李夢妍， 王　慧， 馬遇慶

(1新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科， 烏魯木齊　830054；2新疆油田公司準東采油廠職工醫(yī)院病理室， 新疆　阜康　831511)

新疆哈薩克族及漢族食管鱗狀細胞癌組織中CtBP1、CyclinD1的表達及意義

李夢妍1,2， 王慧1， 馬遇慶1

(1新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科， 烏魯木齊830054；2新疆油田公司準東采油廠職工醫(yī)院病理室， 新疆阜康831511)

摘要:目的探討新疆哈薩克族及漢族食管鱗狀細胞癌組織中 CtBP1與CyclinD1蛋白的表達情況及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。 方法應用免疫組化法檢測125例食管鱗狀細胞癌組織及其癌旁正常組織中CtBP1、Cyclin D1的表達。結(jié)果(1)哈薩克族及漢族食管鱗狀細胞癌均多見于中老年人，食管鱗狀細胞癌好發(fā)于中下端。(2)CyclinD1陽性染色細胞主要分布于腫瘤組織細胞核中，CyclinD1在食管鱗狀細胞癌組織的陽性表達率(50.4%)顯著高于癌旁正常組織的陽性表達率(20%)(P<0.01)；而CtBP1在癌旁正常鱗狀上皮的陽性表達率(88 %)高于食管鱗狀細胞癌組織的陽性表達率(66.4%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。(3)哈薩克族食管鱗狀細胞癌組織中CyclinD1陽性表達率(65%)高于漢族食管鱗狀細胞癌組織的陽性表達率(36.9%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.02)；(4)在哈薩克族食管鱗狀細胞癌組織中，腫瘤直徑≥3 cm和<3 cm者CtBP1的表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.037)，同時在不同腫物類型中CtBP1的差異有統(tǒng)計學意義(P=0.02)；在漢族食管鱗狀細胞癌組織中，CtBP1的陽性表達在不同性別、不同年齡組、腫瘤部位、腫瘤大小、大體類型、浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、神經(jīng)侵犯等臨床指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CtBP1和CyclinD1在食管鱗癌組織的表達呈正相關(guān)。結(jié)論Cyclin D1、CtBP1可能在哈薩克族食管鱗狀細胞癌的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，二者聯(lián)合檢測可能對哈薩克族與漢族食管鱗狀細胞癌的診治具有指導意義。

關(guān)鍵詞：食管鱗狀細胞癌； CtBP1； Cyclin D1； 免疫組織化學

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，我國男、女性食管癌發(fā)病率和病死率均居全球首位[1]。不同人群、種族間食管癌的發(fā)病及部分生物學特性也存在一定的差異。新疆作為多民族聚集地，是我國食管癌的高發(fā)地，哈薩克族食管癌的發(fā)病率高于其他民族。Cyclin D1是重要的細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，其過度表達可促使細胞持續(xù)增殖，并可能導致細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，多種腫瘤如乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、喉癌等均發(fā)現(xiàn)了Cyclin D1的高表達[2-4]。CtBP1是一種轉(zhuǎn)錄輔抑制因子，可以促進細胞的增殖，具有抑制多種抑癌基因、激活癌基因的作用，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等[5-6]。Wnt 信號轉(zhuǎn)導通路是一條高度保守的對細胞的分化、遷移、增殖有著重要作用的信號通路，CtBP1與Cyclin D1分別處于Wnt 通路的中、下游，故探討CtBP1與Cyclin D1是否存在相互影響的關(guān)系顯得尤為重要。本研究通過檢測新疆地區(qū)哈薩克族與漢族食管鱗狀細胞癌組織中CtBP1及Cyclin D1的表達情況，并分析CtBP1及Cyclin D1是否存在民族差異。

1資料與方法

1.1一般資料收集新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2007-2014年經(jīng)病理組織學和免疫組織化學確診為食管鱗狀細胞癌標本共125例。所有病人均無術(shù)前相關(guān)化療或者放療病史，其中哈薩克族患者癌組織60例、癌旁正常組織60例，漢族患者癌組織65例、癌旁正常組織65例?；颊吣挲g38～84歲，平均年齡62.39歲。標本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，全部重新制作HE切片。

1.2試劑CtBP1濃縮型兔抗人多克隆抗體(abcam公司，NO.ab79417，USA )，CyclinD1濃縮型兔抗人單克隆抗體 (abcam公司，NO.ab16663，USA)，二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，CtBP1抗體以1∶150稀釋，CyclinD1抗體以1∶100稀釋。

1.3方法嚴格按照試劑盒說明書操作，免疫組化檢測步驟：(1)載玻片防脫片劑處理：選擇APES，撈片后置60 ℃烤箱烤30 min以使切片緊密粘附；(2)切片脫蠟至水；(3)3%雙氧水,室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水水洗2 min×3次；(4)對切片進行抗原熱修復20 min(選擇pH=9.0檸檬酸緩沖修復液)；(5)室溫冷卻后滴加適當稀釋的一抗，4℃過夜，次日0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2 min×3次；(6)滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗2 min×3次；(7)DAB顯色：室溫顯色，控制反應時間不超過5 min，顯色后用自來水沖洗去DAB；(8)蘇木精復染、脫水、透明、中性樹膠封片、觀察。

1.4評價標準

1.4.1CyclinD1評價標準CyclinD1以腫瘤細胞的細胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性染色，在正常鱗狀上皮呈低表達或不表達，將腫瘤細胞中或正常食管鱗狀上皮細胞中未見棕黃色顆粒或隱約見淡黃色顆粒視為陰性表達，每張切片在400×光鏡下隨機觀察10個視野，每個視野計數(shù)100個上皮細胞，共計1 000個細胞，采用雙評分法進行判定[7]，依據(jù)陽性細胞的比例和顯色強度決定。計分標準：陽性細胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；顯色強度評分：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；二者乘積≤1為陰性，2～4分為(+)，5～7分為(++)，≥8分為(+++)，(+～+++)均視為陽性表達。

1.4.2CtBP1評價標準CtBP1以腫瘤細胞的細胞質(zhì)和細胞核同時出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性染色，在正常鱗狀上皮呈低表達或不表達，光鏡視野觀察與CyclinD1相同，亦采用雙評分法進行判定，將腫瘤細胞或正常食管鱗狀上皮細胞中未見棕黃色顆?；螂[約見淡黃色顆粒視為陰性表達，陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的30%為1分，30%～70% 為2分，>70%為3分；細胞無顯色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；二者乘積0～1分為陰性，≥2分為陽性。以上結(jié)果均由2位高年資病理醫(yī)師同時進行評價。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件整理數(shù)據(jù)，分析CtBP1和Cyclin D1陽性表達情況與哈薩克族及漢族食管鱗狀細胞癌患者的民族、年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、神經(jīng)侵犯等指標間的差異。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

新疆哈薩克族及漢族食管鱗狀細胞癌組織中 CtBP1與CyclinD1蛋白表達情況及其與臨床病理結(jié)果顯示：(1)哈薩克族及漢族食管鱗狀細胞癌均多見于中老年人，食管鱗狀細胞癌好發(fā)于中下端。(2)CyclinD1陽性染色細胞主要分布于腫瘤組織細胞核中(圖1)，CyclinD1在食管鱗狀細胞癌組織的陽性表達率(50.4%)顯著高于癌旁正常組織的陽性表達率(20%)(P<0.01)；而CtBP1在癌旁正常鱗狀上皮的陽性表達率(88.0 %)高于食管鱗狀細胞癌組織的陽性表達率(66.4 %)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。(3)CyclinD1在哈薩克族食管鱗狀細胞癌組織的陽性表達率(65.0 %)高于漢族食管鱗狀細胞癌組織的陽性表達率(36.9 %)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.02)(表1)；(3)在哈薩克族食管鱗狀細胞癌組織中，腫瘤直徑≥3 cm和<3 cm者CtBP1的表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.037)，同時在不同腫物類型中CtBP1表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.02)；在漢族食管鱗狀細胞癌組織中，CtBP1的陽性表達與不同性別、不同年齡組、腫瘤部位、腫瘤大小、大體類型、浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、神經(jīng)侵犯等臨床指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。CtBP1和CyclinD1在食管鱗癌組織的表達呈正相關(guān)(表3)。

A： CyclinD1陽性信號呈棕黃色顆粒狀

B： CyclinD1表達于細胞核

C： CyclinD1在食管鱗癌組織中呈陰性表達

圖1免疫組織化學檢測CyclinD1在食管鱗狀細胞癌的表達情況(DAB,×100)

A： CtBP1在食管鱗癌組織中呈強陽性表達

B： CtBP1在食管鱗癌組織中呈弱陽性表達

C： CtBP1在食管鱗癌組織中呈陰性表達

圖2　免疫組織化學檢測CtBP1在食管鱗狀細胞癌的表達情況(DAB, ×100)

表2　哈薩克族與漢族食管鱗狀細胞癌患者臨床病理參數(shù)與CtBP1表達的關(guān)系

表3　CtBP1與CyclinD1的表達與食管鱗狀細胞癌的相關(guān)性

3討論

組織細胞的有絲分裂包括G1、S、G2、M 4個時期，G1、S、G2屬于分裂間期，M為分裂期。細胞周期蛋白Cyclin D1作為細胞周期調(diào)節(jié)因子之一，主要作用于G1期，其異常表達可導致細胞周期失調(diào)，加速細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，使細胞一直處于不斷增殖的類似前體細胞的狀態(tài)，從而引起腫瘤的發(fā)生。目前的研究中，Cyclin D1的表達與食管癌組織的各臨床病理指標的關(guān)系的結(jié)論并不統(tǒng)一[8-10]。張冬坤等[11]研究認為Cyclin D1表達與上述臨床指標無明顯相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，Cyclin D1的陽性表達與食管癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯和神經(jīng)侵犯無關(guān)。導致CyclinD1的過表達與食管癌各臨床指標結(jié)果不一致的原因可能是目前缺乏統(tǒng)一的、能夠被廣泛接受并采用的免疫組化評分標準，選用不同的判定方法其統(tǒng)計學結(jié)果可能不同。另外，本研究顯示在漢族與哈薩克族食管癌組織中Cyclin D1的表達有民族差異，哈薩克族食管癌組織的Cyclin D1陽性表達比例明顯高于漢族，說明Cyclin D1的陽性表達在民族間至少漢族及哈薩克族表達差異有統(tǒng)計學意義，提示Cyclin D1在哈薩克族食管癌的發(fā)生、發(fā)展中具有比漢族更加明顯的作用，并且有望成為食管鱗狀細胞癌潛在的診斷標志物。

CtBP是轉(zhuǎn)錄輔抑制因子，由CtBP1基因和CtBP2基因編碼，CtBP1作為CtBP家族重要成員之一，通過調(diào)節(jié)細胞漿中高爾基體的功能，協(xié)同多種癌基因作用于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，CtBP1還可以發(fā)揮細胞增殖因子的作用，抑制細胞周期抑制因子，以促進細胞的增殖。CtBP1以間接依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的方式與多種DNA 綁定抑制劑結(jié)合，其在鱗狀細胞癌中的高表達，考慮是因為癌細胞通常有更多的NADH以對抗低氧或缺氧狀態(tài)，所以癌細胞中CtBP1的活性比正常細胞高。CtBP1在上皮性卵巢癌中的表達高于正常卵巢及卵巢良性腫瘤，在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，其表達隨著膠質(zhì)瘤級別的升高而逐漸升高，而在正常腦組織中表達水平極低，CtBP1可能在上皮性卵巢癌及膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[12-13]；但是國內(nèi)其他學者認為: CtBP1在結(jié)腸腺癌組織中并沒有百分之百表達，而在癌旁組織中卻百分之百表達；在子宮內(nèi)膜樣癌和正常子宮內(nèi)膜組織亦均有高度表達，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義，CtBP1蛋白不能作為結(jié)腸腺癌與子宮內(nèi)膜癌診斷和治療的潛在標志物[14-15]。本研究顯示：CtBP1在食管鱗狀細胞癌組織的表達低于癌旁正常鱗狀上皮的表達。對于這項指標的研究尚存在爭議，考慮產(chǎn)生這一結(jié)果有以下原因：由于免疫組織化學判定方法尚不統(tǒng)一，各位研究者均有自己的看法及觀點，故導致結(jié)果也不統(tǒng)一；尚存在某些其他仍不熟知的基因干擾了CtBP1的作用，或是尚有個別基因的功能目前醫(yī)學并不知曉，其影響了CtBP1的正常功能；目前對于CtBP1表達與食管癌的研究并不多，不同民族間CtBP1的表達研究幾乎沒有文獻可以查閱，本研究結(jié)果顯示在漢族與哈薩克族食管癌組織CtBP1的表達不存在民族差異，提示種族因素不能影響CtBP1的陽性表達；但是在哈薩克族食管癌組織的CtBP1陽性表達病例中，腫瘤直徑≥3 cm及腫物大體類型為潰瘍型所占比例高，本研究推測CtBP1對腫瘤的發(fā)展起著促進作用。

CtBP1與Cyclin D1參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的Wnt信號通路，當Wnt經(jīng)典通路被激活，wnt蛋白與細胞膜受體特異性結(jié)合，引起β-catenin由細胞膜向細胞質(zhì)甚至細胞核移動，使β-catenin在核內(nèi)累積無法降解，最終與TCF/LEF(T cell factor/lymphoid enhancer factor)結(jié)合，促使Wnt通路中的靶基因之一的致癌基因Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄和翻譯，pRb蛋白的磷酸化修飾提前實現(xiàn)，加速細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化，導致G1/S期調(diào)控紊亂，細胞周期轉(zhuǎn)換速度加快，細胞增殖失控，最終導致癌變。另一方面，當Wnt信號通路被激活后，CtBP1又能夠與TCF/LEF結(jié)合，抑制抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)多種抑癌基因；結(jié)合本研究關(guān)于CtBP1和Cyclin D1關(guān)系的結(jié)果，即兩者均陽性的病例數(shù)所占病例高，推測CtBP1可能在抑制抑癌基因轉(zhuǎn)錄的同時，還具有促進致癌基因轉(zhuǎn)錄的雙向作用，即CtBP1的上調(diào)可能可以促進Cyclin D1的上調(diào)，而CtBP1的表達缺失則可能抑制了原癌基因Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄，但是CtBP1和Cyclin D1的陽性表達與民族無關(guān)，目前并未見到關(guān)于CtBP1和Cyclin D1在食管癌中的表達的其他文獻，CtBP1和Cyclin D1之間到底是如何在細胞周期中發(fā)揮相互促進的機制尚不完全明了，有待今后進一步研究。

綜上所述，Cyclin D1、CtBP1可能在哈薩克族食管鱗狀細胞癌的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，CtBP1和Cyclin D1聯(lián)合檢測可能對哈薩克族與漢族食管鱗狀細胞癌的診治具有指導意義。

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(本文編輯周芳)

Expression and significance of CtBP1 and CyclinD1 in xinjiang kazak

and han esophageal squamous cell carcinoma

LI Mengyan1,2, WANG Hui1, MA Yuqing1

(1DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China;2DepartmentofPathology,ZhundongworkerHospitalofPetrochina

XinjiangOilfieldCompany,Fukang831511,China)

Abstract:ObjectiveTo compare the expression of CtBP1 and CyclinD1 in Kazak and Han′s esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) tissue, and analyzing the relationship between them with clinical pathological parameters. MethodsThe expression of CtBP1 and Cyclin D1 proteins in 125 cases of ESCC and 125 cases of normal squamous epithelial tissue were detected by immunohistochemistry using the streptaridin-peroxidase method. Results(1) The ESCC of the two groups were more common in middle and old aged people. (2) The positive expression rate of CyclinD1 in ESCC tissues was significantly higher than that in normal tissues (50.4% vs 20%, P<0.01). But the positive expression rate of CtBP1 in normal squamous epithelium was higher than that of ESCC (88% vs 66.4%, P<0.01). (3) The positive expression rate of CyclinD1 in Kazakh ESCC tissue is higher than that of Han (65% vs 36.9%, P<0.05). (4) In Kazak, the positive expression of CtBP1 had statistical differences between tumor sizes (P=0.037) and types (P=0.02); in Han, there were no correlations between CtBP1 expression and the ethnic, gender, age, depth of invasion, tumor differentiation degree and lymph node metastasis in ESCC (P>0.05). ConclusionThe expression of CtBP1 and CyclinD1 may play an important role in ESCC between Kazak and Han. The combining detection would be a guiding significance for the diagnosis and treatment of ESCC between Kazak and Han.

Keywords:esophageal squamous cell carcinoma; CtBP1; CyclinD1; immunohistochemistry

[收稿日期：2015-07-08]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.01.005

中圖分類號：R735

文獻標識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)01-0021-07