王星星 江 莉 毛文琪 張季陽 翟丹梅 杭 馥 陸 丹

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖中心，南寧市 530021，E-mail：415050178@qq.com)

不同胚胎冷凍方法對人類早期胚胎解凍后的復蘇效果及臨床結局的影響▲

王星星 江 莉 毛文琪 張季陽 翟丹梅 杭 馥 陸 丹

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖中心，南寧市 530021，E-mail：415050178@qq.com)

目的 比較玻璃化冷凍與程序化冷凍對人類早期胚胎解凍后復蘇效果及臨床結局的影響。方法 輔助生殖技術獲取的剩余可利用人類胚胎2 884枚，其中采用玻璃化冷凍復蘇666個周期，解凍胚胎1 516枚、復蘇1 383枚、移植胚胎1 375枚；程序化冷凍復蘇506個周期，解凍胚胎1 368枚、復蘇1 090枚、移植1 077枚。比較兩種方法的復蘇效果及臨床結局。結果 玻璃化冷凍組胚胎復蘇率、胚胎完整率分別為92.02%、92.11%，高于程序化冷凍組的79.68%、69.63%(P<0.05)；兩組種植率、臨床妊娠率、周期取消率、多胎妊娠率、早期流產率、新生兒胎齡、早產率、新生兒出生體重、出生缺陷率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 玻璃化冷凍較程序化冷凍有更高的胚胎復蘇率及胚胎完整率，胚胎利用率高，兩種冷凍方法的臨床結局相似，適用于人類胚胎的冷凍。

胚胎冷凍；玻璃化冷凍；程序化冷凍；胚胎移植；妊娠結局；復蘇

在人類輔助生殖技術中，胚胎冷凍技術旨在經過冷凍和復蘇后，胚胎仍能保持原有的生物學活性。胚胎冷凍技術提高了每一卵巢刺激周期累積妊娠率，減少多胎妊娠率，預防卵巢過度刺激綜合征。目前臨床上常用的胚胎冷凍技術有程序化冷凍及玻璃化冷凍。程序化冷凍臨床應用時間長，對設備要求嚴格，需要較長操作時間。玻璃化冷凍法具有操作簡單、節(jié)省時間、避免冰晶損傷細胞等優(yōu)勢，而該技術在人類胚胎應用時間較短，隨訪數(shù)據較少。本研究回顧性分析我院中心實施胚胎冷凍復蘇的患者的臨床資料，比較程序化冷凍與玻璃化冷凍對胚胎的冷凍復蘇效果、臨床結局及新生兒情況的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年1～12月在我院生殖中心實施冷凍胚胎復蘇患者的臨床資料，共1 172例患者在我中心采用常規(guī)方法進行促排卵、取卵，將所取得的卵子進行體外受精(in vitro fertilization，IVF)或卵母細胞胞質內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，常規(guī)培養(yǎng)觀察，根據臨床需要選擇胚胎移植，移植胚胎數(shù)≤3枚。將剩余可利用的胚胎共2 884枚進行程序化冷凍或玻璃化冷凍保存，或經囊胚培養(yǎng)后行玻璃化冷凍保存。排除宮腔形態(tài)異常、子宮內膜異位癥、子宮肌瘤、多囊卵巢綜合征患者及其可能影響胚胎著床的因素。

1.2 方法

1.2.1 胚胎冷凍及復蘇方法：(1)程序化冷凍：采用Quinn′s試劑盒(美國)，使用Planner程序冷凍儀進行冷凍，按文獻[1]中的程序化冷凍方法進行操作：將胚胎依次轉入由磷酸鹽緩沖液、丙二醇及蔗糖組成的冷凍保護劑(F1液、F2液、F3液)，其中置入F1液、F2液中各10 min，后轉入F3液，裝入麥管，將麥管置于程序冷凍儀依設定程序逐步降溫和人工植冰，于-130℃轉入液氮罐。復蘇方法：從液氮罐中取出麥管，室溫40 s，然后迅速放至30℃水浴中20 s，剪去麥管底部，將胚胎推注于由磷酸鹽緩沖液、丙二醇及蔗糖組成的解凍液(T1液、T2液、T3液、T4液)中，先于T1液中5 min，再依次移入T2液、T3液中各5 min，最后移入T4液5～10 min，最后移入過夜平衡的培養(yǎng)液(美國)中。(2)玻璃化冷凍：采用Medicult玻璃化冷凍試劑盒行玻璃化冷凍。由二甲基亞砜、乙二醇和蔗糖組成冷凍保護劑(包括BS液、ES液、VS液)，將胚胎依次移入BS液、ES液、VS液，分別停留1 min、6 min、30 s，最后將胚胎用冷凍載桿裝載，直接投入液氮凍存。復蘇方法：將冷凍載桿從液氮中取出后迅速插入由二甲基亞砜、乙二醇和蔗糖組成的解凍液(V1液、V2液、V3液、V4液)中，先置于V1液中，37℃溫臺上保持1 min，待冷凍小球融化后，依次移入V2液、V3液中，在室溫下保持各3 min，再移入V4液中室溫保持 3 min，充分洗滌胚胎后在37℃溫臺保持3 min，最后移入過夜平衡的培養(yǎng)液(SAGE，美國)中。囊胚期胚胎冷凍前采用激光皺縮處理，應用激光穿透透明帶，釋放囊內液以皺縮囊胚，應遠離內細胞團。

1.2.2 胚胎分級及胚胎復蘇標準：IVF或ICSI后16～18 h起連續(xù)評估原核評分、早期卵裂、卵裂期胚胎評分，獲卵后第3天進行胚胎分級。胚胎碎片分級[2]：Ⅰ級為胚胎無碎片；Ⅱ級為胚胎碎片<20%；Ⅲ級為胚胎碎片在20%～50%；Ⅳ級為胚胎碎片>50%。囊胚期胚胎分級按人類囊胚分級系統(tǒng)(Gardner法)評分[3]。以解凍后胚胎復蘇的卵裂球細胞數(shù)≥50%總細胞數(shù)作為胚胎復蘇的標準。胚胎完整率=復蘇后卵裂球完整存活的胚胎數(shù)/存活胚胎數(shù)×100%。

1.2.3 移植子宮內膜準備方案：按照患者有無規(guī)律月經周期選擇子宮內膜準備方案。月經周期規(guī)律、排卵正常者采用自然周期；月經不規(guī)則和(或)無自發(fā)排卵者采用人工周期。

1.2.4 胚胎移植方法：患者仰臥位，消毒外陰，鋪巾，使用窺器暴露宮頸，棉簽清除宮頸黏液，在B超引導下將胚胎經由胚胎移植管緩慢注入宮腔距宮底1～2 cm處，緩慢退出移植管并在顯微鏡下觀察是否有胚胎漏出及宮腔出血。移植后繼續(xù)肌注黃體酮行黃體支持。

1.2.5 移植后管理及隨訪：移植14 d后檢測血絨毛膜促性激素，了解是否妊娠，未妊娠則停止黃體支持，如為生化妊娠繼續(xù)黃體支持。移植后4周行B超檢查，見宮內妊娠囊為臨床妊娠。所有孕婦于孕中期、分娩時、分娩后1～2個月進行隨訪，隨訪內容包括：孕產期并發(fā)癥、新生兒胎齡、性別、出生體重及出生缺陷等。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，計量資料以(x±s)表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 患者臨床資料及妊娠結局 總共收集凍融胚胎移植1 172個周期。其中玻璃化冷凍復蘇666個周期，解凍胚胎1 516枚、復蘇1 383枚、移植胚胎1 375枚；程序化冷凍復蘇506個周期，解凍胚胎1 368枚、復蘇1 090枚、移植1 077枚。兩組的患者年齡、移植日子宮內膜厚度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。玻璃化冷凍組胚胎復蘇率、胚胎完整率高于程序化冷凍組，移植胚胎數(shù)少于程序化冷凍組(P<0.01)，兩組種植率、臨床妊娠率、多胎妊娠率、早期流產率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。3胎妊娠共有3例，3例均行減胎術；其中程序化冷凍組2例，玻璃化冷凍組有1例雙胎妊娠，孕早期B超顯示有其中一胎兒腦膨出畸形行減胎術，另一胎兒分娩后未見出生缺陷。

表1 兩組的臨床資料、胚胎發(fā)育及其臨床結局

2.2 玻璃化冷凍卵裂期胚胎及囊胚期胚胎妊娠結局的比較 玻璃化凍融移植的658個周期中，卵裂期胚胎周期606個，囊胚期胚胎周期52個。囊胚期的胚胎復蘇率、胚胎種植率、臨床妊娠率均高于卵裂期(P<0.05)，見表2。囊胚期組新生兒未見有出生缺陷。

表2 玻璃化冷凍人囊胚期和卵裂期胚胎的發(fā)育情況及臨床結局(x±s)

2.3 兩種冷凍方法的新生兒情況 玻璃化冷凍組分娩新生兒175人，程序化冷凍組分娩新生兒139人，程序化冷凍組中1例新生兒因“膈疝”搶救無效死亡。玻璃化冷凍出現(xiàn)1例先天性心臟病合并Ⅰ°唇裂、足外翻；程序化冷凍出現(xiàn)胎兒腦積水合并側腦室增寬1例，新生兒膈疝1例；兩組新生兒胎齡、出生體重、早產率、出生缺陷率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 新生兒情況(x±s)

注：*Fisher確切概率法。

3 討 論

隨著人類輔助生殖技術的發(fā)展，人類胚胎冷凍保存技術成為其中一個重要組成部分。該技術最大意義是提高了每一卵巢刺激周期累積妊娠率，將剩余胚胎或周期不適宜移植的胚胎凍存，提高了胚胎利用率，以便于根據患者實際情況選擇合適移植時機。玻璃化冷凍法的胚胎復蘇率比程序化冷凍高，操作靈活度高、耗時短，不嚴格依賴于昂貴的程序化冷凍儀，目前在大多數(shù)中心均以玻璃化冷凍為主。但各中心關于玻璃化冷凍對胚胎發(fā)育及妊娠結局影響的結論不盡相同。

Sifer[4]的研究結果顯示，玻璃化冷凍法組的復蘇率、臨床妊娠率均顯著高于程序化冷凍組，且玻璃化凍融囊胚完整胚胎存活率顯著高于程序化冷凍組(P<0.05)。另有研究表明玻璃化冷凍組胚胎復蘇率、種植率、臨床妊娠率均顯著高于程序化冷凍組(P<0.05)[5-6]。也有研究顯示玻璃化冷凍D3卵裂期胚胎能顯著提高胚胎存活率，但不能顯著改善臨床妊娠率和胚胎種植率[7-8]。Zhu等[9]的大樣本量回顧性分析結果與上述結果相似，且兩組的流產率、活產率、新生兒體重無差異。本研究結果也顯示，玻璃化冷凍組種植率、臨床妊娠率與程序化冷凍組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，兩組的早期流產率、新生兒出生體重比較，差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。胚胎冷凍復蘇過程中產生的冰晶是最重要的冷凍損傷，冰晶對細胞的機械性損傷會對細胞造成致命性損傷甚至死亡。而玻璃化是液態(tài)物質在一定的降溫速率下由液相直接轉變?yōu)椴Ａ罟虘B(tài)的過程，內部沒有晶體結構，因而避免了冷凍過程中冰晶對胚胎的損傷，這也是本研究中玻璃化冷凍組胚胎復蘇率及胚胎完整率顯著高于程序化冷凍組的原因之一。玻璃化冷凍過程中胚胎接觸了更高濃度的冷凍保護劑，安全性受到質疑。但本研究中兩組新生兒胎齡、早產率、新生兒出生體重、出生缺陷率均無差異；其中玻璃化冷凍組的出生缺陷率為0.57%，低于自然妊娠人群的1.3%[10]。

近年來玻璃化冷凍方法提高了囊胚冷凍的復蘇率。本研究中玻璃化冷凍法囊胚期胚胎的復蘇率、種植率、臨床妊娠率均顯著高于卵裂期胚胎(P<0.05)，與趙芳等[11]的研究結果相似。Adler等[12]報告囊胚期胚胎的整倍體率高于卵裂期胚胎。囊胚培養(yǎng)的篩選作用淘汰了發(fā)育能力異常的胚胎，移植時其內膜與胚胎發(fā)育更為同步，而且囊胚細胞數(shù)目多，損傷后細胞修復能力強，少數(shù)細胞死亡對胚胎發(fā)育能力影響小。

綜上所述，玻璃化冷凍方法較程序化冷凍方法可獲得更高的胚胎復蘇率及胚胎完整率，移植胚胎少，胚胎利用率高，能夠取得同樣的臨床結局，適用于人類胚胎的冷凍。玻璃化冷凍囊胚期胚胎較卵裂期胚胎有更好的胚胎復蘇率及臨床結局。但玻璃化冷凍應用于臨床時間較短，尚需對出生后嬰幼兒進行長期隨訪，評估其安全性。

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Eefects of different embryo cryopreservation technologies on recovery efficacy and clinical outcome of human early embryos after unfreezing

WANGXing-xing,JIANGLi,MAOWen-qi,ZHANGJi-yang,ZHAIDan-mei,HANGFu,LUDan

(ReproductiveCenter,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To compare the effects between vitrification and programmable freezing on recovery efficacy and clinical outcome of human early embryos after unfreezing.Methods A total of residual and available 2 884 embryos were obtained using assisted reproductive technology.In 666 vitrification cycles,unfreezing was conducted in 1 516 embryos,recovery in 1 383 embryos,and embryo transplantation in 1 375 embryos.In 506 programmable freezing cycles,unfreezing was conducted in 1 368 embryos,recovery in 1 090 embryos,and embryo transplantation in 1 077 embryos.The recovery efficacy and clinical outcome were compared between the two technologies.Results The embryo recovery rate(92.02%) and embryo integrity rate(92.11%) in the vitrification group were higher than those in the programmable freezing group(79.68% and 69.63% respectively)(P<0.05).There were no statistical differences in the implanted rate,clinical pregnancy rate,cycle cancellation rate,multiple pregnancy rate,early abortion rate,neonatal gestational age,preterm birth rate,neonatal weight at birth or birth defects rate between the two groups(P>0.05).Conclusion Compared to programmable freezing,vitrification can obtain higher embryo recovery rate,embryo integrity rate and utilization rate for embryo.The clinical outcomes of both technologies are similar,and can be applied to human embryo cryopreservation. 【Key words】 Embryo cryopreservation,Vitrification,Programmable freezing,Embryo transplantation,Clinical outcome,Recovery

廣西自然科學基金(2013GXNSFAA019140)

王星星(1989～)，女，在讀碩士研究生，研究方向：生殖醫(yī)學基礎與臨床研究。

江莉(1972～)，女，博士，教授，研究方向：生殖醫(yī)學基礎與臨床研究，E-mail：jiangligx2013@163.com。

R 711.6

A

0253-4304(2016)02-0175-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.08

2015-11-18

2016-01-25)