宋艷艷， 緱文斌， 張　巍

(1新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 新疆　石河子　832000;2新疆醫(yī)科大學(xué)， 烏魯木齊　8300111;

3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科， 烏魯木齊　830054)

CXCR4和MMP2在三陰乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的表達(dá)及其相關(guān)性

宋艷艷1， 緱文斌2， 張巍3

(1新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 新疆石河子832000;2新疆醫(yī)科大學(xué)， 烏魯木齊8300111;

3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科， 烏魯木齊830054)

摘要：目的探討基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2)和趨化因子受體CXCR4在人三陰乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的表達(dá)及其相關(guān)性。方法采用過表達(dá)質(zhì)粒CXCR4和干擾SiRNA-CXCR4分別轉(zhuǎn)染人三陰乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，分為空白轉(zhuǎn)染組、無關(guān)轉(zhuǎn)染組和目的轉(zhuǎn)染組，應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測人三陰乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2)和趨化因子受體CXCR4的 mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果有效提高CXCR4的表達(dá)后，與空白轉(zhuǎn)染組和無關(guān)轉(zhuǎn)染組比較，目的轉(zhuǎn)染組CXCR4及MMP2的mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；有效沉默CXCR4后，與空白轉(zhuǎn)染組和空白轉(zhuǎn)染組比較，目的轉(zhuǎn)染組CXCR4及MMP2的mRNA及蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論CXCR4能夠調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2)的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)三陰乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。

關(guān)鍵詞：三陰乳腺癌； CXCR4； MMP2

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年增高趨勢。三陰乳腺癌(triple-negative breast cancers，TNBC)是乳癌的特殊亞型[1]，占乳癌的10%～24%[2]。林堅等[3]發(fā)現(xiàn)，相比與其他類型乳腺癌，TNBC發(fā)病年齡早、惡性程度高、死亡率高、轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后差。Zlotnik等[4]研究表明，趨化因子CXCL12及受體CXCR4在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)在包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中表達(dá)，對細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行降解，從而參與腫瘤的浸潤、侵襲與轉(zhuǎn)移[5-6]。本研究擬探討CXCR4和MMP-2在三陰乳腺癌浸潤與轉(zhuǎn)移中的作用及其相關(guān)性，為臨床治療TNBC奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231(上海中科院細(xì)胞庫)，L-15培養(yǎng)基(Sober，14300039)，胎牛血清(Gibco，10099141)，胰蛋白酶(Gibco，25200056)，青鏈霉素(Hyclone,SV30010)，二甲基亞(DMSO)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司)，凱基全蛋白提取試劑盒(南京凱基公司)，凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒(南京凱基)。目的抗體均購自Abcam公司，一抗包括CXCR4(abcam，ab2074，1/1 000)、MMP2(abcam,ab51125, 1/1 000)、內(nèi)參抗體(abcam，ab8227,1/1 000)。二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記人抗兔IgG(購自中杉金橋)，蛋白顯色劑購自invitrogen，PVDF膜購于Thermo公司，過表達(dá)質(zhì)粒購自歐易生物公司，CXCR4-SiRNA購自吉瑪基因公司，Lip2000轉(zhuǎn)染試劑盒購置Thermo公司。

1.2主要儀器CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，熒光倒置顯微鏡(Thermo)，冷凍超速離心機(Bio-Rad公司)，全波長酶標(biāo)儀(美國Bio-tek公司)，Western blot及轉(zhuǎn)膜設(shè)備(Bio-Rad公司)，凝膠成像儀(Bio-Rad公司)，PCR儀(Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1pcDNA3.1 CXCR4和SiRNA-CXCR4分別轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231將MDA-MB-231置于10%FBS、1%青鏈霉素的L-15完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取對數(shù)生長期細(xì)胞計數(shù)后，按每孔2×106鋪入6孔板中，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)90%～95%時，完全培養(yǎng)基換成無FBS的L-15培養(yǎng)基，細(xì)胞饑餓4 h后，用lip2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后換成含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。本研究共分為空白轉(zhuǎn)染組、無關(guān)轉(zhuǎn)染組、目的轉(zhuǎn)染組。

1.3.2qRT-PCR 檢測三陰乳腺癌細(xì)胞株中CXCR4和MMP-2的mRNA的表達(dá)變化轉(zhuǎn)染48 h后，消化離心后收集各組細(xì)胞，分別提取總RNA，參照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。引物序列如下：CXCR4-F：5′- GGCCCTAGCTTTCTTCCACT-3′，CXCR4-R: 5′-GAGAGGATCTTGAGGCTGGA-3′，產(chǎn)物大小為126 bp。MMP-2-F：5′-ACCTGGATG-CCGTCGTGGAC-3′, MMP2-R：5′-TGTGGCAGCACCAGGGCAAC-3′，產(chǎn)物大小為140 bp。反應(yīng)體系為20 μL，包括cDNA 2 μL、F 1 μL、R 1 μL、water 6 μL、MIX 10 μL。反應(yīng)條件按照說明書設(shè)置。獲取各組標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算Ct 值。

1.3.3Western blot 檢測CXCR4和MMP-2的蛋白變化轉(zhuǎn)染72 h后，收集3組細(xì)胞，分別提取總蛋白，蛋白濃度定量后，按3∶1的比例混勻提取蛋白和4X上樣緩沖液，置于PCR儀中100℃變性10 min。每孔蛋白上樣量為100 μg。制備10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳。將電泳分離條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上，時間為75 min。PBS-Tween20洗膜3次，每次5 min，蒸餾水洗膜5 min后，分別加入一抗(CXCR4、MMP2濃度分別為1∶1 000和1∶1 000)、內(nèi)參抗體b-actin(濃度1∶1 000)，于4℃下孵育過夜；加入人抗兔二抗(濃度1∶1 000)，室溫孵育90 min，PBS-Tween20洗膜3次，每次5 min，蒸餾水洗膜5 min。加入顯色劑顯色，待出現(xiàn)條帶時在凝膠成像儀上成像并進(jìn)行灰度分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間采用單因素方差分析(ANOV)，P<0.05表示差異具統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1qRT-PCR檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后CXCR4 的mRNA表達(dá)變化與空白轉(zhuǎn)染組和無關(guān)轉(zhuǎn)染組比較，目的轉(zhuǎn)染組CXCR4 的mRNA表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)，可見質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染了MDA-MB-231。

注: 與空白轉(zhuǎn)染組相比，△P<0.05， 與無關(guān)轉(zhuǎn)染組相比，*P<0.05。

圖1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后MDA-MB-231的CXCR4的mRNA表達(dá)

2.2qRT-PCR檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后MMP2的mRNA表達(dá)變化與空白轉(zhuǎn)染組和無關(guān)轉(zhuǎn)染組比較，目的轉(zhuǎn)染組 MMP2的 mRNA表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

注: 與空白轉(zhuǎn)染組相比，△P<0.05， 與無關(guān)轉(zhuǎn)染組相比，*P<0.05。

圖2轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后MDA-MB-231的MMP2的mRNA表達(dá)

2.3Western blot檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后CXCR4的蛋白表達(dá)變化與空白轉(zhuǎn)染組和無關(guān)轉(zhuǎn)染組比較，目的轉(zhuǎn)染組CXCR4蛋白表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)，與相應(yīng)的qRT-PCR結(jié)果相一致。

圖3　轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后MDA-MB-231中CXCR4蛋白的表達(dá)

2.4Western blot檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后MMP2的蛋白表達(dá)變化相比于空白轉(zhuǎn)染組和無關(guān)轉(zhuǎn)染組，目的轉(zhuǎn)染組MMP2蛋白表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)，與相應(yīng)的qRT-PCR結(jié)果一致。

圖4　轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后MDA-MB-231中MMP2蛋白的表達(dá)

2.5qRT-PCR檢測siRNA沉默后CXCR4 mRNA的表達(dá)變化與空白轉(zhuǎn)染組和無關(guān)轉(zhuǎn)染組比較，目的轉(zhuǎn)染組 CXCR4 mRNA表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5)，可見siRNA可以成功轉(zhuǎn)染MDA-MB-231。

注: 與空白轉(zhuǎn)染組相比，△P<0.05， 與無關(guān)轉(zhuǎn)染組相比，*P<0.05。

圖5轉(zhuǎn)染SiRNA后MDA-MB-231的CXCR4的mRNA表達(dá)

2.6qRT-PCR檢測siRNA沉默后MMP2 mRNA的表達(dá)變化與空白轉(zhuǎn)染組和無關(guān)轉(zhuǎn)染組比較，目的轉(zhuǎn)染組MMP2 mRNA表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖6)。

注: 與空白轉(zhuǎn)染組相比，△P<0.05， 與無關(guān)轉(zhuǎn)染組相比，*P<0.05。

圖6轉(zhuǎn)染SiRNA后MDA-MB-231的MMP2的mRNA表達(dá)

2.7Western blot檢測siRNA沉默后CXCR4的蛋白表達(dá)變化與空白轉(zhuǎn)染組和無關(guān)轉(zhuǎn)染組比較，目的轉(zhuǎn)染組CXCR4蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖7)，與相應(yīng)的RT-PCR結(jié)果一致。

圖7　轉(zhuǎn)染siRNA后MDA-MB-231中CXCR4蛋白的表達(dá)

2.8Western blot檢測siRNA沉默后MMP2的蛋白表達(dá)變化與空白轉(zhuǎn)染組和無關(guān)轉(zhuǎn)染組比較，目的轉(zhuǎn)染組MMP2蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖8)，與相應(yīng)的qRT-PCR結(jié)果相一致。

圖8　轉(zhuǎn)染siRNA后MDA-MB-231中MMP2蛋白的表達(dá)

3討論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是常見的致死原因，發(fā)生機制相當(dāng)復(fù)雜，相關(guān)的分子學(xué)機制尚未明確，常涉及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的降解和胞間黏附性的改變。ECM是存在于胞間的動態(tài)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[7]，由多種成分組成，其主要成分有膠原、蛋白聚糖及糖蛋白等。作為腫瘤細(xì)胞浸潤擴散的天然屏障，ECM構(gòu)成細(xì)胞生活的微環(huán)境。細(xì)胞轉(zhuǎn)移的首要環(huán)節(jié)是ECM的破壞，其降解可加速腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移?；|(zhì)金屬蛋白酶是鋅離子依賴的高度保守的內(nèi)肽酶，幾乎能降解ECM和基底膜的所有蛋白[8]。MMP2(又稱明膠酶A或IV型膠原酶)是金屬基質(zhì)蛋白酶中明膠酶的一亞型，可以對細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜中的主要成分進(jìn)行降解，將細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的物理屏障破壞，從而進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的浸潤、侵襲與轉(zhuǎn)移[5,9]。國內(nèi)外研究表明，MMP2與乳腺癌、卵巢癌、肺癌等的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[10-11]，且在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中過表達(dá)，與多種惡性腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移有關(guān)[9]。

趨化因子受體CXCR4是趨化因子CXCL12(又稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子，SDF-1)的同源性受體，主要分布于淋巴組織、腦、胸腺、脾臟等，其在發(fā)育、血細(xì)胞的生成、器官發(fā)生、血管生成中發(fā)揮重要作用。近年來大量研究表明，CXCL12-CXCR4所組成的生物軸在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、侵襲及轉(zhuǎn)移中的作用受到廣泛的關(guān)注[12]。腫瘤轉(zhuǎn)移過程是一個嚴(yán)密、非隨機的、器官選擇性的過程。大量研究表明，CXCL12與其同源性受體CXCR4在這個過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[13-14]。

研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌、胃癌和腎透明細(xì)胞癌等惡性腫瘤中，CXCR4在SDF-1的激活下可促進(jìn)細(xì)胞分泌更多的MMP[15-16]，降解ECM，促進(jìn)癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。研究表明，在胰腺癌中，CXCL12-CXCR4生物軸可通過上調(diào)/激活MMP2的表達(dá)促進(jìn)胰腺癌的浸潤[17-18]。Manik等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在肺泡上皮細(xì)胞中抑制CXCR4的表達(dá)可降低MMP2的表達(dá)水平。本研究結(jié)果顯示，有效沉默CXCR4后，目的轉(zhuǎn)染組CXCR4及MMP2的蛋白和mRNA的水平明顯低于空白轉(zhuǎn)染組和無關(guān)轉(zhuǎn)染組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明抑制CXCR4的表達(dá)可以降低MMP2的表達(dá)，與Manik等[19]的研究結(jié)果相一致；有效提高CXCR4的表達(dá)后，CXCR4及MMP2的蛋白和mRNA的水平明顯高于空白轉(zhuǎn)染組和無關(guān)轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明提高CXCR4表達(dá)，可以相應(yīng)提高M(jìn)MP2的表達(dá)。表明MMP2在TNBC中的表達(dá)與CXCR4的表達(dá)呈正相關(guān)，本研究推測CXCR4可能通過調(diào)節(jié)MMP2的表達(dá)，共同促進(jìn)TNBC的浸潤、侵襲與轉(zhuǎn)移。

本研究通過檢測轉(zhuǎn)染前后CXCR4和MMP-2的蛋白及mRNA的表達(dá)變化，初步闡明了MMP-2和CXCR4在TNBC的浸潤、侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用，但CXCR4調(diào)節(jié)MMP2的具體機制有待于進(jìn)一步實驗研究。

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(本文編輯張巧蓮)

·藥學(xué)研究·

The correlation of the expressions of CXCR4 and MMPs on human

triple negative breast cancer cell line MDA-MB-231

SONG Yanyan1, GOU Wenbing2, ZHANG Wei3

(1MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832000,China;2XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011，China;3DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054，China)

Abstract:ObjectiveTo explore expressions of chemokine receptor (CXCR4) and matrix metalloproteinase (MMP2) on human triple negative breast cancer cell line MDA-MB-231 and discuss their correlation. MethodsTransfected pcDNA3.1 CXCR4 plasmid and siRNA-CXCR4 into human breast cancer cell line MDA-MB-231 respectively and divided into three groups, including blank control group, negative control group and experiment group. Detected mRNAs and protein expression levers of MMP2 and CXCR4 in MDA-MB-231 cell by RT-PCR and western blotting techniques. ResultsCompared to blank control group and negative control group, after transfecting pcDNA3.1 CXCR4 plasmid, the mRNAs and protein expression levers of MMP2 and CXCR4 enhanced (P<0.05); after effective silenting CXCR4, compared with blank control group and negative control group, the mRNAs and protein expression levels of CXCR4 and MMP2 decreased (P<0.05). ConclusionCXCR4 expression can positively regulate the expression of MMP2, which regulates breast cancer cells MDA-MB-231 invasion and metastasis.

Keywords:triple negative breast cancer; CXCR4; MMP2

通信作者：李新霞，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥物質(zhì)量控制研究，E-mail：lxx6668@163.com。 阿吉艾克拜爾·艾薩，男(維吾爾族)，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：民族藥學(xué)研究，E-mail:Haji@ms.xjb.ac.cn。

作者簡介：李金芳(1990-)，女，在讀碩士，研究方向:藥物分析。 迪麗阿熱姆·尼加提(1990-)，女(維吾爾族)，在讀碩士，研究方向：天然藥物化學(xué)研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81260486) 國家自然科學(xué)基金(31110103908)

[收稿日期：2015-09-06]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.01.010

中圖分類號：R34

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)01-0048-05