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        蘄春蘄艾頭茬艾和二茬艾的產(chǎn)量及質量比較研究△

        2021-12-01 01:57:10袁衛(wèi)東顏鴻遠陳盛秋陳中文陳昌婕
        中國現(xiàn)代中藥 2021年10期
        關鍵詞:差異

        袁衛(wèi)東,顏鴻遠,陳盛秋,陳中文,陳昌婕*

        1.蘄春縣農業(yè)農村局,湖北 蘄春 438300;2.湖北中醫(yī)藥大學 中藥資源中心,湖北 武漢 430065;3.湖北惠春蘄艾健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司,湖北 蘄春 438300

        艾葉為菊科植物艾Artemisia argyiLévl.et Van的干燥葉,具有溫經(jīng)止血、散寒止痛、祛濕止癢等功效[1],為中醫(yī)臨床常見用藥,具有悠久的應用歷史。現(xiàn)代藥理表明,艾葉中富含揮發(fā)油、黃酮、酚酸等類成分,具有消炎抗菌、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節(jié)等多種藥理作用[2],被廣泛應用于醫(yī)藥產(chǎn)品、動物飼料、消毒劑等產(chǎn)品中。除此之外,艾葉碾磨篩去粉末之后即為艾絨,可以用來制作艾柱,對治療類風濕關節(jié)炎[3]、潰瘍性結腸炎[4]等療效較好,可以防治多種傳染性疾病[5]。蘄春是艾葉的道地產(chǎn)區(qū),蘄艾自明朝以來就廣受推崇。目前,對不同產(chǎn)地艾葉品質的比較研究也證明了蘄艾的道地性[6-7]。中藥材原植物在不同的生長階段化學成分含量差異較大[8],適宜的采收期對于保證蘄艾的品質具有重要作用。歷代本草對于艾葉采收期的記載不盡相同,從唐代的三月初三至宋代的五月初五,再至明代逐步過渡到端午節(jié)前后[9],現(xiàn)代研究也證明6 月未開花前采收的艾葉品質較好[10-12]。

        在采收次數(shù)上,除河南省南陽市部分產(chǎn)區(qū)艾采收2~3 次(頭茬艾于5—6 月采收,二茬艾于8 月采收,三茬艾于10 月采收)外,包括湖北省蘄春縣在內的大部分產(chǎn)區(qū)一般于端午節(jié)前后進行1 次采收。3 月初艾苗進入快速生長階段,5 月后生長速度明顯趨于緩慢,于6 月未開花前進行采收后,蘄艾再次進入營養(yǎng)生長階段,干物質快速積累,至8 月已經(jīng)長成較成熟的艾株。生產(chǎn)上,由于二茬艾的質量不明確,為了保證蘄春蘄艾的品牌價值,第一次采收之后再次生長的蘄艾往往被擱置,產(chǎn)生了大量的浪費。為充分利用蘄艾資源、提高其經(jīng)濟價值、最大限度降低對土地資源的浪費,本研究對蘄艾頭茬艾與二茬艾的產(chǎn)量和品質進行了系統(tǒng)分析,為二茬艾的合理利用提供參考。

        1 材料

        1.1 儀器

        Trace 1310 型氣相質譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher 公司);1260 型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);JSM-6510 型掃描電子顯微鏡(日本電子公司)。

        1.2 試藥

        對照品異澤蘭黃素(批號:B21568)、棕矢車菊素(批號:B21708)均購于上海源葉生物科技有限公司,純度均為98.0%;對照品新綠原酸(批號:X-014-180410)、隱綠原酸(批號:Y-067-180425)、異綠原酸A(批號:Y-068-190329)、異綠原酸B(批號:Y-069-180105)、異綠原酸C(批號:Y-070-180515)均購于成都瑞芬生物科技有限公司,純度均為98.0%;對照品綠原酸(批號:110753-201716,純度:99.3%)購于中國食品藥品檢定研究院。

        1.3 樣品

        試驗地位于湖北省蘄春縣管窯鎮(zhèn)胡崗村蘄艾試驗示范基地,試驗采用壟作種植[13],壟幅寬80 cm,壟溝寬30 cm,壟高25 cm。于2019 年12 月5 日將蘄艾根狀莖截成15~25 cm,按照每壟種2 行,行距40 cm,株距10 cm 進行定植,其余按蘄艾種植常規(guī)的農事操作進行。蘄艾由湖北中醫(yī)藥大學中藥資源中心劉大會教授鑒定為菊科植物艾Artemisia argyiLévl.et Van。試驗設頭茬艾(對照)和二茬艾2 個處理,于2020 年5 月25 日采收頭茬艾,2020 年8月1日對再次萌發(fā)的艾進行2次采集。

        2 方法

        2.1 農藝性狀和產(chǎn)量測定

        每次采收前,在試驗地不同方位隨機選取3 個采樣點測定蘄艾生長指標和產(chǎn)量。各采樣點選取具有代表性的15 株蘄艾測定相關農藝性狀,株高為地面基部至蘄艾莖頂端的高度;莖徑為蘄艾莖稈高度1/2處的直徑;枯葉高為植株莖稈中下部枯葉處的高度;葉片寬和葉片長為每株蘄艾中部葉片的寬、長。每個采樣點按長10 m、寬5 m 進行拉線測產(chǎn)。收割后及時晾干,稱定葉片、莖稈的干質量并計算葉莖干質量比。

        2.2 出絨率測定

        采用四分法從每份艾葉樣品中稱取艾葉干品10 g,置轉速為28 000 r·min-1的高速萬能粉碎機中粉碎30 s,將粉碎后的混合物置一號篩中,反復篩凈粉末,即得艾絨。計算艾絨質量占總質量的比例,每份樣品進行2 次平行實驗,以其平均值為出絨率。

        2.3 總揮發(fā)油及揮發(fā)性成分測定

        2.3.1 總揮發(fā)油提取 選取干燥艾葉40 g,剪碎后置2000 mL 圓底燒瓶中,加入蒸餾水1000 mL,浸泡過夜,參照《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015 年版通則揮發(fā)油測定法[13]提取7 h,收集并測定艾葉干品中總揮發(fā)油含量。

        2.3.2 氣相色譜-質譜(GC-MS)分析 采用TG-1701 MS 毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)對樣品進行GC-MS 分析[14],得到揮發(fā)油總離子流圖,見圖1。

        圖1 艾葉揮發(fā)油GC-MS圖

        2.3.3 供試品溶液制備 吸取脫水后的艾葉揮發(fā)油,加入二氯甲烷稀釋100倍,即得。

        2.4 黃酮和酚酸類成分含量測定

        2.4.1 超高效液相色譜(UPLC)條件 利用UPLC測定綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、棕矢車菊素、異澤蘭黃素的含量[15]。對照品和艾葉UPLC圖見圖2。

        圖2 混合對照品和艾葉UPLC圖

        2.4.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、棕矢車菊素、異澤蘭黃素適量,用甲醇制成含新綠原酸25.39 μg·mL-1、綠原酸60.27 μg·mL-1、隱綠原酸19.36 μg·mL-1、異綠原酸B 72.71 μg·mL-1、異綠原酸A 279.22 μg·mL-1、異綠原酸C 40.12 μg·mL-1、棕矢車菊素40.87 μg·mL-1、異澤蘭黃素78.69 μg·mL-1的混合對照品溶液,即得。

        2.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取艾葉粉末(過一號篩)0.1 g 于25 mL 量瓶中,加入色譜純甲醇定容至刻度線,稱定質量,放置過夜,超聲處理30 min,冷卻至室溫后用甲醇補足減失質量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜,即得。

        2.5 數(shù)據(jù)分析

        利用Mainlib 數(shù)據(jù)庫進行譜庫檢索并結合相關文獻[15-16]對GC-MS 圖中的色譜峰進行定性分析;利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2004 A版對艾葉揮發(fā)油GC-MS圖譜進行分析;采用SIMCA-P14.1軟件進行主成分分析(PCA);采用Excel 2010 與SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

        3 結果

        3.1 植株農藝性狀比較

        從表1 可知,二茬艾與頭茬艾的株高、莖粗差異有統(tǒng)計學意義,分別降低了50.26%和37.66%。二茬艾的枯葉與頭茬艾相比增加了16.37%,葉片長、葉片寬分別降低了4.53%和7.16%,差異均無統(tǒng)計學意義。由此可見,二茬艾的農藝性狀不如頭茬艾,主要表現(xiàn)在株高與莖粗上,但枯葉高、葉片長、葉片寬的差異無統(tǒng)計學意義。

        表1 頭茬艾與二茬艾的植株農藝性狀比較(,n=3)

        表1 頭茬艾與二茬艾的植株農藝性狀比較(,n=3)

        注:與頭茬艾比較,大寫字母表示P<0.01。

        3.2 產(chǎn)量比較

        從圖3 可知,二茬艾葉片干質量、莖稈干質量和總干質量均與頭茬艾差異有統(tǒng)計學意義。二茬艾葉片干質量與頭茬艾相比降低了38.46%,莖稈干質量降低了47.46%,總干質量降低了50.79%。頭茬艾平均葉莖比為0.59,二茬艾平均葉莖比為0.87,二茬艾的葉莖比比頭茬艾提高了47.46%。說明二茬艾的產(chǎn)量較頭茬艾明顯降低,但葉莖比明顯提高。

        圖3 頭茬艾與二茬艾產(chǎn)量比較(,n=3)

        3.3 葉片出絨率比較

        出絨率是評價艾葉質量的重要指標之一,出絨率越高,說明艾葉中非腺毛密度越高,越適宜作為制造灸材的原材料。從圖4可以看出,二茬艾的出絨率與頭茬艾相比提高了66.34%。利用掃描電鏡在200 倍放大倍數(shù)下觀察頭茬艾與二茬艾植株中部葉片背部非腺毛并拍照,從圖5可以看出,二茬艾葉片中非腺毛的密度明顯高于頭茬艾。這說明二茬艾中非腺毛的積累量明顯高于頭茬艾,葉片的出絨率較高。

        圖4 頭茬艾與二茬艾出絨率比較(,n=3)

        圖5 頭茬艾與二茬艾中部葉片掃描電鏡圖(×200)

        3.4 葉片總揮發(fā)油及揮發(fā)性組分比較

        3.4.1 總揮發(fā)油含量比較 從圖6 可知,二茬艾的總揮發(fā)油含量與頭茬艾相比降低了12.9%,但差異無統(tǒng)計學意義。這說明與頭茬艾相比,二茬艾葉片中總揮發(fā)油的積累量較低,但降低幅度較小。

        圖6 頭茬艾與二茬艾中總揮發(fā)油含量(,n=3)

        3.4.2 揮發(fā)性組分比較 取6 批艾葉樣品提取總揮發(fā)油,按揮發(fā)性成分含量測定方法檢測,得到總離子流圖,將各揮發(fā)油的GC-MS 圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004 A 版,生成6 批樣品指紋圖譜(圖7)和指紋圖譜相似度(表2),3批頭茬艾與3 批二茬艾組內相似度均大于0.95,所有批次的艾葉相似度均大于0.90,符合指紋圖譜要求。

        表2 艾葉揮發(fā)油GC-MS 指紋圖譜相似度

        圖7 頭茬艾和二茬艾GC-MS指紋圖譜

        由GC-MS 分析結果可知,頭茬艾與二茬艾葉片中揮發(fā)油化學成分的種類差異不大,從頭茬艾與二茬艾葉片揮發(fā)性成分中選取萜類、烯類和酯類化合物共31 種共有成分,見表3。采用峰面積歸一化法計算頭茬艾與二茬艾中這31 種成分所占總流出峰面積的平均相對百分含量,這31 種共有成分分別占頭茬艾與二茬艾總揮發(fā)性成分的75.08%和74.60%。其中,質量分數(shù)超過5%的共有成分有桉油精(頭茬艾16.55%、二茬艾17.04%)、異龍腦(頭茬艾11.47%、二茬艾5.72%)、側柏酮(頭茬艾9.99%、二茬艾10.94%)、D-樟腦(頭茬艾6.58%、二茬艾9.78%)和(-)-4-萜品醇(頭茬艾5.81%、二茬艾5.70%),這5 種揮發(fā)性成分總含量分別占頭茬艾與二茬艾葉片總揮發(fā)油含量的50.40%和49.19%。二茬艾中桉油精、側柏酮、D-樟腦、反式石竹烯等15 種共有成分的含量多于頭茬艾,其中8 種共有成分含量顯著高于頭茬艾,而異龍腦、乙酸冰片酯、(-)-4-萜品醇等16 種成分含量低于頭茬艾,其中8 種共有成分含量顯著低于頭茬艾。頭茬艾與二茬艾中桉油精的含量差異不大,但二茬艾中龍腦的含量顯著低于頭茬艾。由此可見,雖然頭茬艾與二茬艾葉片中揮發(fā)性組分無明顯差異且主要藥用成分桉油精的差異較小,但16 種揮發(fā)性組分的相對含量差異較大,說明頭茬艾與二茬艾葉片中各揮發(fā)性組分的積累存在明顯差異。

        表3 頭茬艾與二茬艾葉片中揮發(fā)性成分相對質量分數(shù)(,n=3)

        表3 頭茬艾與二茬艾葉片中揮發(fā)性成分相對質量分數(shù)(,n=3)

        注:與頭茬艾相比,小寫字母表示P<0.05;大寫字母表示P<0.01;表4同。

        3.5 葉片黃酮和酚酸類成分比較

        從表4 可知,頭茬艾與二茬艾葉片中隱綠原酸、異綠原酸B 和異綠原酸A 的含量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),棕矢車菊素的含量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與頭茬艾相比,二茬艾葉片中異綠原酸B、異綠原酸A 和棕矢車菊素的含量分別增加了34.89%、97.97%和614.74%,隱綠原酸的含量降低了48.48%,而新綠原酸、綠原酸、異綠原酸C 和異澤蘭黃素的含量差異無統(tǒng)計學意義。說明頭茬艾和二茬艾中葉片中各黃酮和酚酸類成分含量差異較大,除隱綠原酸外,二茬艾中其余黃酮和酚酸類成分含量均有所增加或差異不大,整體來說,二茬艾葉片中黃酮及酚酸類成分含量高于頭茬艾。

        表4 頭茬艾與二茬艾葉片黃酮和酚酸類成分質量分數(shù)(,n=3) mg·g?1

        表4 頭茬艾與二茬艾葉片黃酮和酚酸類成分質量分數(shù)(,n=3) mg·g?1

        3.6 葉片中化學成分的PCA

        PCA 是一種無監(jiān)督模式的識別方法,可通過降維的方式直觀展現(xiàn)多變量的樣品差異。將頭茬艾與二茬艾葉片總揮發(fā)油及31 種揮發(fā)性成分含量、8 種黃酮和酚酸類成分含量導入SIMCA-P14.1 軟件進行分析,得PCA 得分圖(圖8)??梢钥闯鲱^茬艾與二茬艾沿著PC1 軸方向具有明顯的區(qū)分趨勢,且6 批樣品可完全按照采集時間進行歸類,這說明了頭茬艾與二茬艾葉片中化學成分差異明顯。

        圖8 頭茬艾與二茬艾化學成分的PCA得分

        4 討論

        頭茬作物和二茬作物的產(chǎn)量及品質差異較大,劉剛等[17]通過研究發(fā)現(xiàn),二茬燕麥與頭茬燕麥相比經(jīng)濟產(chǎn)量和單位面積粗蛋白含量較低;李春宏等[18]發(fā)現(xiàn),二茬高粱的產(chǎn)量顯著高于頭茬高粱。本試驗中,二茬艾的株高與莖粗顯著低于頭茬艾,這可能是由于5 月蘄艾第一次采收前經(jīng)歷了長時間的營養(yǎng)積累,而二茬艾營養(yǎng)生長期天氣炎熱,氣候條件和水分狀況及根系活力不如3—5 月,到了8 月,蘄艾進入開花前的物質準備階段而停止生長,因此蘄艾的生長速度和物質積累時間不如頭茬艾,導致二茬艾的葉片干質量、莖稈干質量顯著低于頭茬艾。頭茬艾收割之后,留茬主稈上開始萌發(fā)2~5 個側芽,生長成新的蘄艾植株,因此二茬艾的莖稈較細,也解釋了二茬艾葉莖比顯著高于頭茬艾的結果。

        將艾葉粉碎可以制成艾絨,艾絨的主要成分是一種特殊形態(tài)的非腺毛[19],主要分布于艾葉的背部,在炎熱的夏季可以降低葉片的蒸騰作用,防止水分過度散失,保證植株正常的生理代謝[20]。在本試驗中,二茬艾的出絨率顯著高于頭茬艾,這可能是由于二茬艾的營養(yǎng)生長期氣候炎熱,蘄艾為了抵御不良環(huán)境而分化出了更多的非腺毛。也有研究證明,隨著艾葉葉齡增大,其非腺毛逐漸脫落,出絨率降低[21],而二茬艾的葉齡較頭茬艾更低,與該研究結果一致。艾葉中富含豐富的揮發(fā)油、黃酮和酚酸類成分,是衡量艾葉品質的主要因素。二茬艾中的總揮發(fā)油含量與頭茬艾相比降低了12.9%,兩者的GC-MS 總離子流圖較為相似,但其各組分含量差異明顯。桉油精和龍腦是艾葉在《中國藥典》2020 年版中的規(guī)定成分[22],對于呼吸系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病的治療有良好的效果[23],頭茬艾與二茬艾中桉油精成分含量差異不大,但頭茬艾中龍腦含量明顯高于二茬艾;側柏酮和樟腦是艾葉揮發(fā)油中已知的毒性成分[24],側柏酮對于肝、腎和神經(jīng)系統(tǒng)有明顯毒性,樟腦對于生殖器官、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟和心臟具有不良反應,二茬艾中的側柏酮和D-樟腦含量高于頭茬艾,由此可見,頭茬艾揮發(fā)油的產(chǎn)量及藥理活性優(yōu)于二茬艾,但總體來說差異不明顯。艾葉中的黃酮和酚酸類成分具有鎮(zhèn)痛消炎、改善血液循環(huán)、溫經(jīng)止血等作用[2],二茬艾中除隱綠原酸含量有所下

        降之外,其余成分均為上升或變化較小,這說明二茬艾中黃酮和酚酸類成分含量較高,質量較好。

        綜上所述,二茬艾雖葉片產(chǎn)量不如頭茬艾,但蘄艾采收2茬與采收1茬相比可增產(chǎn)61.5%,增產(chǎn)幅度較大。二茬艾的出絨率較高,適宜作為制作灸材的原材料,創(chuàng)造較高的經(jīng)濟效益;二茬艾總揮發(fā)油含量略低于頭茬艾,但藥用活性成分桉油精含量無明顯差異;除此之外,二茬艾中黃酮和酚酸類成分含量總體來說優(yōu)于頭茬艾,質量較好。因此,生產(chǎn)實踐上可以通過采收二茬艾提高蘄艾的產(chǎn)量,且二茬艾質量較優(yōu),可以加以利用,減少對資源的浪費。

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