孟 帆，吳 忻＊，姚敬明，樊振華，劉文俊，王娟萍，韓一超，薛翼鵬，米瑞娟，李玉斌

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，太原030032；2.陵川縣畜牧獸醫(yī)局，晉城048300）

豬圓環(huán)病毒2型山西株全基因組序列分析

孟 帆1，吳 忻1＊，姚敬明1，樊振華1，劉文俊1，王娟萍1，韓一超1，薛翼鵬1，米瑞娟1，李玉斌2

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，太原030032；2.陵川縣畜牧獸醫(yī)局，晉城048300）

摘 要：為了解山西省豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的遺傳變異情況，本試驗(yàn)采用PCR方法對山西省分離的4株豬圓環(huán)病毒流行株（SXXZ1株、SXXZ2株、SXTY株和SXJZ株）的全基因組進(jìn)行了擴(kuò)增、克隆和測序，并將其全基因組序列與國內(nèi)外34株主要流行毒株進(jìn)行核苷酸同源性與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示，4株P(guān)CV2山西流行株全基因組核酸序列全長SXJZ株為1 768bp，其余均為1 767bp，分別占25%和75%。4株毒株核苷酸同源性為95.9%～100.0%，與國內(nèi)外34株參考株同源性為94.5%～99.9%，與國產(chǎn)疫苗株同源性為95.6%～99.8%；PCV2全基因組序列進(jìn)化分析表明，本研究分離的SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株屬于PCV－2b基因型，SXJZ株屬于PCV－2e基因型，其中SXXZ1株和SXXZ2株與廣東QY株的進(jìn)化關(guān)系最近，SXTY與奧地利AUT5株的進(jìn)化關(guān)系最近，SXJZ與福建FJ株的進(jìn)化關(guān)系最近；而SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株與山西PCV2疫苗DBN－SX07－2株的進(jìn)化關(guān)系較近，SXJZ株與國內(nèi)PCV2疫苗LG株的進(jìn)化關(guān)系較近。從而證實(shí)在山西省流行的PCV2毒株以PCV－2b為主，同時還分離出了PCV－2e亞型，表明山西省存在PCV－2e亞型毒株。本試驗(yàn)結(jié)果為山西省PCV2的分子流行病學(xué)、遺傳變異及防控奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；全基因組；序列分析

豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）是DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，病毒無囊膜包裹，是圓環(huán)狀的單股負(fù)鏈，是當(dāng)前已知的最小動物病毒之一［1］。PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（post－weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原之一，由Allan等［2］首先從患PMWS的豬群中分離到。除此之外，PCV2也與豬圓環(huán)病毒?。╬orcine circovirus disease，PCVD）（如母豬繁殖障礙、豬呼吸道綜合征（PRDC）、豬皮炎腎病綜合征（PNDS）、仔豬先天性震顫、胎兒心肌炎和擴(kuò)張性壞死性肺炎等）緊密相關(guān)。自首次由加拿大報(bào)道以來，PCV2已在許多國家出現(xiàn)感染和流行，成為影響世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病病原之一。近年來，PCV2在中國豬群中也開始流行，朗洪武等［3］于1999年首次檢測到PCV2在中國的存在。各地關(guān)于PCV2遺傳變異分析的研究不斷增多，為此項(xiàng)目組對從山西發(fā)病豬群中分離出的4株豬圓環(huán)病毒進(jìn)行了全基因組測序及遺傳變異分析，通過分析PCV2山西流行株與國內(nèi)外流行株間的關(guān)系，以探求山西豬圓環(huán)病毒毒株變異情況，為PCV2的分子流行病學(xué)調(diào)查和致病機(jī)制的研究積累資料，并為今后PCVD的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1PCV2陽性樣品來源

對2014年來自山西省不同地區(qū)疑似豬圓環(huán)病毒病豬進(jìn)行剖檢，采集淋巴結(jié)、脾臟、腎臟等作為檢測PCV2的樣品，將經(jīng)鑒定為PCV2陽性的樣品于－70℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∵m量PCV2陽性樣品按1∶5的比例加入PBS制成組織勻漿，然后加入雙抗（2 000U／mL），反復(fù)凍融3次，12 000r／min離心30min，取上清液，經(jīng)0.22μm濾膜除菌后，取1mL接種于長成單層的PK－15細(xì)胞，37℃吸附作用1h，加入適量含2%小牛血清的維持營養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)72h。將培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，3 000r／min離心10min，收獲上清。按此法盲傳15代后，收獲病毒，獲得細(xì)胞毒進(jìn)行RT－PCR檢測。共獲得4株P(guān)CV2分離株，均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究室保存。

1.2主要試劑

豬圓環(huán)病毒PCR檢測試劑盒由北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司提供。TaKaRa MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit Ver.4.0和PremixTaqTM（ExTaqTMVersion 2.0）試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA膠回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提取試劑盒均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中收錄的PCV2AUT5（登錄號：AY424405）、Huanan－8（登錄號：EF421973）、Fh14（登錄號：AY321982）和SD－09（登錄號：GQ449669）等毒株的全基因組序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)1對擴(kuò)增PCV2全基因組序列的特異性引物。引物序列：上游引物P1：5′－ACCAGCGCACTTCGGCAG－3′；下游引物P2：5′－AATACTTACAGCGCACTTCTTTCGT－3′，預(yù)期擴(kuò)增長度為1 767或1 768bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4PCV2病毒基因組DNA提取

將收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，5 000r／min離心10min，取上清，按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒操作說明書，從PCV2中提取病毒基因組DNA，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5PCV2全基因組的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增方法按試劑盒說明書進(jìn)行。以提取的總DNA為模板，用PremixTaqTM（ExTaqTMVersion2.0）擴(kuò)增全基因。經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，PCR反應(yīng)體系50μL：PremixTaqTM（ExTaqTMVersion 2.0）25μL，上、下游引物（20μmol／L）各1μL，模板3μL，滅菌超純水補(bǔ)至50μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性45s，62℃退火45s，72℃延伸2min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.6PCV2全基因組的克隆及序列測定

將PCV2全基因組的PCR產(chǎn)物回收純化，將回收純化的PCR產(chǎn)物與pMD18－T載體連接過夜，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組菌進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的陽性菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.7PCV2全基因組序列比對分析

對測得的4株P(guān)CV2毒株全基因組核苷酸序列用DNAStar軟件進(jìn)行分析，并與已發(fā)表的34株國內(nèi)外PCV2參考毒株的全基因組序列進(jìn)行同源性比對及遺傳進(jìn)化分析。參考毒株信息見表1。

表1　PCV2參考毒株信息Table 1 Information of PCV2reference strains

2 結(jié)果與分析

2.1PCV2全基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)PCR擴(kuò)增后，凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增出片段大小約1 767bp的條帶（圖1），與預(yù)期片段大小相同。

2.2PCV2全基因組核苷酸序列分析

測序結(jié)果顯示，測定的4株P(guān)CV2毒株的全基因組核苷酸序列長度其中3株均為1 767bp，1株為1 768bp，按基因組長度劃分為兩種類型，分別占75%和25%。已收錄入GenBank中，登錄號分別為KX068219（SXXZ1）、KX068219（SXXZ2）、KX068219（SXJZ）和KX068219（SXTY）。用DNAStar軟件對獲得的4株P(guān)CV2的全基因序列與從GenBank收錄的不同國家和地區(qū)的34株P(guān)CV2毒株的全基因序列進(jìn)行了核苷酸序列同源性比對，序列分析結(jié)果見圖2。由圖2可知，所有PCV2毒株之間的序列同源性均相對較高，介于94.1%～100.0%之間。本研究所獲得4株P(guān)CV2毒株的全基因序列之間核苷酸同源性為95.9%～100.0%，與34株來自世界不同地區(qū)的PCV2參考株之間同源性為94.6%～99.9%，與國產(chǎn)疫苗株（LG株、SH株、DBN－SXO7－2株）同源性為95.6%～99.8%。其中，SXXZ1株和SXXZ2株序列之間同源性高達(dá)100.0%，與其他2株之間同源性為96.0%及98.8%，SXTY和其他3株之間同源性為95.9%～98.8%，SXJZ與其他3株之間同源性較低為95.9%～96.0%。進(jìn)一步分析結(jié)果表明，SXXZ1株和SXXZ2株與QY株（廣東）同源性最高，為99.7%，與DK1990PMWSfree同源性最低，為95.2%；SXTY株與AUT5株（奧地利）同源性最高，為99.9%，與DK1990PMWSfree和DK1980PMWSfree同源性最低，為95.4%；SXJZ株與HB0602株同源性最高，為99.5%，與DK1990PMWSfree和DK1980PMWSfree同源性最低，為94.6%。SXTY株與山西疫苗株DBNSXO7－2株全基因核苷酸序列同源性最高，為99.8%，SXXZ1株和SXXZ2株次之，為98.7%，SXJZ株同源性最低，為95.9%；SXXZ1株和SXXZ2株與中國疫苗株SH株（上海）全基因核苷酸序列同源性較高，為96.8%，SXTY株次之，為96.2%，SXJZ株同源性最低，為95.6%；SXJZ株與中國疫苗株LG株（黑龍江）全基因核苷酸序列同源性較高，為96.7%，SXTY株次之，為95.9%，SXXZ1株和SXXZ2株同源性最低，為95.6%。另外，4株山西PCV2分離株基因組上都具有保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（5′－GAAGTGCGCTGTAAGTATTACCAGCGCACTTC－3′）和9堿基基序（5′－AAGTATTAC－3′），與其他PCV2分離株一致。

圖1　PCV2PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of PCV2

2.3PCV2全基因遺傳進(jìn)化樹分析

根據(jù)獲得的4株P(guān)CV2毒株的全基因組和GenBank中收錄的34株國內(nèi)外參考毒株的全基因組核苷酸同源性分析結(jié)果繪制了PCV2系統(tǒng)進(jìn)化樹，以確定其基因型。由圖3可知，所比對的38株P(guān)CV2毒株明顯分為5個基因型，分別為PCV－2a、PCV－2b、PCV－2c、PCV－2d和PCV－2e，其中本研究分離的SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株均屬于PCV－2b亞群，占75%，SXJZ株屬于PCV－2e亞群，占25%；且SXXZ1株和SXXZ2株與QY株（廣東）親緣關(guān)系最近，SXTY株與AUT5株（奧地利）及DBN－SX07－2株（山西疫苗株）親緣關(guān)系最近，SXJZ株與與FJ株（福建）親緣關(guān)系最近。另外，與疫苗株的比對可知，SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株與DBN－SX07－2株（山西疫苗株）親緣關(guān)系最近，SXJZ株與LG株（黑龍江疫苗株）的親緣關(guān)系最近。

圖3　PCV2系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenic tree of PCV2

3 討 論

PCV2感染普遍存在于中國豬群，近年來因該病毒感染所導(dǎo)致的疾病加大了中國規(guī)模化豬場疫病的復(fù)雜程度，給中國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。山西省眾多養(yǎng)豬場也深受其害，韓一超等［4］2010—2012年對山西省進(jìn)行的豬病毒性疫病流行病學(xué)調(diào)查工作中發(fā)現(xiàn)，感染率最高的疫病就是PCV2引起的，在各地區(qū)調(diào)查豬場42個，檢出平均陽性率56.98%，最低地區(qū)為43.52%，最高地區(qū)為81.59%，感染率在有的調(diào)查豬場中可達(dá)到100.00%，對豬場各種疫病的控制和生產(chǎn)性能的發(fā)揮都有很大影響。本研究3株P(guān)CV2山西流行株全基因組序列長度為1 767bp，1株為1 768bp，與國內(nèi)大多數(shù)流行毒株基因組長度相同，且3株基因組全長為1 767bp的分離株與基因組全長為1 768bp的分離株相比均在1 042處缺失1個堿基（T），與報(bào)道一致［5］。另外這4株P(guān)CV2山西流行株基因組上都具有保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和9堿基基序，研究已證實(shí)PCV2基因組滾環(huán)復(fù)制的起始與這兩個結(jié)構(gòu)有關(guān)，PCV2中9堿基基序的第1個堿基由PCV－1中的T突變?yōu)锳，當(dāng)改變該基序的前兩個堿基時，病毒的復(fù)制能力也隨之消失［6－7］。

通過全基因組比對和核苷酸同源性分析發(fā)現(xiàn)4株山西PCV2分離株的全基因序列之間核苷酸同源性為95.9%～100.0%，與34株來自世界不同地區(qū)的PCV2參考株之間同源性為94.5%～99.9%，由此可見，山西省的PCV2與世界不同地域PCV2分離株的基因序列差異不大。4株山西PCV2分離株與國產(chǎn)疫苗株（LG株、SH株、DBN－SXO7－2株）同源性為95.6%～99.8%，其中SXTY株、SXXZ1株和SXXZ2株與山西疫苗株DBN－SXO7－2株全基因組核苷酸序列同源性較高，分別為99.8%、98.7%和98.7%，而SXJZ株與中國疫苗株LG株（黑龍江）全基因組核苷酸序列同源性較高，為96.7%，表明目前疫苗還能對大部分豬群提供保護(hù)，但最好能對發(fā)病豬群進(jìn)行基因測序，分析其遺傳變異情況，確定最佳疫苗進(jìn)行免疫。進(jìn)一步分析結(jié)果表明，SXXZ1株和SXXZ2株與QY株（廣東）同源性最高，為99.7%，SXTY株與AUT5株（奧地利）同源性最高，為99.9%，SXJZ株與HB0602株同源性最高，為99.5%，可見山西PCV2流行株來源并不單一，這可能與頻繁的種豬交流和防控措施不利有關(guān)。

根據(jù)基因遺傳距離大小的不同，早期研究將PCV2全基因組序列劃分為3個基因型，即PCV－2a、PCV－2b和PC－V2c，其中PCV－2a基因組全長為1 768bp，主要在中國和歐洲國家有報(bào)道；PCV－2b基因組全長為1 767bp，致病性最強(qiáng)，造成豬圓環(huán)病毒近年來在世界范圍內(nèi)普遍感染和流行［8－10］；PCV－2c僅在丹麥有報(bào)道［11］。在最新的研究中，PCV2被分為5種基因亞型，分別為PCV－2a、PCV－2b、PCV－2c、PCV－2d和PCV－2e，其中傳統(tǒng)分類方法中的PCV－2a又分為PCV－2a和PCV－2e，PCV－2b又分為PCV－2b、PCV－2c和PCV－2d。雖然PCV2和大多數(shù)豬群的感染有關(guān)，但Hesse等［12］認(rèn)為PCV2的臨床表現(xiàn)在不同基因型并不相同，即兩者的毒力不同，普遍認(rèn)為PCV－2a的致病性要弱于PCV－2b。而Opriessnig等［13］認(rèn)為在毒力方面，PCV－2a和PCV－2b沒有不同，且二者存在交叉保護(hù)力。為更好地了解PCV2毒株的遺傳變異情況及親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，本試驗(yàn)在對所有毒株同源性分析的基礎(chǔ)上繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹，從中可看出38株分離株分為5個大的分支（PCV－2a、PCV－2b、PCV－2c、PCV－2d和PCV－2e）。其中本研究分離的SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株均屬于PCV－2b亞群，占75%，SXJZ株屬于PCV－2e亞群，占25%；從而證實(shí)在山西以PCV－2b亞型毒株流行為主，這與許多學(xué)者報(bào)道的PCV－2b在中國很多地區(qū)為主要流行基因型的說法一致［14－21］；同時還分離出了PCV－2e亞型，表明山西存在PCV－2e亞型，但因過去幾年山西分子流行病學(xué)的資料較少，看不出山西PCV2基因型轉(zhuǎn)換的特點(diǎn)。SXXZ1株和SXXZ2株與QY株（廣東）親緣關(guān)系最近，SXTY株與AUT5株（奧地利）及DBNSX07－2株（山西疫苗株）親緣關(guān)系最近，SXJZ株與FJ株（福建）親緣關(guān)系最近。可見這4株P(guān)CV2山西分離株彼此之間及與國內(nèi)PCV2分離株、歐洲株之間更接近，而與韓國、中國臺灣、日本和美洲毒株之間則稍遠(yuǎn)。另外，與疫苗株的比較可看出，SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株與DBN－SX07－2株（山西疫苗株）親緣關(guān)系最近，SXJZ株與LG株（黑龍江疫苗株）的親緣關(guān)系最近。因而，建議山西省在選PCV2疫苗免疫時，盡量使用國內(nèi)生產(chǎn)的疫苗進(jìn)行免疫。

4 結(jié) 論

本研究通過對山西省PCV2分離株序列的分析研究，明確了目前山西省PCV2流行株基因組的特征，支持了中國PCV2分型的依據(jù)，為PCV2的防控和疫苗研究提供了理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 董曉云）

中圖分類號：S858.28

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3127－08

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.007

收稿日期：2016－05－05

基金項(xiàng)目：山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130311026－4）

作者簡介：孟 帆（1980－），女，山西太原人，碩士，助理研究員，研究方向：動物疫病分子生物學(xué)檢測與診斷技術(shù)，E－mail：mengfan0525＠163.com

通信作者：＊吳 忻（1966－），男，山西人，學(xué)士，副研究員，研究方向：畜禽傳染病，E－mail：jcbyjs＠sohu.com

Genome Sequence Analysis of Porcine Circovirus Type 2Strains from Shanxi Province

MENG Fan1，WU Xin1＊，YAO Jing－ming1，F(xiàn)AN Zhen－h(huán)ua1，LIU Wen－jun1，WANG Juan－ping1，HAN Yi－chao1，XUE Yi－peng1，MI Rui－juan1，Li Yu－bin2
（1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinary，ShanxiAcademyofAgriculturalSciences，Taiyuan030032，China；2.BureauofAnimalHusbandryofLingchuan，Jincheng048300，China）

Abstract：In order to study genetic variation of porcine circovirus type 2（PCV2）strains in Shanxi province，the genomic sequences of four PCV2strains which were SXXZ1，SXXZ2，SXTY and SXJZ were isolated recently from some areas of Shanxi province，they were amplified，cloned and sequenced.The amplified PCV2genomic sequences of these four strains were analyzed and compared with that of 34published PCV2stains by DNAStar and drawing phylogenetic tree.The results showed that the genomic sequences of SXJZ PCV2strain was 1 768bp，and the others were 1 767bp，which accounted for 25%and 75%，respectively.The homologies of nucleotide sequences of the four strains were 95.9%to 100.0%，the homologies of nucleotide sequences of the four strains with the 34isolates from different regions of the world PCV strain were 94.5%to 99.9%，and the homologies of nucleotide sequences of the four strains with the domestic vaccine strains were 95.6%to 99.8%.The phylogenetic tree analysis showed that SXXZ1，SXXZ2and SXTY belonged to PCV－2bgenotype，and SXJZ belonged to PCV－2egenotype.The evolutionary rela－tionship among SXXZ1，SXXZ2and the QY strain of Guangdong were closer，we also found a recent evolutionary relationship between SXTY and AUT5of Austria，and a recent evolutionary relationship between SXJZ and FJ of Fujian.Besides the evolutionary relationship among SXXZ1，SXXZ2，SXTY and the DBN－SX07－2of PCV2vaccine of Shanxi province，a recent evolutionary relationship between SXJZ and LG of PCV2vaccine were found.Thus PCV2strains were popular based on PCV－2bin Shanxi province，also PCV－2ewas isolated and existed.It laid a foundation for the molecular epidemiology，genetic variation，prevention and control of PCV2in Shanxi province.

Key words：porcine circovirus type 2；genome；sequence analysis