李學淵 張 揚 田 文 孫英賢 張光偉 姜大慶

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，1 心內(nèi)科，沈陽市 110001，E-mail：llxxyy2002@sohu.com；2 沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院手外科，沈陽市 110000；中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，3 干診科，4 心外科，沈陽市 110001)

大鼠心肌干細胞體外分離培養(yǎng)的方法研究▲

李學淵1張 揚2田 文3孫英賢1張光偉4姜大慶4

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，1 心內(nèi)科，沈陽市 110001，E-mail：llxxyy2002@sohu.com；2 沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院手外科，沈陽市 110000；中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，3 干診科，4 心外科，沈陽市 110001)

目的 對比不同溫度下采用纖維黏連蛋白(FN)包被分離培養(yǎng)大鼠心肌干細胞(CSC)的效果，以篩選體外大鼠心肌干細胞的最佳分離培養(yǎng)方法。方法 選取健康新生Wistar大鼠，在無菌條件下取出心臟，分別經(jīng)胰酶和Ⅱ型膠原酶反復消化后于FN包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，將第3代CSC進行免疫組化細胞表面抗原鑒定。將在37℃及室溫(22℃～25℃)下用FN包被培養(yǎng)的原代細胞分別設為A組及B組，在37℃及室溫(22℃～25℃)下用FN包被培養(yǎng)的CSC分別設為C組及D組，比較A組與B組、C組與D組的細胞貼壁時間、首次傳代時間及細胞倍增水平。結(jié)果 從新生大鼠心肌組織內(nèi)成功分離培養(yǎng)出CSC，細胞表面抗原c-kit陽性率為83%。A組及C組的貼壁時間、首次傳代時間分別均短于B組、D組(P<0.05)。細胞倍增水平呈C組>A組>D組>B組。結(jié)論 應用37℃FN包被培養(yǎng)瓶的方法分離培養(yǎng)原代大鼠心肌干細胞效果更優(yōu)。

心肌干細胞；細胞分離；細胞培養(yǎng)；大鼠

既往認為心肌細胞不可再生，但已有研究證明在心肌組織內(nèi)存在一種可再生的細胞——心肌干細胞(cardiac stem cell，CSC)[1-3]。CSC分有多種亞群，其中表面抗原c-kit陽性細胞是CSC亞群中研究最為廣泛的一種細胞[4]。CSC具有干細胞的特性，包括自身再生能力、分化能力等[3]。有學者通過使用多種干細胞治療缺血心臟病，發(fā)現(xiàn)與骨髓間充質(zhì)干細胞及骨髓單個核細胞比較，CSC改善心功能的效果最為顯著[5-6]。雖然已從心肌組織中成功分離出CSC，但由于CSC數(shù)量少，應用磁珠分選培養(yǎng)價格昂貴且影響細胞存活率，目前還沒有一種統(tǒng)一高效的培養(yǎng)方法。本研究比較了不同條件下采用纖維黏連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)包被的培養(yǎng)瓶分離培養(yǎng)大鼠CSC的效果，旨在優(yōu)化實驗過程中的一些條件，為進一步研究CSC的生物活性和臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康新生Wistar大鼠10只，日齡1～2 d，雌雄不限，體重6～8 g，購自中國醫(yī)科大學動物部，使用許可證號：SYXK(遼)2013-0007，處死前與母鼠共同飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器 VT-840K-U型潔凈工作臺(中國蘇州安泰空氣技術有限公司)，HERA Cell 150型CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，ST-21型臺式離心機(美國Sorvall公司)，25 cm2細胞培養(yǎng)瓶(Biofil)，AX70型倒置光學顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)，依斯考夫改進的杜爾貝科培養(yǎng)基(Iscoves modified Dulbecco medium，IMDM，Hyclone公司)，胎牛血清(ExCell公司)，L-谷氨酰胺(Gibco公司)，多聚D賴氨酸(poly-D-lysine，PDL；Sigma公司)，F(xiàn)N(武漢博士德)，青鏈霉素混合液100×(Solarbio公司)，75%酒精(美華)，免疫組化試劑盒(博士德生物，SA1052)，c-kit一抗(武漢博士德，BA0467-1)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS，Hyclone公司)，胰酶(Solarbio公司)，4%多聚甲醛(國藥集團)，Ⅱ型膠原酶(Gibco公司)。

1.3 CSC提取 新生1～2 d的小鼠斷頸處死后置于75%酒精內(nèi)約30 s，消毒后用無菌紗塊捏住乳鼠背部以固定乳鼠，眼科剪剪開心前區(qū)胸壁，取出整個心臟置于預先加有PBS的培養(yǎng)皿中，再將大鼠心臟移入超凈臺中預先放入PBS的無菌培養(yǎng)皿中，予杜氏磷酸緩沖鹽液(Dulbecco′s phosphate buffered saline，DPBS)洗去血污后剪成約0.5～1 mm3的組織塊，切除心耳組織周圍的結(jié)締組織、脂肪組織及纖維組織。再次用滴管吸取2～3 ml DPBS反復沖洗至洗滌液澄清，棄去洗滌液。加入1～2 ml 0.25% 胰酶(不含乙二胺四乙酸)，以蓋住所有組織塊為宜，室溫消化5 min，消化期間，繼續(xù)將組織塊剪碎至大小約0.5 mm3的組織塊，吸棄消化液。再用1～2 ml 0.1% Ⅱ型膠原酶室溫消化5 min，吸棄消化液。胰酶和 Ⅱ 型膠原酶交替消化3次，消化完畢后加入1～2 ml完全移植物培養(yǎng)液(complete explants medium，CEM；成分：IMDM，20%胎牛血清，100 U/ml青霉素G，100 g/ml鏈霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺)終止消化。將培養(yǎng)皿中的組織塊用CEM重懸后平鋪到預先用FN(4 μg/ml)包被的培養(yǎng)瓶中，24 h后換液，將吸出的原瓶中的培養(yǎng)基平鋪到另一預先用纖維FN包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。當細胞生長到80%融合時采集心肌球形成細胞。細胞生長至80%融合時傳代至預先用PDL(40 μg/ml)包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，應用心肌球生長培養(yǎng)基(cardiosphere-growing medium，CGM；成分：IMDM，10%胎牛血清，100 U/ml青霉素G，100 g/ml鏈霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺)培養(yǎng)。3～4 d換液1次。觀察有心肌球形成時輕輕吹打，使心肌球脫離下來，收集培養(yǎng)液于15 ml離心管中，4℃，800 r/min離心5 min，CEM重懸心肌球源性細胞(cardiosphere-derived cells，CDCs)，平鋪于FN包被的培養(yǎng)瓶中，每2～3 d換液1次。

1.4 CSC表面抗原鑒定 分別取原代細胞和CDCs行免疫組化細胞表面抗原c-kit鑒定。細胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min，3%冰乙酸室溫浸泡20 min，以滅活內(nèi)源酶，蒸餾水洗1～2次。滴加5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉液，室溫封閉20 min，甩去多余液體，不洗。滴加1 ∶100稀釋后的c-kit一抗，4℃過夜。PBS洗3次，每次2 min。滴加二抗IgG，37℃孵育20 min后，PBS洗3次，每次2 min。滴加堿性磷酸酶標記鏈酶親和素，37℃孵育20 min，PBS洗4次，每次5 min，再水洗1次。用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/硝基藍四氮唑1 ∶20稀釋后顯色120 min，蒸餾水清洗。用核固紅輕度復染核，水洗，干燥后顯微鏡觀察。

1.5 細胞分組 (1)原代提取細胞按隨機數(shù)字表法分為A組和B組，每組5瓶細胞(25 ml塑料培養(yǎng)瓶)，A組細胞培養(yǎng)瓶在細胞培養(yǎng)前預先于37℃ FN包被2 h，B組細胞培養(yǎng)瓶預先于室溫(22℃～25℃)FN包被2 h，比較各組細胞貼壁時間、首次傳代時間及細胞倍增水平。(2)將所獲得的CDCs細胞按隨機數(shù)字表法分為C和D組，每組5瓶細胞(25 cm2塑料培養(yǎng)瓶)，C組細胞培養(yǎng)瓶在細胞培養(yǎng)前預先于37℃ FN包被2 h，D組細胞培養(yǎng)瓶預先于室溫(22℃～25℃)FN包被2 h，比較各組細胞貼壁時間、首次傳代時間以及細胞倍增水平。每天鏡下計數(shù)細胞，細胞倍增水平=總細胞數(shù)/種植細胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，計量資料以(x±s)表示，采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 CSC生長情況 (1)心肌組織塊植入培養(yǎng)瓶后，1～3 d 細胞貼壁生長，并可見細胞自心肌組織塊邊緣爬出，呈同心圓向周圍生長。亦可見成簇細胞團和細胞規(guī)律搏動；2～3周后長滿培養(yǎng)瓶，可行傳代培養(yǎng)，見圖1。(2)傳代后細胞成簇貼壁生長，7～10 d后，有成簇的細胞成球形漂浮在培養(yǎng)基中，心肌球形成后可將其種于FN包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，見圖2。(3)提取的心肌球細胞貼壁生長(見圖3)，隨著細胞數(shù)增多，細胞呈同心圓并成簇生長，待細胞達到78%～80%融合時即可傳代培養(yǎng)。

2.2 CSC鑒定情況 獲得的CSC行細胞表面抗原免疫組化鑒定，c-kit陽性率83%，并見搏動細胞，見圖4。

圖1 倒置顯微鏡下原代細胞培養(yǎng)情況(×10)圖2 倒置顯微鏡下觀察心肌球形成(×10)圖3 倒置顯微鏡下心肌球源性細胞貼壁生長情況(×10)圖4 CSC表面抗原c?kit鑒定(細胞免疫化學染色，×10)

2.3 各組細胞貼壁時間、首次傳代時間及細胞倍增水平的比較 (1)在原代培養(yǎng)時應用不同的FN包被方法，A組的細胞貼壁時間為(1.4±0.5)d，短于B組的(2.0±0.7)d，但差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.500，P=0.172)；A組的傳代時間為(7.8±0.8)d，短于B組的(11.6±1.1)d(t=-6.008，P<0.001)。提示應用在37℃環(huán)境溫度下FN包被的培養(yǎng)瓶行原代細胞培養(yǎng)，細胞貼壁速度及增殖速度都明顯增快。(2)CDCs重懸培養(yǎng)時應用不同條件下FN包被的培養(yǎng)瓶，C組的細胞貼壁時間為(1.2±0.4)d，短于D組的(2.2±0.4)d，(t=-3.536 ，P<0.001)； C組的傳代時間為(6.8±0.8)d，短于B組的(9.4±1.1)d(t=-4.111，P=0.003)。提示應用37℃環(huán)境溫度下FN包被的培養(yǎng)瓶行CDCs重懸后細胞培養(yǎng)，細胞貼壁速度及增殖速度亦都明顯增快。

2.4 各組細胞倍增水平 細胞倍增水平呈C組>A組>D組>B組，見圖5。

圖5 各組細胞間細胞倍增水平比較

3 討 論

CSC是從心肌組織中分離提取的一種具有再生功能的干細胞，它的發(fā)現(xiàn)改變了“心肌細胞不可再生”的定論。但在人的一生中再生的心肌細胞數(shù)量極少，年輕人每年更新的心肌細胞數(shù)為1%，老年人為每年0.45%[7]，這可能與CSC的生存環(huán)境相關，對CSC進行深入研究并促進其遷移和再生對心臟疾病有著重大的意義。但由于CSC數(shù)量極少，而且生存于心肌組織內(nèi)的干細胞巢內(nèi)，分離培養(yǎng)原代CSC仍是一個難題。既往的實驗方法耗時耗力、造價昂貴，本研究旨在應用更簡潔更經(jīng)濟的方法分離培養(yǎng)CSC，為今后的實驗做基礎。

FN是高相對分子質(zhì)量的黏附性的糖蛋白，含糖約5%，以二聚體或多聚體的形態(tài)存在。每個FN亞基上有與膠原、細胞表面受體、血纖蛋白和硫酸蛋白多糖高親和結(jié)合的位點。FN具有多種生物學功能，其中一項是促進細胞的粘連生長，而細胞的粘連是細胞生長完成的必要條件。因此，F(xiàn)N是細胞培養(yǎng)時需要的重要試劑之一。有研究表明CSC的存活以及生物學功能與FN密切相關[8-13]。FN一級氨基酸序列的特點是高度保守性，含有大量重復序列，不同F(xiàn)N之間差異主要集中在3個可變區(qū)域。其中每個重復結(jié)構可能都是一個功能單位，重復序列包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。FN的一個重要功能區(qū)細胞結(jié)合區(qū)主要由Ⅲ型序列組成。已有研究證明FN的部分區(qū)域為溫度敏感區(qū)，亦說明FN的變構與溫度相關[14-16]。本研究通過改變FN孵育時的溫度以增加CSC的貼壁率，從而提高培養(yǎng)效果。結(jié)果顯示，應用在37℃環(huán)境溫度下FN包被的培養(yǎng)瓶行原代細胞培養(yǎng)(A組)及CDCs重懸后細胞培養(yǎng)(C組)，細胞貼壁速度及增殖速度都明顯增快(P<0.05)；此外，細胞倍增水平呈C組>A組>D組>B組，相同培養(yǎng)天數(shù)時的細胞倍增水平能夠反映細胞的生長速度，細胞傳代時間越短或(和)細胞倍增水平越大則細胞生長速度越快。這表明37℃孵育后的FN能顯著促進CSC貼壁，其可能機制之一為37℃下FN構型使得其細胞結(jié)合區(qū)多肽更易于與細胞結(jié)合以促進細胞粘連貼壁生長。其次，免疫反應以及抗原抗體之間的結(jié)合受到溫度，時間等因素的影響。在一定范圍內(nèi)，溫度升高可加速分子運動，抗原與抗體碰撞機會增多，使反應加速。而37℃往往為抗原抗體作用的最適宜溫度。因此本研究結(jié)果亦可能與37℃時FN與細胞結(jié)合增加有關。其具體機制還需要進一步實驗以證明。

目前，磁珠分選的方法是一種比較常用的CSC分離培養(yǎng)的方法，但這種方法昂貴且所得細胞數(shù)少細胞質(zhì)量不高，本研究中應用細胞貼壁傳代及心肌球提取方法獲得了大量較純的CSC，證明本研究應用的實驗方法簡單易行價格經(jīng)濟效果優(yōu)良，可為廣大研究者采用。

CSC提取方法較其他原代細胞提取方法復雜，影響因素多，因此優(yōu)化實驗方法對實驗結(jié)果意義顯著，除了本研究中改變FN孵育的溫度條件外，改變CSC的分離方法，摸索更適宜的培養(yǎng)基配方等都不失為一種可選擇的方法，但其有效性和可行性還需進一步實驗以證明。

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Study on method for isolation and culture of rat cardiac stem cell in vitro

LIXue-yuan1,ZHANGYang2,TIANWen3,SUNYing-xian1,ZHANGGuang-wei4,JIANGDa-qing4

(1DepartmentofCardiology,theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China;2DepartmentofHandSurgery,AffiliatedCentralHospitalofShenyangMedicalCollege,Shenyang110000,China;3DepartmentofCadresDiagnosisandTreatment;4DepartmentOfCardiacSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

Objective To compare the efficacies of fibronectin(FN) under different temperatures on isolation and culture of rat cardiac stem cell(CSC),thereby to screen the optimum method for isolation and culture of rat CSC in vitro.Methods The hearts of healthy newborn Wistar rats were removed under aseptic condition.And the heart tissues were digested by trypsin and collagenase Ⅱ separately and repeatedly,and then were cultured in cell culture flasks coated by FN.Cell surface antigen identification was performed in the CSCs of the third generation by immunohistochemistry.The primary cells cultured by FN coating under 37℃ and room temperature(22℃-25℃) were taken as Group A and Group B respectively.The CSCs cultured by FN coating under 37℃ and room temperature(22℃-25℃) were taken as Group C and Group D respectively.The time for cellular adherence,the first generation time and cellular multiplication level were compared between Group A and Group B,as well as Group C and Group D.Results CSCs were separated from heart tissues of newborn rats successfully,and the positive rate of cell surface antigen c-kit was 83%.The time for cellular adherence and the first generation time in Group A were shorted than those in Group B,and the times in Group C were also shorter than those in Group D(P<0.05).The cellular multiplication levels decreased in the order of Group C,Group A,Group D and Group B.Conclusion The efficacy of culture flasks coated by FN under 37℃ is superior in the isolation and culture of rat CSCs. 【Key words】 Cardiac stem cell,Cell isolation,Cell culture,Rat

遼寧省教育廳科技一般項目(L2013316)；中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院科研資助(fsfh1311)

李學淵(1980～)，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：冠心病的干細胞治療。

R 331

A

0253-4304(2016)02-0160-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.04

2015-09-11

2015-12-31)