高亞可 杜姍姍

(1 南方醫(yī)科大學附屬深圳恒生醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，深圳市 518000，E-mail：gaoyake_2008@163.com；

論著·基礎研究

新建輔助生殖實驗室的鼠胚實驗報告

高亞可1杜姍姍2

(1 南方醫(yī)科大學附屬深圳恒生醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，深圳市 518000，E-mail：gaoyake_2008@163.com；

2 廣西大學動物繁殖研究所，南寧市 530000)

目的 探討用鼠胚實驗對新建輔助生殖實驗室的培養(yǎng)體系進行評估的可行性。方法 對昆明系小鼠進行體內、體外受精實驗，觀察常規(guī)培養(yǎng)條件下不同受精方式來源小鼠胚胎的發(fā)育情況以及不同培養(yǎng)環(huán)境對小鼠體外受精胚胎發(fā)育的影響，并計算受精率、卵裂率及囊胚率。結果 常規(guī)培養(yǎng)條件下，體內受精組的受精率和卵裂率均顯著高于體外受精組(P<0.05)，兩組囊胚率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在體外受精中，三氣培養(yǎng)組的卵裂率和囊胚率顯著高于兩氣培養(yǎng)箱組(P<0.05)，兩組受精率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 小鼠體內、體外受精獲得的受精卵均有較高的成胚率，鼠胚培養(yǎng)可對新建輔助生殖實驗室的培養(yǎng)體系進行評估。常規(guī)培養(yǎng)條件下體內受精胚胎的發(fā)育潛能優(yōu)于體外受精，而體外受精胚胎在三氣培養(yǎng)環(huán)境下的發(fā)育潛能優(yōu)于兩氣培養(yǎng)環(huán)境。

鼠胚實驗；體外受精；體內受精；兩氣培養(yǎng)；三氣培養(yǎng)；輔助生殖實驗室；小鼠

體外受精(in vitro fertilization，IVF)與胚胎移植是治療不孕不育的一項重要人類輔助生殖技術，體外受精實驗室是這一技術能夠有效開展的極為重要的部分，高效穩(wěn)定的實驗室環(huán)境對于胚胎的生長發(fā)育及IVF的成功率都起著至關重要的作用[1]。鼠胚實驗(mouse embryo assay，MEA)是目前最常用于IVF實驗室耗材、培養(yǎng)基和設備質量控制的生物學方法，適用于新建或新啟動周期的IVF實驗室的質量控制[2]。南方醫(yī)科大學附屬深圳恒生醫(yī)院生殖醫(yī)學中心IVF實驗室于2014年8月建成，經過前期的潔凈消毒和“熱處理”后[3]，中心從2015年2～4月，在新實驗室環(huán)境下對昆明小白鼠進行體內受精和體外受精實驗，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級昆明小白鼠及小鼠飼料購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2013-0002。雌鼠4～8周齡，體重20～40 g；雄鼠8～10周齡，體重40～50 g。實驗前對小鼠適應性喂養(yǎng)1周，喂養(yǎng)環(huán)境26℃恒溫，飲用水為桶裝純凈水。

1.2 藥品與試劑 孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG；批號：140913)、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG；批號：150209)購自寧波第二激素廠。透明質酸酶(批號：021772)、卵子-胚胎緩沖液(批號：505432)、受精處理液(批號：505382)、卵裂胚胎培養(yǎng)液(批號：505448)、囊胚培養(yǎng)液(批號：505395)、超純培養(yǎng)油(批號：500183)等采用瑞典Vitrolife G5 Series 序貫培養(yǎng)液。

1.3 耗材與設備 培養(yǎng)皿(批號：4054008)、離心管(批號：4085007)、移液管(批號：3309883)、玻璃巴氏德吸管(批號：24424)等一次性耗材為美國BD Falcon公司產品；氮氣(N2)純度為999.95%，CO2純度為99.999%；丹麥IVFTECH恒溫百級工作站(型號：Sterile180)，日本Astec CO2培養(yǎng)箱(型號：Astec APM-50D)，日本Olympus倒置顯微鏡(型號：Olympus 1X71)、體視顯微鏡(型號：Olympus SZX10)及相差顯微鏡(型號：Olympus CX41)，德國Eppendorf臺式低速離心機(型號：5702)等。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠超排卵和鼠卵的采集：于下午17時對每只雌鼠腹腔內注射PMSG 10 IU，48 h后腹腔內注射HCG 10 IU，次日上午8 ∶00采用頸椎脫臼法處死雌鼠。無菌工作臺內取出小鼠卵巢及輸卵管，于卵子-胚胎緩沖液中洗滌2遍，體視顯微鏡下用1 ml注射器輕輕劃破膨大的輸卵管壺腹部，讓卵子團自動逸出。

1.4.2 鼠精的采集和處理：采用頸椎脫臼法處死雄鼠，無菌工作臺內取出小鼠附睪及部分輸精管，于卵子-胚胎緩沖液中洗滌2遍，體視顯微鏡下用1 ml注射器從附睪尾部向前輕輕擠出輸精管中的精子(若精子數(shù)量不足，可用注射器刺破附睪獲取精子)，用巴氏吸管快速吸出精子懸液，將精子懸液緩慢加入裝有受精處理液的離心管底部，置于培養(yǎng)箱中上游處理60 min。

1.4.3 體外受精：收集獲能后的上層精子，相差顯微鏡下觀察精子活力及濃度，使用精子計數(shù)板對精子計數(shù)。取出受精皿，將精子懸液加入到放有卵子團的受精液滴中并調整精子濃度約為1×106/ml，完成受精過程。

1.4.4 體內受精：于下午17時將注射HCG后的雌鼠與雄鼠(1 ∶1)合籠，次日早晨觀察雌鼠陰道栓形成情況。將形成陰道栓的雌鼠頸椎脫臼處死，無菌工作臺內取出小鼠卵巢及輸卵管，在體視顯微鏡下取出合子團(方法同鼠卵采集)。

1.4.5 原核胚的發(fā)育觀察：在體外受精中，精卵孵育8 h后觀察原核胚的形成情況，統(tǒng)計受精率；對于體內受精，將收集的合子團置于透明質酸酶液滴(10倍稀釋后)中，輕輕吹打10～20 s以脫去卵丘顆粒細胞，觀察原核胚的形成情況，統(tǒng)計受精率。

1.4.6 卵裂期胚胎和囊胚的培養(yǎng)：將收集的原核胚洗滌后轉入卵裂胚胎培養(yǎng)液滴中，培養(yǎng)液滴體積為50 μl，可放入5～10(胚胎過多會導致胚胎營養(yǎng)不足)枚胚胎；第3天將胚胎轉入囊胚培養(yǎng)液滴中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 常規(guī)培養(yǎng)條件下不同來源小鼠受精卵發(fā)育情況的比較 常規(guī)兩氣培養(yǎng)條件下(37℃、6% CO2、飽和濕度)，小鼠體內受精實驗共進行了38個周期，獲卵1 283枚，受精1 189枚；小鼠體外受精實驗共進行了41個周期，獲卵1 331枚，受精1 152枚。體內受精組的受精率、卵裂率均顯著高于體外受精組(P<0.05)，兩組囊胚率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 常規(guī)培養(yǎng)條件下不同來源小鼠受精卵發(fā)育情況的比較

2.2 不同培養(yǎng)環(huán)境對小鼠體外受精胚胎發(fā)育情況的影響 三氣培養(yǎng)(37℃、6% CO2、5% O2、飽和濕度)條件下，小鼠體外受精共進行了45個周期，獲卵1 593枚，受精1 377枚。三氣培養(yǎng)組的小鼠卵裂率和囊胚率均顯著高于兩氣培養(yǎng)組(P<0.05)，兩組的受精率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同培養(yǎng)環(huán)境下小鼠體外受精胚胎發(fā)育情況的比較

2.3 小鼠體外受精胚胎的培養(yǎng)觀察 在體外受精過程中，小鼠卵子團在精子的作用下(圖1A)，外周卵丘顆粒細胞逐漸脫落。卵子正常受精后，受精卵內清晰可見雌、雄原核的形成(圖1B)。隨后受精卵進入卵裂期，可見2個對稱卵裂球，卵裂球大小均一、無碎片(圖1C)。受精后第2天胚胎進入4細胞期，可見4個卵裂球呈四面體對稱，大小均一、形態(tài)規(guī)則、無碎片(圖1D)。第3天胚胎進入8細胞期，可見8個大小均一的卵裂球，形態(tài)相對規(guī)則，無碎片(圖1E)。第4天后胚胎進入融合期，卵裂球互相融合，緊密聯(lián)系在一起，分不清單個卵裂球的界限(圖1F)，隨后胚胎進入早期囊胚階段，開始形成囊胚腔，囊胚腔的體積小于胚胎體積(圖1G)。第5天胚胎進入擴張囊胚階段，囊胚腔完全占據(jù)了胚胎的體積，胚胎總體積明顯變大，透明帶變薄，滋養(yǎng)層細胞結構致密，內細胞團細胞數(shù)目較多，排列緊密，隨后胚胎進入孵化囊胚階段，囊胚的一部分開始從透明帶中逸出(圖1H)。

A 小鼠精子和卵子團 B 小鼠受精卵 C 小鼠2細胞期胚胎

D 小鼠4細胞期胚胎 E 小鼠8細胞期胚胎 F 小鼠融合期胚胎

G 小鼠早期囊胚 H 小鼠孵化期囊胚

圖1 小鼠卵母細胞的體外受精及胚胎發(fā)育情況(×200)

3 討 論

盡管IVF的歷史已有30多年，但目前全世界仍缺乏建立IVF實驗室的統(tǒng)一標準[2]。MEA已經成為評估新建IVF實驗室環(huán)境條件和培養(yǎng)體系質量好壞的最為常用的質控方法，通過對不同階段胚胎發(fā)育情況的連續(xù)觀察，在反映胚胎發(fā)育潛能的同時，可以檢測培養(yǎng)室的環(huán)境條件，包括空氣質量、溫度、濕度及各種耗材、培養(yǎng)液、培養(yǎng)箱內環(huán)境和實驗人員的技術水平等[4]。在本實驗中，通過體內或體外受精方式獲得的小鼠受精胚胎，均能在兩氣或三氣培養(yǎng)環(huán)境中發(fā)育至囊胚階段，均保持了較高的卵裂率和囊胚率，且胚胎發(fā)育狀況良好，各項指標趨于穩(wěn)定，符合MEA的質控要求[5]，表明鼠胚培養(yǎng)可對新建輔助生殖實驗室的培養(yǎng)體系進行評估。

通過對常規(guī)培養(yǎng)條件下小鼠體內受精、體外受精胚胎發(fā)育情況的比較，我們發(fā)現(xiàn)體內受精組的受精率和卵裂率均顯著高于體外受精組(P<0.05)，這可能是由于受精前卵母細胞所處環(huán)境的不同對受精和胚胎早期發(fā)育過程產生了影響。在體內環(huán)境中，卵母細胞處于一個無光、恒溫、恒濕、低氧的環(huán)境中，母體內分泌、子宮及輸卵管會分泌一些物質促進受精的完成，而在體外環(huán)境中，卵母細胞不具備任何保護和屏障功能，可能暴露于含有害氣體的空氣中，面臨溫度、滲透壓、pH等變化的應激，降低了精卵結合的機會，使受精率下降[3]。在精子的選擇上，體內受精過程中精子從生殖道到達輸卵管，要經過嚴格的自然選擇，而體外受精則需要對精液人工處理，對精子的自然選擇是有限的，同時體外操作過程中也會增加氧自由基水平，使精子質膜的脂質發(fā)生過氧化反應，影響精子獲能和頂體反應的發(fā)生。此外，體外受精方式增加了配子和受精卵在體外培養(yǎng)的時間，卵子老化、過熟、氧化損傷和物理損傷增加，可能導致受精卵在細胞周期的轉化劑微管蛋白、紡錘體的形態(tài)上存在異常以及非整倍體增加，導致受精卵不卵裂[6]。

在不同培養(yǎng)環(huán)境的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)三氣培養(yǎng)環(huán)境與兩氣培養(yǎng)環(huán)境的受精率無顯著差異(P>0.05)，但三氣培養(yǎng)下的卵裂率和囊胚形成率顯著高于兩氣培養(yǎng)(P<0.05)，這一結果與Ciray等[7]的研究結果相似。這可能是由于三氣培養(yǎng)中O2的體積分數(shù)僅為5%，而在常規(guī)的兩氣培養(yǎng)中約為20%，前者更接近體內發(fā)育環(huán)境。Fischer等[8]的研究表明，多數(shù)哺乳動物輸卵管和子宮內的氧氣濃度體積分數(shù)僅為2%～8%，遠低于空氣中的氧氣濃度。Dumoulin等[9]在人類囊胚培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)對于8細胞期以前的胚胎，采用兩種O2濃度培養(yǎng)并無明顯差異，但在5% O2環(huán)境中，人類囊胚的形成率會顯著提高。這一結論與本實驗結果有所不同，這可能與不同物種胚胎各階段對培養(yǎng)環(huán)境的耐受性不同有關，此外也可能跟實驗樣本量有限有關，還有待進一步研究。Leoni等[10]的研究發(fā)現(xiàn)人卵子在20% O2的高氧條件下授精后，其囊胚的發(fā)育潛能會遭到破壞；過氧化物的產生可能會影響胚胎早期的代謝及基因表達，而這種損害可能在桑椹胚期或囊胚期明顯表現(xiàn)，最終影響囊胚形成[11]。高氧環(huán)境(20% O2)對胚胎體外發(fā)育的影響機制目前尚不明確，有學者認為，高氧環(huán)境可能會產生更多的活性氧，包括超氧陰離子、過氧化氫、羥基等導致胚胎 DNA 損傷、線粒體改變、脂質過氧化及蛋白氧化修飾等，從而影響胚胎的發(fā)育潛能[8]。

綜上所述，在常規(guī)培養(yǎng)條件下，小鼠體內、體外受精獲得的受精卵均有較高的成胚率，鼠胚培養(yǎng)可對新建輔助生殖實驗室的培養(yǎng)體系進行評估；體內受精后胚胎的發(fā)育潛能優(yōu)于體外受精，體外受精胚胎在三氣培養(yǎng)環(huán)境下的發(fā)育潛能優(yōu)于兩氣培養(yǎng)環(huán)境。

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A report on mouse embryo assay of new assisted reproductive laboratory

GAOYa-ke,DUShan-shan

(1ReproductiveMedicineCenter,ShenzhenHengshengHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Shenzhen518000,China; 2ResearchInstituteofAnimalReproduction,GuangxiUniversity,Nanning530000,China)

Objective To explore the feasibility of mouse embryo assay applied to the assessment of culture system in the new assisted reproductive laboratory.Methods Kunming mice were selected and used for in vivo and in vitro fertilized experiments.The development of mouse embryos achieved from different fertilization modes on routine cultural conditions was observed.And the effect of different cultural conditions on the fertilized mouse embryos in vitro was also assessed.Then the fertilization rate,cleavage rate and blastocyst rate were calculated.Results On the routine cultural condition,the fertilization rate and cleavage rate of in vivo fertilization group were significantly higher than those of in vitro fertilization group(P<0.05),and there was no statistical difference in the blastocyst rate between two groups(P>0.05).In in vitro fertilization,the cleavage rate and blastocyst rate of tri-gas culture group were significantly higher than those of two-gas culture group(P<0.05),and there was no statistical difference in the fertilization rate between two groups(P>0.05).Conclusion The mouse oosperm of in vivo or vitro fertilization can obtain quite high live embryo rate,and the mouse embryo culture can be used to evaluate the culture system in the new assisted reproductive laboratory.On the routine cultural condition,the potential of development of in vivo fertilization-embryo is superior to that of in vitro fertilization-embryo.And the potential of development of in vivo fertilization-embryo on the tri-gas culture condition is superior to that on two-gas culture condition.

Mouse embryo assay,In vitro fertilization,In vivo fertilization,Two-gas culture,Tri-gas culture,Assisted reproductive laboratory,Mouse

高亞可(1987～)，男，碩士，助理研究員，研究方向：生殖胚胎學。

R-322

A

0253-4304(2016)03-0304-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.03.03

201512-12

2015-02-25)