劉珊珊 袁玉林

(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢市 430071，E-mail：liushanshan0729@sina.com)

蜂毒明肽對(duì)重癥急性胰腺炎合并腎損傷大鼠腎功能的保護(hù)作用

劉珊珊 袁玉林

(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢市 430071，E-mail：liushanshan0729@sina.com)

目的 探討蜂毒明肽對(duì)重癥急性胰腺炎(SAP)合并腎損傷大鼠腎功能的影響。方法 將32只SD大鼠分為假手術(shù)組(SO組)、SAP組、蜂毒明肽組(Apamin組)、溶劑對(duì)照組(DMSO組)各8只。采用膽胰管逆行注射牛黃膽酸鈉構(gòu)建重癥急性胰腺炎大鼠模型，其中并對(duì)Apamin組大鼠應(yīng)用蜂毒明肽進(jìn)行干預(yù)，測(cè)定術(shù)后12 h各組大鼠的血清淀粉酶，脂肪酶及血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)及白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平，并觀察大鼠胰腺及腎臟病理改變。結(jié)果 Apamin組及SAP組的淀粉酶、Scr、BUN、TNF-α、IL-1、IL-6水平以及胰腺及腎臟病理評(píng)分均高于SO組(P<0.05)，Apamin組的以上指標(biāo)均低于SAP(P<0.05)。結(jié)論 蜂毒明肽能夠減輕SAP所致的炎癥反應(yīng)進(jìn)而緩解其引發(fā)的腎損傷。

重癥急性胰腺炎；蜂毒明肽；腎損傷；腎功能；淀粉酶；脂肪酶；大鼠

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的急腹癥之一，其病情發(fā)展迅速、病死率高，且極易引發(fā)胰腺外臟器衰竭進(jìn)而發(fā)展為多器官功能衰竭，導(dǎo)致病死率明顯升高[1]。急性腎損傷是SAP所致胰腺外臟器損傷較為常見(jiàn)的并發(fā)癥，SAP并發(fā)急性腎損傷會(huì)使疾病轉(zhuǎn)歸發(fā)生重大改變，患者病死率明顯增高，因此，在SAP發(fā)生的早期對(duì)可能出現(xiàn)的腎損傷進(jìn)行積極預(yù)防及治療，對(duì)疾病的轉(zhuǎn)歸具有重要臨床意義。蜂毒是由蜜蜂體內(nèi)提取出的自然毒素，有研究證實(shí)其具有抗關(guān)節(jié)炎、緩解水腫性炎癥引發(fā)的疼痛等作用[2-3]。蜂毒的化學(xué)成分復(fù)雜，其主要由蜂毒肽、蜂毒明肽構(gòu)成。有研究表明蜂毒肽具有抑制核因子-κB的作用[4]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討蜂毒明肽的抑制炎性因子進(jìn)而保護(hù)腎功能的效果，以及減輕SAP所致腎損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型的制備 無(wú)特定病原體級(jí)雄性SD大鼠32只(北京華阜康公司，質(zhì)量合格證號(hào)：11401300011894)，體重為180～200 g，采用隨機(jī)數(shù)表法分為假手術(shù)組(sham-operation，SO組)、SAP組、蜂毒明肽組(Apamin組)、溶劑對(duì)照組[二甲基亞砜組(dimethyl sulfoxide，DMSO組)]，每組8只大鼠。實(shí)驗(yàn)前8 h予禁食、不禁水。麻醉采用10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射。在SAP組及Apamin組建立SAP大鼠模型：予腹部消毒，于劍突下正中切口進(jìn)入腹腔，尋找膽胰管在十二指腸的開(kāi)口處，逆行插管，5%的牛黃膽酸鈉(1 ml/kg)以1 ml/min勻速注入膽胰管，成功制備SAP模型，術(shù)后大鼠皮下給予5 ml生理鹽水補(bǔ)液。SO組麻醉后僅打開(kāi)腹腔并翻動(dòng)十二指腸，另無(wú)其他處理。各組均術(shù)后補(bǔ)液處理。參照文獻(xiàn)[5]的方法，Apamin組在制備SAP模型完成后30 min及6 h皮下注射Apamin(購(gòu)于Sigma公司；Apamin溶于DMSO后注射)，劑量100 μg/kg。DMSO組給予皮下注射0.5% DMSO(Sigma公司，D2650)，劑量0.2 ml/100 g。SAP組術(shù)后僅給予補(bǔ)液，無(wú)其他特殊給藥。

1.2 血清酶學(xué)指標(biāo)及標(biāo)本 術(shù)后12 h行血清酶學(xué)、炎癥因子檢測(cè)，以及胰腺、腎臟組織標(biāo)本取材。大鼠麻醉后于下腔靜脈取血，4℃、轉(zhuǎn)速1 300 r/min離心5 min后取上層血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?1)采用西門(mén)子全自動(dòng)生化檢測(cè)儀測(cè)定血清淀粉酶、脂肪酶、血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科協(xié)助完成。(2)根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(武漢華美生物公司)說(shuō)明書(shū)的操作步驟，取血清檢測(cè)血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)水平。(3)取胰腺組織及大鼠右腎上極，4%多聚甲醛固定，包埋、切成3 μm厚切片，用蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，顯微鏡下觀察胰腺及形態(tài)改變，由兩名病理醫(yī)師根據(jù)文獻(xiàn)[6]中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行胰腺病理學(xué)評(píng)分，根據(jù)文獻(xiàn)[7]中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腎臟病理評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布和方差齊的計(jì)量資料采用(x±s)表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組術(shù)后12 h血清胰腺酶學(xué)指標(biāo)的比較 4組間淀粉酶、脂肪酶水平的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，SAP組及Apamin組的血清淀粉酶及脂肪酶均較SO組明顯升高(P<0.05)；Apamin組淀粉酶水平低于SAP組(P<0.05)，脂肪酶水平低于SAP組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DMSO組與SO組的血清淀粉酶及脂肪酶比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組術(shù)后12 h血清胰腺酶學(xué)指標(biāo)的比較(x±s，U/L)

注：與SO組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05。

2.2 各組術(shù)后12 h胰腺、腎臟病理學(xué)改變及病理評(píng)分 (1)病理學(xué)改變：SO組胰腺形態(tài)完整，無(wú)水腫、出血及相關(guān)病理改變；SAP組可見(jiàn)胰腺腺泡細(xì)胞大量壞死，內(nèi)有出血水腫；Apamin組可見(jiàn)胰腺腺泡細(xì)胞較SAP組壞死減少，仍有出血水腫；DMSO組僅見(jiàn)胰腺輕度水腫。見(jiàn)圖1。SO組腎臟無(wú)病理學(xué)改變，腎小管上皮細(xì)胞無(wú)出血、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；SAP組可見(jiàn)腎小管間質(zhì)內(nèi)出血，腎小管上皮細(xì)胞脫落并管型形成；Apamin組可見(jiàn)出血減少，腎小管上皮細(xì)胞脫落并管型形成較SAP減輕；DMSO組與SO組相似，均無(wú)明顯改變，見(jiàn)圖2。(2)病理評(píng)分：術(shù)后12h，SAP組及Apamin組的胰腺及病理評(píng)分均明顯高于SO組(P<0.05)；經(jīng)過(guò)蜂毒明肽治療后Apamin組胰腺及腎臟病理評(píng)分低于SAP組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

A SO組胰腺形態(tài)學(xué)改變 B SAP組胰腺形態(tài)學(xué)改變 C Apamin組胰腺形態(tài)學(xué)改變 D DMSO組胰腺形態(tài)學(xué)改變

圖1 各組術(shù)后12 h胰腺病理學(xué)改變(HE染色，×200)

A SO組腎臟形態(tài)學(xué)改變 B SAP組腎臟形態(tài)學(xué)改變 C Apamin組腎臟形態(tài)學(xué)改變 D DMSO組腎臟形態(tài)學(xué)改變

圖2 各組術(shù)后12 h腎臟病理學(xué)改變(HE染色，×200)

注：與SO組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05。

2.3 各組術(shù)后12 h TNF-α、IL-1、IL-6、BUN及Scr水平比較 4組間TNF-α、IL-1、IL-6、BUN及Scr水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。SAP組及Apamin組的TNF-α、IL-1、IL-6、BUN及Scr水平均明顯高于SO組(P<0.05)，Apamin組的各項(xiàng)指標(biāo)均低于SAP組(P<0.05)，但DMOS組的各項(xiàng)指標(biāo)與SO組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組術(shù)后12 h TNF-α、IL-1、IL-6、BUN及Scr水平比較(x±s)

注：與SO組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05。

3 討 論

SAP是目前消化系統(tǒng)疾病中較為嚴(yán)重的綜合性疾病，當(dāng)急性胰腺炎進(jìn)展為SAP時(shí)，嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)可釋放大量炎癥因子導(dǎo)致胰腺腺泡細(xì)胞壞死，并進(jìn)一步導(dǎo)致胰外器官功能損害，嚴(yán)重者可發(fā)生多器官功能衰竭。目前繼發(fā)于SAP的急性腎損傷是僅次于肺損傷的一種嚴(yán)重胰腺外臟器損傷。若急性腎損傷發(fā)展為急性腎衰竭，患者的死亡率達(dá)80%左右[8]，因此在SAP發(fā)生時(shí)應(yīng)該預(yù)防性地保護(hù)患者腎功能，這對(duì)治療SAP具有重要的意義。

本研究通過(guò)膽胰管逆行注射牛黃膽酸鈉構(gòu)建SAP大鼠模型，探討蜂毒明肽在SAP腎損傷中的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)中采用DMSO作為Apamin溶劑，但DMOS組的血清淀粉酶、脂肪酶、腎功能等指標(biāo)與SO組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且胰腺、腎臟無(wú)明顯病理改變，提示DMSO對(duì)正常大鼠影響不大。建模成功后SAP組及Apamin組大鼠的血清淀粉酶、脂肪酶均較SO組明顯升高(P<0.05)，而TNF-α，IL-1、IL-6、BUN及Scr水平也明顯高于SO組(P<0.05)。此外SAP組及Apamin組的胰腺及腎臟病理評(píng)分均高于明顯高于SO組(P<0.05)，提示大鼠發(fā)生SAP后血液中炎性因子水平升高并存在急性腎功能損傷。而與SAP組相比，Apamin組的血清淀粉酶、TNF-α，IL-1、IL-6、BUN及Scr水平均明顯下降(P<0.05)。鏡下病理結(jié)果顯示Apamin組胰腺、腎臟的損傷較SAP組減輕，胰腺、腎臟病理評(píng)分亦較SAP組降低(P<0.05)，提示應(yīng)用蜂毒明肽治療后能夠明顯降低大鼠的炎癥因子水平并改善胰腺及腎臟病理評(píng)分，這表明蜂毒明肽可通過(guò)抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步減輕胰腺及腎損傷。其可能的機(jī)制為蜂毒明肽通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以起到抗炎作用。TNF-α、IL-1及IL-6等炎癥因子在發(fā)生炎癥時(shí)候能夠產(chǎn)生一系列連鎖反應(yīng)及放大效應(yīng)，會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)及多器官功能衰竭。近年來(lái)研究顯示，蜂毒在炎癥發(fā)生過(guò)程及進(jìn)展中具有明顯的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，從而能在多種炎癥反應(yīng)綜合征中保護(hù)相關(guān)器官[4]。已有研究表明蜂毒明肽可在骨關(guān)節(jié)、心血管及呼吸系統(tǒng)等諸多器官的急、慢性炎性疾病及全身炎癥反應(yīng)綜合征中發(fā)揮一定的作用，包括緩解炎癥反應(yīng)、減輕組織形態(tài)損傷、保護(hù)臟器功能等[9]。

綜上所述，蜂毒明肽作為蜂毒中主要化學(xué)成分之一，在大鼠發(fā)生SAP時(shí)對(duì)腎功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制炎癥因子的浸潤(rùn)有關(guān)。

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Protective effect of apamin on renal function in rats with severe acute pancreatitis combined with renal injury

LIUShan-shan,YUANYu-lin

(SchoolofBasicMedicalSciences,WuhanUniversity,Wuhan430071,China)

Objective To explore the effect of apamin on the renal function in rats with severe acute pancreatitis(SAP) combined with renal injury.Methods Thirty-two SD rats were divided into sham-operation group(SO group),SAP group,apamin group(Apamin group) and solvent-control group(DMSO group),with 8 rats for each group.Retrograde cholangiopancreatic duct injection with sodium taurocholate was used to establish the rat models of severe acute pancreatitis.And the rats in the Apamin group were intervened with apamin.At 12 hours after operation,the levels of serum amylase,lipase,serum creatinine(Scr),blood urea nitrogen(BUN),tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-1β(IL-1β ) and interleukin-6(IL-6) were detected in all groups.Pancreas and renal histopathological changes of the rats were observed.Results Compared to OS group,Apamin group and SAP group had higer levels of amylase,Scr,BUN,TNF-α,IL-1β,IL-6,pancreas and renal histopathological scores(P<0.05).And these indices of Apamin group were lower than those of SAP group(P<0.05).Conclusion Apamin may alleviate renal injury by reducing SAP-induced inflammatory responses.

Severe acute pancreatitis,Apamin,Renal injury,Renal function,Amylase,Lipase,Rat

劉珊珊(1980～)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：消化系統(tǒng)疾病的診治。

袁玉林(1967～)，女，博士，教授，研究方向：消化系統(tǒng)疾病的診治，E-mail：yuanyulin19620120@126.com。

R 576.1

A

0253-4304(2016)02-0157-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.03

2015-07-29

2015-10-23)