周　寧， 陳江濤， 于文燕

(新疆醫(yī)科大學(xué)1附屬腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科, 烏魯木齊　830011；1第一附屬醫(yī)院骨科中心, 烏魯木齊　830054；

3病理生理學(xué)教研室， 烏魯木齊　830011)

無花果水提取液對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的初步研究

周寧1， 陳江濤2， 于文燕3

(新疆醫(yī)科大學(xué)1附屬腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科, 烏魯木齊830011；1第一附屬醫(yī)院骨科中心, 烏魯木齊830054；

3病理生理學(xué)教研室， 烏魯木齊830011)

摘要：目的探討無花果水提取液 (fig extract,FE) 對(duì)宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞(Hella)及肝癌細(xì)胞 (Hepg2) 增殖的影響及其機(jī)制。方法采用人外周血的單核細(xì)胞系(Thp-1)作為Hella細(xì)胞對(duì)照組；HepG2細(xì)胞對(duì)照組為正常肝細(xì)胞(7702)，細(xì)胞分別給予PBS處理和無花果水提液處理；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽法(MTT)檢測(cè)不同濃度無花果提取液對(duì)細(xì)胞增殖的影響，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。結(jié)果經(jīng)無花果水提液處理后，Thp-1細(xì)胞細(xì)胞活性及形態(tài)無明顯改變；隨著提取液濃度的增加，Hella細(xì)胞細(xì)胞活性逐漸降低，細(xì)胞凋亡的數(shù)量逐漸增加，細(xì)胞固縮失去正常形態(tài)。無花果水提液對(duì)人肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞增殖均有抑制作用，隨著劑量增加，增殖抑制作用增強(qiáng)，呈劑量效應(yīng)關(guān)系(P=0.006),無花果水提液0.06 g/mL時(shí)，人肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)；無花果水提液處理肝癌細(xì)胞后,隨著無花果水提液濃度增加凋亡細(xì)胞顯著增加。當(dāng)劑量<0.08 g/mL時(shí)對(duì)正常細(xì)胞以及肝癌細(xì)胞形態(tài)無明顯影響，當(dāng)劑量>0.08 g/mL時(shí)Hepg2細(xì)胞變形固縮，失去正常形態(tài)。結(jié)論無花果水提取液可能通過影響細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞：無花果； 宮頸癌細(xì)胞； 肝癌細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

無花果樹是一種落葉喬木，隸屬于?？崎艑伲a(chǎn)地中海沿岸，分布于土耳其至阿富汗。中國唐代即從波斯傳入，現(xiàn)南北均有栽培，新疆南部尤多，其果實(shí)(稱為無花果)被用作食物和藥材已經(jīng)有幾個(gè)世紀(jì)[1-5]。無花果中的酚類化合物可以增加血漿脂蛋白含量，在體外還能保護(hù)其免受氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)除了抗氧化作用，在大鼠體內(nèi)，無花果干的水提液可以抑制埃利希癌癥、肉瘤S180和肝癌的生長(zhǎng)[6]。還有研究發(fā)現(xiàn)無花果超臨界流體萃取物，在體外對(duì)U937、95D及AGS腫瘤細(xì)胞具有一定的抗增殖作用，并且能夠抑制肝癌異種移植大鼠細(xì)胞增殖，抑制率約為49%[7]。

宮頸癌是常見婦科腫瘤，尤其在新疆發(fā)病率較高;原發(fā)性肝癌 (hepatocellular carcinoma, HCC) 為我國常見惡性腫瘤之一，居腫瘤病死率的第3位，僅次于胃癌和食管癌，因此尋找天然有效的抗癌防癌植物資源，尤其是可食植物，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究使用無花果水提液處理宮頸癌及肝癌細(xì)胞，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，為尋找有效的防癌抗癌植物資源提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料無花果提取液制備，取無花果干果，干燥后稱取400 g加蒸餾水3 L，水提，棄渣，合并浸出液，濃縮至1.3 g/mL,用PBS配制成0.1～1 mg/mL濃度。CO2培養(yǎng)箱 (Heraes公司，德國)，培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清 (無花果水提液tal bovine serum，F(xiàn)BS) (GibcoBRL公司，美國)，胰酶及DMSO，噻唑藍(lán) (MTT)，F(xiàn)ITC Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 (BD公司，美國)。細(xì)胞均購自美國典型培養(yǎng)物種(American Type Culture Collection, ATCC)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為Hella 細(xì)胞組及其對(duì)照組THP-1細(xì)胞組，Hepg2細(xì)胞組及其對(duì)照組7702細(xì)胞組。用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔總體積為200 μL，培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁，次日分別用不同劑量的無花果提取液(0.1～1 mg/mL)分別處理細(xì)胞24 h，對(duì)照組加入PBS處理24 h，每個(gè)劑量組接種3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2孵箱處理24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加 DMSO 150 μL，振蕩混勻10 min，用酶標(biāo)儀(K=490 nm)測(cè)定OD值(OD值與活細(xì)胞數(shù)成正比)，細(xì)胞抑制率 =1-加藥組OD值/對(duì)照組OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察采用Leica共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)于12孔板分別接種細(xì)胞2×105個(gè)/孔，培養(yǎng)過夜，給予不同劑量的無花果提取液(0.1～1 mg/mL)處理Hella細(xì)胞及Hepg2細(xì)胞，空白對(duì)照組不處理，陰性對(duì)照的 THP-1細(xì)胞組及7702細(xì)胞組給予相應(yīng)最大濃度藥物同體積的PBS，培養(yǎng)24 h后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌貼壁細(xì)胞1次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液(不含有EDTA)消化離心收集細(xì)胞(避免胰酶過度消化)。用PBS洗細(xì)胞2次(2 000 r/min離心5 min)收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)2×105個(gè)細(xì)胞，加入200 μL的Binding Buffer無花果水提液懸浮細(xì)胞；加入5 μL FITC Annexin V混勻后，再加入5 μL Propidium Iodide，混勻；室溫避光、反應(yīng)15 min，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 13.0較件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，繪圖軟件為OriginPro 8.0。首先采用Levene進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，文中樣本方差均齊，則采用單因素方差分析(One-way ANOVA)及兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)處理，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2結(jié)果

2.1無花果水提液對(duì)Hella細(xì)胞增殖的影響隨著提取液濃度的增加，Hella細(xì)胞活力逐漸降低，抑制增殖的作用增強(qiáng)(圖1)，當(dāng)提取液濃度達(dá)到0.9 mg/mL時(shí)，細(xì)胞活力降至最低；當(dāng)提取液濃度為0.4～1 mg/mL，對(duì)細(xì)胞增殖率的影響與PBS對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Thp-1細(xì)胞給予不同濃度的提取液處理后與PBS對(duì)照組相比增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，抑制率變化不明顯(圖2)。與PBS對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)相比(圖3)，Hella細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞固縮，失去正常形態(tài)(圖4)；與PBS對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)相比(圖5)，Thp-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)無明顯變化(圖6)。

表1　無花果水提液對(duì)Hella細(xì)胞及Thp-1細(xì)胞增殖的影響(-x±s)

注： P值為與PBS對(duì)照組相比較。

圖1無花果提取液處理后Hella 細(xì)胞抑制率

圖2無花果提取液處理后Thp-1細(xì)胞抑制率

圖3對(duì)照組用PBS處理24 h后 Hella細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

圖4無花果水提液(0.9 mg/mL)處理24 h后Hella細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

圖5對(duì)照組用PBS處理24 h后 THP-1細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

圖6無花果水提液(0.9 mg/mL)處理24 h后Thp-1細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

2.2不同濃度無花果水提液對(duì)Hella細(xì)胞凋亡的影響隨著無花果水提液濃度的增加，凋亡細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加(圖7,右下象限代表凋亡的細(xì)胞)。

2.3無花果水提液抑制肝癌細(xì)胞增殖及抑制濃度的確定無花果水提液對(duì)人肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的增殖均有抑制作用，隨著劑量增加增殖抑制作用增強(qiáng)，呈劑量效應(yīng)關(guān)系(P=0.006), 且濃度在0.06 g/mL時(shí)正常肝細(xì)胞以及肝癌細(xì)胞增值率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)(圖8)。當(dāng)無花果水提液劑量<0.08 g/mL時(shí)對(duì)正常肝細(xì)胞以及肝癌細(xì)胞形態(tài)無明顯影響，當(dāng)無花果水提液劑量>0.08 g/mL時(shí)Hepg2細(xì)胞變形固縮，失去正常形態(tài)(圖9)。

2.4無花果水提液誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡經(jīng)各種濃度無花果水提液處理肝癌細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果隨著無花果水提液濃度的增加，凋亡細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加(圖10)。

3討論

宮頸癌是全世界范圍內(nèi)婦科最常見的惡性腫瘤之一，且在發(fā)展中國家的發(fā)病率最高[8]，是僅次于乳腺癌居第2位常見的惡性腫瘤。中國每年新增發(fā)病數(shù)超過13萬，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率的73%～93%。肝癌是第五大常見的惡性腫瘤，占腫瘤致死原因的第3位，其5年自然死亡率>95%。全球每年有超過50萬人患有肝癌，其中一半以上在中國。如果能發(fā)現(xiàn)具有防癌抗癌作用的天然食材， 則對(duì)腫瘤防治有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

圖7　Hella細(xì)胞凋亡檢測(cè)

圖8　不同劑量無花果水提液對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率的影響

近年來，日本、法國、挪威和我國的科研人員相繼開展了無花果抗癌防癌的現(xiàn)代研究，證實(shí)無花果含有多種抗癌活性物質(zhì)，其中多酚類具有抗氧化、抗炎、抗過敏及抗癌等多種作用， 對(duì)13種癌細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用，能夠有效阻止癌細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，使其自然死亡[9]。本研究用不同濃度無花果提取液處理Hella細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的增加，Hella細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞固縮，失去正常形態(tài)，但對(duì)Thp-1細(xì)胞增殖及形態(tài)無明顯影響；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著無花果濃度的增加，細(xì)胞凋亡數(shù)量逐漸增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)無花果水提液對(duì)Hpg2細(xì)胞增殖有明顯地抑制作用(P<0.05)，并具有劑量效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)劑量為0.06 g/mL時(shí)，抑制率>60%，劑量為0.1 g/mL時(shí)，可以完全抑制腫瘤細(xì)胞增殖，初步證實(shí)無花果水提液復(fù)合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用。同時(shí)觀察到當(dāng)無花果水提液劑量為0.01～0.07 g/mL時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期無明顯影響，但當(dāng)劑量為>0.07 g/mL時(shí)，Hpg2細(xì)胞變固縮，失去正常細(xì)胞形態(tài)，此結(jié)果提示無花果水提液的毒性作用不容忽視。綜上可見，無花果水提液對(duì)人腫瘤細(xì)胞的增殖有顯著地抑制作用。其作用機(jī)理可能與抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成、誘導(dǎo)細(xì)胞期凋亡有關(guān)[10]，值得進(jìn)一步深入研究。

a: 對(duì)照組; b: PBS 組; c-i: 不同濃度的無花果水提液,濃度分別為0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1 g/mL

圖9HepG2細(xì)胞經(jīng)各濃度無花果水提液處理后的形態(tài)變化

圖10　流式細(xì)胞儀測(cè)不同濃度無花果水提液對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)天然植物具有重要的抗腫瘤作用。無花果中含有多種不同生物活性的化學(xué)成分[11]，且不同部位及不同的提取物[12]均具有一定抗癌活性及抗突變作用:無花果多糖口服可抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)。也有研究報(bào)道，用無花果果漿(Fig fruit latex, FFL)處理體外培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞增殖試驗(yàn) (MTT法) 和克隆形成試驗(yàn)表明FFL對(duì)人腫瘤的增殖具有抑制作用[13]。尹衛(wèi)平等[14]對(duì)無花果抗癌機(jī)理的研究結(jié)果表明，無花果所含苯甲醛是其抗癌的主要成分，香豆素類化合物和呋喃類小分子芳香物也有抗癌作用。本研究有待于從無花果水提液中分離出促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的有效生物學(xué)成分，并進(jìn)一步明確其作用機(jī)制，為臨床診治提供理論依據(jù)。

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(本文編輯楊晨晨)

更正聲明

《新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》2015年12期第1542頁《高b值擴(kuò)散加權(quán)成像在早期缺血性腦梗死診斷中的應(yīng)用價(jià)值》一文的作者簡(jiǎn)介：王儉更正為通信作者，特此更正。

Antiproliferation Activity of Water Extract from Ficus carica L. Fruit on Cervical cancer cell line

ZHOU Ning1, CHEN Jiangtao2, YU Wenyan3

(1DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumuqi830011;2DepartmentofOrthopaedics,theFirstAffiliatedHospitalof

XinjiangMedicalUniversity,Urumuqi830054;3DepartmentofPathophysiology,

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of fig water extract (WE) from Ficus carica L. fruit (FCLF) on the proliferation of different cancer cells and to elucidate the mechanism of its activity in vitro. Meth-odsTHP-1cell line were used as control group vs Hella cell as objective group, and 7702 cell line was used as the control group for the Hepg2 cell. The cells were treated with PBS and WE of FCLF respectively. Effects of different doses of WE of FCLF on cancer cell line were detected by MTT, changes of cell morphology were observed by immunofluorescence and cell apoptosis was measured by flow cytometry. ResultsThere was no obvious change in Thp-1 when treated with WE of FCLF. After treating with FCLF, the cell vitality of Hella cell line gradually reduced, while the cell apoptosis gradually increased and lost its normal form with pycnosis; the cell proliferation were inhibited both in Hepg2 and 7702 cell line with dose-effect relationship (P=0.006) and at 0.06 g/mL of FCLF, the inhibition was statistical significance (P=0.021); the Hepg2 Cell apoptosis increases gradually. At above of 0.08 g/mL of WE of FCLF, the Hepg2 cell showed deformation and pycnosis, while at <0.08 g/mL, there were no obvious changes of cellular morphology both in Hepg2 cell line and 7702 cell line. ConclusionThe WE of FCLF can inhibit the proliferation of different cancer cell line mainly through affecting the cell apoptosis.

Keywords:Ficus carica; cervical cancer cell line; hepatocellular carcinoma; cell apoptosis

通信作者：張巍，女，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤分子病理學(xué),E-mail：zwyhr100@163.com。

作者簡(jiǎn)介：宋艷艷(1988-),女，在讀碩士，研究方向：腫瘤病理診斷。

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2014211C049)

[收稿日期：2015-06-16]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.01.009

中圖分類號(hào)：R363.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-5551(2016)01-0042-06