達(dá)最高，鼠李糖和木糖呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，半乳糖醛酸呈先增后減的趨勢(shì)。

1. 甘露糖 2. 鼠李糖 3. 半乳糖醛酸 4. 葡萄糖 5. 半乳糖 6. 木糖 7. 阿拉伯糖

? 同列字母不同者差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同生長期枸杞多糖流變性的變化

由圖3可知，經(jīng)過相同處理不同生長期枸杞多糖的粘度區(qū)別較明顯，取100～300 s的20個(gè)點(diǎn)的平均值，得到青果期、黃果期、頭茬果、普通夏果、秋季果的粘度分別為1.02，1.21，1.53，1.49，1.46 Pa·s。對(duì)于大分子的多糖分子結(jié)構(gòu)，粘度越大表明結(jié)構(gòu)越伸展或分子量越大[23]。由試驗(yàn)結(jié)果可知，頭茬果的粘度最大，表明其多糖分子量最大，或多糖結(jié)構(gòu)越伸展。

2.4 不同生長期枸杞體外抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 清除羥自由基的活性 由圖4可知，不同生長期枸杞多糖清除羥自由基的活性都是隨濃度的增加而增加的，且存在差異性，成熟果實(shí)多糖清除羥自由基活性達(dá)最高。3 mg/mL 濃度下的活度約為60%，較黃果多糖活度高20%，較青果多糖活度高52%。不同采收期的枸杞多糖清除羥自由基的活度也不一樣，頭茬果>普通夏季果>秋季果。

2.4.2 清除超氧陰離子的活性 由圖5可知，不同生長期枸杞多糖清除超氧陰離子的活性都隨濃度增加而增加，且存在一定的差異性。頭茬枸杞多糖清除超氧陰離子的活性最高，3 mg/mL濃度下頭茬果多糖活性為24%，比黃果多糖活高14%，比青果多糖活性高21%，不同采收期枸杞多糖清除超氧陰離子活性也不盡相同，頭茬果>普通夏季果>秋季果。2.4.3 清除DPPH自由基的活性 由圖6可知，隨著枸杞果實(shí)的生長發(fā)育，其多糖清除DPPH自由基的活性不斷上升，且多糖濃度與清除DPPH自由基的活性呈正相關(guān)。3 mg/mL 濃度下青果多糖活性為8%，黃果多糖比青果活性高5.25倍，成熟果多糖是黃果多糖活性的1.67倍。不同采收期多糖活性比較，頭茬果>普通夏季果>秋季果。

圖3 不同生長期枸杞多糖流變性

Figure 3 Rheological properties of Chinese wolfberry in different mature stages

圖4 多糖清除羥自由基的活性

2.4.4 清除ABTS自由基的活性 由圖7可知，不同生長階段枸杞多糖清除ABTS自由基的活性有明顯提高，且隨著濃度增加，各階段多糖活性變化顯著，3 mg/mL濃度下清除ABTS自由基的活性比較，青果多糖<黃果多糖<秋果多糖<普通夏果多糖<頭茬果多糖。

圖5 多糖清除超氧陰離子的活性

圖6 多糖清除DPPH自由基的活性

圖7 多糖清除ABTS自由基的活性

綜上所述，不同生長期枸杞在多糖低于1 mg/mL濃度下檢測(cè)不到體外抗氧化活性，隨濃度升高多糖體外清除自由基活性增加。不同濃度處理的同一生長期比較，多糖以清除DPPH自由基的活性最佳，清除超氧陰離子的活性較差。相同濃度下不同生長期枸杞多糖多糖清除自由基活性，隨枸杞果實(shí)生長而增加，以頭茬果多糖活性最優(yōu)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以開花坐果至成熟的枸杞果實(shí)為對(duì)象，分析了不同生長期多糖的含量，研究不同生長階段枸杞多糖的單糖組成、流變特性并分析其清除羥自由基、超氧陰離子、DPPH、ABTS自由基的體外抗氧化活性。綜合試驗(yàn)可以得出，不同生長期多糖在單糖組成、流變性特性及體外抗氧化活性上存在很大的差異性。

以往研究枸杞多糖多見枸杞干燥中提取多糖、純化、結(jié)構(gòu)分析，并分析其功能特性，而枸杞多糖在不同生長期及加工過程變化規(guī)律及特性未見報(bào)道。本試驗(yàn)研究分析了不同生長期枸杞多糖組成變化、流變學(xué)特性及抗氧化活性等，至于其分子量變化規(guī)律以及與某些關(guān)鍵蛋白(酶)之間的關(guān)系將是以后研究的關(guān)鍵點(diǎn)和方向。

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Study on variation regularity and characteristics of Lycium barbarum polysaccharide in different mature stage

DUAN YueLIUDun-huaLIShi-yaoZHAOYu-huiFANGXiang

(NingxiaUniversity,Yingchuan,Ningxia750021,China)

Studied the change ofLyciumbarbarumpolysaccharides (LBP) in different growth periods, by using the wolfberries in different growth periods as research objects, and analyzed the LBP composition by HPLC. Taking VC as the control sample, the LBP’s activities of scavenging hydroxyl radicals, superoxide anions, DPPH and ABTS were analyzed and compared in different growth periods. The rheological characteristics of LBP in different growth periods were analyzed by a rheometer. The results indicated that the monosaccharide composition of LBP was the same in different growth periods, but the monosaccharide molar ratios of the polysaccharides were significantly different. The antioxidant activity in vitro of the polysaccharides of the first-crop fruits was the strongest. The polysaccharides viscosities of green wolfberries, coloring wolfberries, first-crop wolfberries, summer wolfberries and autumn wolfberries were 1.02, 1.26, 1.53, 1.49 and 1.37 Pa?s, respectively. This study provided the theoretical basis for the future study on the accumulation and change of LBP and the formation principle of LBP in different growth periods.

wolfberry polysaccharide; composition of monosacchar-ides; rheological property activity; antioxidant activity

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.012

國家科學(xué)自然基金(編號(hào)：31560436)

段月，女，寧夏大學(xué)在讀碩士研究生。

劉敦華(1964-)，男，寧夏大學(xué)教授，博士。 E-mail: dunhualiu@126.com

2016—10—03