朱芹，黃湘杰

1.湘潭市食品藥品檢驗所，湖南 湘潭 411000；2.湘鄉(xiāng)市人民醫(yī)院 藥劑科，湖南 湘鄉(xiāng) 411400

固腎生發(fā)丸的功效是固腎養(yǎng)血、益氣祛風(fēng)，臨床用于治療斑禿、全禿、普禿及肝腎之癥狀性脫發(fā)，是由何首烏、黑芝麻、女貞子、熟地黃、枸杞子、羌活、川芎、木瓜、當歸、桑椹、丹參、黨參12 味中藥加工制成的中藥復(fù)方制劑[1]。方中重要藥味何首烏、女貞子、川芎、木瓜、當歸均是直接粉碎成細粉入藥，《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版明確規(guī)定，須對直接入藥的生藥粉進行滅菌。目前，中藥常用滅菌方法有濕熱滅菌、環(huán)氧乙烷滅菌及輻照滅菌，而輻照滅菌作為一種冷滅菌技術(shù)，具有殺菌效果高效、徹底、經(jīng)濟等優(yōu)勢[2-3]。我國自20 世紀80 年代開展60Co-γ射線輻照對中藥滅菌工藝和質(zhì)量評價的研究[4]。1997 年，原衛(wèi)生部頒發(fā)第38 號文件《允許輻照的藥材品種名錄》[5]，但何首烏、女貞子、川芎、木瓜、當歸均未被列入其中，且無文獻報道針對60Co-γ射線輻照對固腎生發(fā)丸中藥原粉影響的研究。因此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測定何首烏、女貞子、川芎、木瓜、當歸中有效成分的含量，結(jié)合指紋圖譜的方法，分析10批輻照前后共30份固腎生發(fā)丸樣品指紋圖譜和特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素6 個化學(xué)成分含量，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2012A版和SPSS 19.0軟件中配對樣本t-檢驗對結(jié)果進行評議，為固腎生發(fā)丸采用60Co輻照滅菌提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀，包括G1311A 型四元梯度泵、G1329A 型自動進樣器、G1314B 型二極管陣列檢測器（DAD）、G1316A 型柱溫箱Agilent-Chemistation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（安捷倫科技有限公司）；ML204T 型電子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司）；S300 型超聲波清洗機（40 kHz，500 W，德國Elma 公司）；LM61-HG-S30 型優(yōu)普系列超純水機（南京威美特科學(xué)儀器有限公司）；輻照源為60Co-γ射線輻照設(shè)備（北京易達測量技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

對照品特女貞苷（批號：111926-201906，純度：95.0%）、女貞苷（批號：111918-201703，純度：94.4%）、阿魏酸（批號：110773-201915，純度：99.4%）、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖 苷（批號：110844-201915，純度：90.7%）、齊墩果酸（批號：110709-201908，純度：91.7%）、大黃素（批號：110756-201913，純度：96.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純（美國默克公司）；磷酸為色譜純（西隴科學(xué)股份有限公司）。

10 批市售固腎生發(fā)丸，吉林省俊宏藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.25 g/丸，批號分別為20190117（Y1）、20190206（Y2）、20190318（Y3）、20190420（Y4）、20190511（Y5）、20190623（Y6）、20190909（Y7）、20191015（Y8）、20191112（Y9）、20191219（Y10）。

2 方法與結(jié)果

2.1 輻照方法與微生物限度檢查

取固腎生發(fā)丸供試品10 批，平置于60Co 專用輻照室，分別設(shè)置3、6、9 kGy 3 個不同輻照劑量及48 h輻照時間。

隨機取1 批輻照前后固腎生發(fā)丸，制成1∶10、1∶100、1∶1000 的待測液，按照《中國藥典》2020 年版（四部）通則1105 規(guī)定考察輻照前后樣品中微生物的變化情況，結(jié)果見表1。從表1 可以看出，隨著輻照劑量增大，固腎生發(fā)丸的含菌量明顯減少。

表1 固腎生發(fā)丸輻照前后含菌量測定結(jié)果

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A 為乙腈，流動相B 為0.8% 磷酸溶液[6-8]，梯度洗脫（0～20 min，25%～45%A；20～55 min，45%～48%A；55～60 min，48%～65%A；60～70 min，65%～55%A；70～80 min，55%～25%A）；檢測波長：254 nm（0～20 min，2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷）、220 nm（20～55 min，特女貞苷、阿魏酸、女貞苷）、320 nm（55～60 min，大黃素）、206 nm（60～80 min，齊墩果酸）；流速為0.9 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL。在上述色譜條件下，6 個成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5580，系統(tǒng)適用性良好。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液的制備 取特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素對照品各適量，加甲醇制成含特女貞苷212.42 μg·mL-1、女貞苷45.92 μg·mL-1、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷190.86 μg·mL-1、阿魏酸115.18 μg·mL-1、齊墩果酸90.69 μg·mL-1和大黃素96.77 μg·mL-1的溶液，混勻，濾過，即得混合對照品儲備液。冰箱冷藏保存。

2.3.2 供試品溶液的制備 取固腎生發(fā)丸（批號：20190623）及經(jīng)輻照處理的樣品內(nèi)容物各適量，剪碎，混勻，取約2.0 g，精密稱定，置100 mL 棕色量瓶中，加入55%甲醇約85 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（450 W，40 kHz，水溫：20 ℃）處理45 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用55%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm 的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.4 固腎生發(fā)丸HPLC指紋圖譜的研究

2.4.1 精密度試驗 取固腎生發(fā)丸（批號：20190623），按2.3.2 項下方法制備成同一供試品溶液，照2.2項下色譜條件連續(xù)進樣6針。以第一針指紋圖譜為對照，計算6 份圖譜相似度，結(jié)果各指紋圖譜相似度結(jié)果均大于0.99，符合指紋圖譜相似度技術(shù)要求（≥0.95），表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取固腎生發(fā)丸（批號：20190623），按2.2 項下色譜條件，分別在0、4、8、12、16、24 h 進樣。計算相似度（以0 h 進樣的色譜圖為參照圖譜），結(jié)果6次進樣指紋圖譜間相似度均大于0.96，符合指紋圖譜相似度技術(shù)要求（≥0.95），表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一批固腎生發(fā)丸（批號：20190623）6份，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，照2.1項下色譜條件進樣。計算相似度（以第一次進樣的色譜圖為參照圖譜），結(jié)果6 次采集的指紋圖譜間相似度均大于0.96，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 固腎生發(fā)丸指紋圖譜的建立及部分共有峰指認 取10 批固腎生發(fā)丸及經(jīng)3、6、9 kGy 劑量輻照滅菌后的固腎生發(fā)丸樣品適量，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，照2.2 項下色譜條件測定。分別將輻照前后供試品色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2012A 版軟件，設(shè)置時間窗為0.5 min，采用中位矢量法多點校正[9-10]，分別生成0、3、6、9 kGy 輻照處理后固腎生發(fā)丸的對照指紋圖譜，計算各批不同輻照劑量與對照指紋圖譜的相似度。從生成的指紋圖譜可以看出，經(jīng)0、3、6、9 kGy劑量60Co-γ射線輻射處理后的固腎生發(fā)丸指紋圖譜中，輻照前后色譜峰位置及共有峰數(shù)目基本一致，共檢測到23 個共有峰，通過與2.3.1 項下混合對照品比對，可確認4 號峰為2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、7 號峰為阿魏酸、11 號峰為特女貞苷、13 號峰為女貞苷、18 號峰為大黃素及21 號峰為齊墩果酸。色譜圖見圖1，計算結(jié)果見表2。

表2 10批固腎生發(fā)丸相似度計算結(jié)果

圖1 固腎生發(fā)丸HPLC指紋圖譜和混合對照品色譜圖

2.5 固腎生發(fā)丸中6種成分定量分析

2.5.1 線性關(guān)系的考察 分別精密量取2.3.1 項下混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL 置25 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液，精密吸取上述系列混合對照品溶液按2.2 項下色譜條件測定。以各組分質(zhì)量濃度為橫坐標（X），色譜峰峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明：特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素在實驗濃度范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。取混合對照品溶液，用甲醇倍比稀釋，分別取峰面積信噪比（S/N）為10 時相應(yīng)對照品質(zhì)量濃度為定量限（LOQ）。結(jié)果見表3。

表3 固腎生發(fā)丸中6個成分線性關(guān)系考察結(jié)果和定量限

2.5.2 儀器精密度試驗 取2.2.1 項下的混合對照品溶液，按2.2項下色譜條件，連續(xù)進樣6針，記錄色譜圖。結(jié)果特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素峰面積的RSD 分別為0.49%、0.37%、0.66%、0.55%、0.71%和0.88%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批（批號：20190623）固腎生發(fā)丸供試品溶液（0 kGy），按2.2 項下條件，分別于0、5、10、15、20、24 h 進樣，記錄色譜圖。結(jié)果特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素峰面積的RSD分別為0.75%、0.65%、0.79%、0.71%、0.84%和0.93%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 耐用性試驗 采用3 根規(guī)格均為（250 mm×4.6 mm，5 μm）不同品牌號的C18色譜柱（Agilent Prep、Shimadzu、Durashell）進行分析，6 個成分相互之間及與其他各色譜峰之間均能達良好分離。

2.5.5 重復(fù)性試驗 稱取同一批（批號：20190623）未經(jīng)輻照固腎生發(fā)丸6份，照2.3.2項下方法處理，按2.2 項下條件測定，記錄色譜圖。結(jié)果特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素6種成分質(zhì)量分數(shù)分別為2.181 3、0.420 8、1.657 4、1.812 2、0.611 6、0.646 5 mg·g-1，RSD 分別為0.97%、0.77%、1.12%、1.01%、0.91% 和0.88%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 取未經(jīng)輻照滅菌且已知含量的固腎生發(fā)丸供試品（批號：20190623）6 份，每份約1.0 g，混勻，精密稱定，分別精密加入特女貞苷0.473 6 mg·mL-1、女貞苷0.100 4 mg·mL-1、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷0.365 9 mg·mL-1、阿魏酸0.393 3 mg·mL-1、齊墩果酸0.133 5 mg·mL-1、大黃素0.139 3 mg·mL-1混合對照品溶液5.0 mL，按2.3.2項下方法制備溶液，按2.2 項下的色譜條件測定，記錄色譜圖，計算各組分加樣回收率，結(jié)果見表4。結(jié)果特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素的回收率為97.96%～101.29%，RSD 分別為0.94%、0.71%、1.05%、0.45%、0.81%和0.65%。

表4 固腎生發(fā)丸5個成分的加樣回收率試驗

2.5.7 樣品測定 分別取10 批未經(jīng)輻照處理的固腎生發(fā)丸供試品及經(jīng)3、6、9 kGy 劑量輻照處理后的固腎生發(fā)丸供試品，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，照2.2 項下色譜條件分析，測定樣品中特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素含量，利用SPSS 22.0 軟件對滅菌前后含量進行配對t檢驗，考察不同劑量60Co-γ射線輻射滅菌對固腎生發(fā)丸中6個化學(xué)成分的影響，結(jié)果見表5。

表5 固腎生發(fā)丸6個成分含量測定結(jié)果 mg·g-1

續(xù)表5

采用SPSS 22.0 軟件對表5 中6 個化學(xué)成分的含量進行統(tǒng)計學(xué)分析，對6 個化學(xué)成分經(jīng)3、6、9 kGy輻照滅菌后與未輻照滅菌樣品的含量采用配對樣本t檢驗分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示，輻照劑量為6 kGy 及以下時特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素含量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義；當劑量達到9 kGy 時，特女貞苷和女貞苷含量變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

3.1 指標性成分的選定

固腎生發(fā)丸中何首烏是常用的補益中藥，主要含有二苯乙烯類、蒽醌類、黃酮類等成分，《中國藥典》2020 年版中分別收錄何首烏與制何首烏，其均包含二苯乙烯苷及蒽醌類的含量測定項，其代表成分2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素是何首烏發(fā)揮功效的特征物質(zhì)基礎(chǔ)，具有補益精血、固腎烏須之功效[11-12]；具有明目烏發(fā)、滋補肝腎之功效的女貞子，其代表成分為環(huán)烯醚萜苷類特女貞苷及女貞苷，藥理研究表明，女貞苷具有抗氧化、增強免疫等作用[13]；阿魏酸既是《中國藥典》2020 年版中當歸質(zhì)量控制的指標成分，也是川芎質(zhì)量控制的指標成分，主要藥理作用為行血化瘀、改善人體血液循環(huán)系統(tǒng)[14]；2003 年就被列入《藥食同源目錄大全》的木瓜，三萜類成分齊墩果酸是其主要的活性成分，具有保肝、護腎、調(diào)血脂的藥理作用[15]。中藥指紋圖譜可以對多指標、多組分的質(zhì)量進行整體研究，能全面反映中藥中所含的復(fù)雜成分及相互關(guān)聯(lián)，為中藥質(zhì)量控制的全面性、深入性提供了有力的保障[16]。故本研究采用HPLC 建立了固腎生發(fā)丸的指紋圖譜，并對特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素進行含量測定。

3.2 輻照劑量的選擇

《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》指出，中藥輻照劑量原則上不得超過10 kGy，綜合以上標準及優(yōu)先從小劑量考察的原則，選定3、6、9 kGy 3 個劑量。表1結(jié)果顯示，輻照劑量為3 kGy 時即可達到中藥制劑微生物標準。結(jié)合表5 含量測定結(jié)果，故最佳輻照劑量＜6 kGy。

3.3 60Co-γ射線輻照滅菌結(jié)果分析

60Co-γ射線輻照滅菌是利用60Co 產(chǎn)生的γ射線殺滅微生物的過程。本研究以未輻照固腎生發(fā)丸的指紋圖譜作為參照，不同輻照劑量下所得到的指紋圖譜與對照指紋圖譜采用相似度評價系統(tǒng)進行比較，結(jié)果表明，在＜6 kGy 的輻照劑量下，相似度均大于0.96，說明固腎生發(fā)丸的化學(xué)穩(wěn)定性較好；從含量和共有峰數(shù)量方面可以看出，輻照滅菌對固腎生發(fā)丸無影響。由表5 含量測定結(jié)果可知，特女貞苷和女貞苷2種成分在輻照劑量為9 kGy 時平均質(zhì)量分數(shù)分別降低54.09%和47.54%，含量變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。特女貞苷中的環(huán)烯醚萜部分通過其裂環(huán)上的酯鍵與紅景天苷相連，而女貞苷則與酪醇或羥基酪醇等苯乙醇類化合物相連，均屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類多酚化合物[17]，性質(zhì)不穩(wěn)定、酯鍵斷裂，這可能是導(dǎo)致特女貞苷和女貞苷在輻照劑量9 kGy時含量降低主要原因。

本研究建立了不同劑量60Co-γ輻照滅菌前后的固腎生發(fā)丸HPLC指紋圖譜，同時，建立了HPLC測定固腎生發(fā)丸中特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素6 個成分含量的方法，并通過相關(guān)軟件比較了輻照滅菌前后6 個成分含量的變化。研究結(jié)果顯示，經(jīng)60Co-γ輻照滅菌劑量不超過6 kGy，適用于固腎生發(fā)丸的質(zhì)量控制。