周麗屏，陳 糾，郭嘉明，劉移民

（廣州市職業(yè)病防治院職業(yè)衛(wèi)生評價檢測中心，廣東廣州 510620）

中毒患者生物檢材中卡馬西平及其代謝物的氣相色譜質(zhì)譜分析

周麗屏，陳 糾，郭嘉明，劉移民

（廣州市職業(yè)病防治院職業(yè)衛(wèi)生評價檢測中心，廣東廣州 510620）

目的 探討卡馬西平（CBZ）在中毒患者不同生物檢材中的主要代謝產(chǎn)物及其代謝途徑。方法 通過收集廣州市職業(yè)病防治院1例CBZ中毒患者服用CBZ約6 h后的胃液、血液及尿液，以未服用CBZ的正常人體液作為對照，采用氣相色譜質(zhì)譜法進行分析，用NIST98譜庫檢索系統(tǒng)對所得質(zhì)譜圖進行圖庫檢索，并根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律及相關(guān)文獻報道進行圖譜解析，鑒定CBZ代謝物結(jié)構(gòu)，推斷其代謝途徑。結(jié)果在CBZ中毒患者胃液中檢出亞氨基茋（M1）1種代謝產(chǎn)物，血液中檢出M1、9-甲基吖啶（M2）、9-丙基-9，10-二氫化吖啶（M4）及未知代謝產(chǎn)物M3共4種代謝產(chǎn)物，尿液中檢出M1、M2、M4、吖啶（M5）、吖啶酮（M6）、9，10-二氫吖啶（M7）、10，11-環(huán)氧卡馬西平（M8）、9-吖啶甲醇（M9）、10，11-二羥卡馬西平（M10）、2-甲基-吖啶酮（M12）、4-甲基-吖啶酮（M13）及未知代謝產(chǎn)物M3和M11共13種代謝產(chǎn)物。M3和M11代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)仍需進一步分離及鑒定。在胃液、血液和尿液中，CBZ的代謝物形式存在較大差異，且僅極少量以原藥形式在尿液中排出。結(jié)論 經(jīng)過氣相色譜質(zhì)譜分析和圖庫檢索，篩查鑒定出中毒患者體內(nèi)CBZ的13種代謝產(chǎn)物，并推斷其代謝途徑。

氣相色譜質(zhì)譜法；卡馬西平；代謝物

卡馬西平（carbamazepine，CBZ），化學名為5H-二苯并［b，f］氮雜卓艸-5-甲酰胺，是一種三環(huán)類抗驚厥藥物，臨床上常用于治療癲癇、三叉神經(jīng)痛以及雙相情感障礙等疾?。?］。服用CBZ后可引起頭暈、頭痛、乏力、復視及昏迷等不良反應，超劑量使用可出現(xiàn)精神錯亂、肌肉抽動、震顫、角弓反張、反射異常、心跳加快、呼吸抑制、昏迷、休克甚至死亡［2］。Ju等［3］和朱旭等［4］認為，CBZ在人體內(nèi)經(jīng)細胞色素P450酶系代謝為其活性代謝產(chǎn)物，環(huán)氧化CBZ及羥基化CBZ，它們再經(jīng)肝微粒體環(huán)氧化物酶進一步轉(zhuǎn)化為無活性的CBZ二元醇等代謝產(chǎn)物，最后通過尿液排出。Mathieu等［5］認為，環(huán)氧化物酶的缺乏可能是引起CBZ不良反應的主要原因，其毒性是由活性芳香環(huán)氧化中間代謝產(chǎn)物引起。目前，生物檢材中CBZ及其代謝物最常用的檢測方法為液相色譜法［6-7］、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［8-9］和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［10-11］，也有氣相色譜法［12］和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrome?try，GC-MS）［13-14］等檢測方法。但目前，鮮見對CBZ在人體中代謝產(chǎn)物的定性鑒定及代謝機制的深入研究。對不明原因的昏迷患者，快速確認昏迷原因是臨床診治的迫切需求，考慮到GC-MS具有圖庫檢索功能，因此首選用GC-MS對中毒患者的生物檢材進行定性分析。本研究選用CBZ中毒患者的胃液、血液及尿液同時進行測定，旨在研究CBZ進入人體后的代謝途徑及機制。本研究采用GC-MS聯(lián)用儀，液液萃取簡單快速的樣品前處理方法，經(jīng)圖庫檢索準確快速鑒定中毒患者生物檢材中的未知毒物及其代謝物，為毒物鑒定提供推斷基礎(chǔ)，為臨床快速診治提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

乙酸乙酯（色譜純），德國Merck公司；甲醇（色譜純），德國CNW科技公司；CBZ（純度≥99.5%），德國Dr.Ehrensorfer公司。

6890-5973N氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀和DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美國Agilent公司；HGC-12A氮吹濃縮儀，天津恒奧科技發(fā)展有限公司；TG20臺式離心機，長沙英泰儀器有限公司；V8渦旋混合器，美國安勝（Essenscien）儀器公司；AX200萬分之一天平，日本島津公司；10和50 μL微量注射器，澳大利亞SGE公司。

1.2 樣品來源

患者，男，72歲，不明原因昏迷被送入廣州市職業(yè)病防治院。家屬述患者有精神病史，曾服用CBZ 3年，停藥近半年。家屬發(fā)現(xiàn)患者出現(xiàn)惡心嘔吐癥狀，嘔吐物有白色粉末，逐漸意識不清，被家屬送院救治。入院后以胃管經(jīng)鼻抽取患者胃液；采集靜脈血約4 mL于普通干燥采血管中；用導尿管采集尿液，樣品采集時距離患者口服毒物約6 h。該患者的胃液、血液及尿液送實驗室檢測。

1.3 樣品前處理

1.3.1 尿液和胃液的前處理

取2 mL尿液或胃液，加入3 mL乙酸乙酯，渦旋3 min，離心（1073×g，25℃）3 min，準確量取上清2 mL，氮吹濃縮至近干，用微量注射器準確加入50 μL乙酸乙酯，待進樣分析。

1.3.2 血樣的前處理

普通干燥管采血后，離心（1073×g，25℃）3 min，取2 mL血清，其他步驟按1.3.1操作。

1.4 GC-MS檢測條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：230℃；柱溫：80℃，保持3 min，以10℃?min-1升到220℃，保持2 min，再以15℃?min-1升到250℃，保持15 min，以5∶1的分流比進樣；進樣量：2 μL；載氣：高純氦氣；采用恒流模式，柱流量：1.0 mL?min-1。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電子轟擊（EI）源；離子源溫度：230℃；輔助接口溫度：280℃；EI電壓：69.9 eV；掃描方式：Scan；掃描質(zhì)荷比（m/z）范圍：33~400 amu；質(zhì)譜調(diào)諧：自動調(diào)諧；溶劑延遲：3.5 min。

1.5 GC-MS圖譜解析

用EI源GC-MS聯(lián)用儀對樣品進行檢測，對質(zhì)譜圖進行圖庫（美國國家科技研究所NIST 98質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫）檢索和特征離子峰分析，結(jié)合分子結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律及相關(guān)文獻報道的代謝物進行圖譜解析。本文所有分子結(jié)構(gòu)圖均采用ChemDraw Ultra 7.0軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 GC-MS分析結(jié)果

按1.4項下GC-MS條件對患者處理后的體液樣本進行分析，胃液、血液和尿液中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品的分離測定（圖1）。圖庫檢索結(jié)果見表1。

2.2 圖譜解析CBZ的代謝產(chǎn)物

Fig.1 Total ion chromatorgrams of human gastric juice（A），human serum（B）and human urine（C）by gas chromatorgraphy-mass spectrometry.Black line：total ion chromatorgraphy of test samples；red line：total ion chromatorgraphy of blank samples.

Tab.1 Summary of metabolites of carbamazepine detected in three biological samples using NIST98 mass spectral library search system

根據(jù)謝岑等［15］報道的反應性代謝物分析原理，結(jié)合文獻［6，8，16-17］報道的CBZ及其主要代謝物的代謝途徑及機制，對胃液、尿液及血液提取液的總離子流圖進行圖譜解析。由GC-MS圖庫檢索可得到11種CBZ代謝產(chǎn)物，而M3和M11未有與之匹配的化合物圖庫，根據(jù)圖2A和2B的特征離子圖結(jié)合文獻資料推斷其分子結(jié)構(gòu)的可能存在形式（圖2C和2D），但具體結(jié)構(gòu)確認還有待進一步分離及鑒定。13種CBZ代謝產(chǎn)物中，M8和M10是最常被報道的，且已有較多文獻報道以高效液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)對M8和M10進行定量分析。Breton等［8］已報道CBZ代謝產(chǎn)物亞氨基茋（iminostilbene，M1），M3，吖啶（acridine，M5）和吖啶酮（acridone，M6）在體內(nèi)的代謝途徑。其他7種化合物則很少被報道為CBZ的代謝產(chǎn)物。從表1可見，在胃液提取液中未檢出9-甲基吖啶（M2）~4-甲基-吖啶酮（M13），表明這12種化合物不是以CBZ的雜質(zhì)存在，而是經(jīng)過人體代謝所產(chǎn)生的。

Fig.2 Mass spectra of M3（A），M11（B）and chemical structures of M3（C）and M11（D）.RMM：relative molecular mass.

由圖2A和2C推斷，m/z207為M3的分子離子峰，物質(zhì)較穩(wěn)定。因此分子離子峰較為明顯，m/z207為奇數(shù)，分子含氮數(shù)為奇數(shù)，符合“氮律”。m/z207首先失去CO（m/z28）使六元環(huán)開環(huán)并重排，因此得m/z179的碎片峰，再失去C2H4（m/z28）得m/z151碎片峰。由圖2B和2D推斷，m/z283為M11的分子離子峰，物質(zhì)較穩(wěn)定。因此分子離子峰較為明顯，m/z283為奇數(shù)，分子含氮數(shù)為奇數(shù)，符合“氮律”。m/z283首先失去OH（m/z17）得m/z266的碎片峰，再失去NCONH2（m/z58）得m/z208碎片峰，最后環(huán)氧脫H2O（m/z18），形成m/z為180的碎片峰。

本研究在CBZ中毒患者的尿液中檢出M2，9-丙基-9，10-二氫吖啶（M4），9，10二氫吖啶（M7），9-吖啶甲醇（M9），M11，2-甲基-吖啶酮（M12）及M13，并對其代謝途徑進行推斷及解釋。從表1和圖1C可見，CBZ進入人體后，經(jīng)過代謝，只有極少量以CBZ形式在尿液中排出，且大多以M1，M2，M3和M5的代謝產(chǎn)物形式排出；其次以M4，M8和M11的代謝產(chǎn)物形式排出；從圖1B可見，CBZ在血清中的主要代謝產(chǎn)物為M1和M3，而M2和M4的含量很低。

2.3 CBZ代謝途徑分析

依據(jù)本研究結(jié)果推斷，CBZ其他代謝產(chǎn)物的生成途徑如圖3。從表1可見，胃液的提取物成分比較簡單，除常見的有機酸外，檢出的主要成分為M1和CBZ，其中M1是合成CBZ的主要藥物中間體，根據(jù)藥物在人體的反應代謝原理推斷，CBZ進入人體胃部中受胃酸的作用，發(fā)生去N-氨基甲?；磻?，生成亞氨基茋。CBZ在細胞色素P450的作用下，發(fā)生環(huán)氧化反應生成M8，而M8在人體內(nèi)又可發(fā)生水解反應生成M10。Breton等［8］報道了在白細胞的氧化作用下，CBZ和M1更傾向于生成M9，M5和M6，這一結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

Fig.3 Proposed metabolic pathways of carbamazepine in humans.

3 討論

一般用于液液萃取的溶劑首先要與被萃取基質(zhì)互不相溶，其次根據(jù)相似相溶原理需考慮目標提取物的極性、水溶性及脂溶性等特點。對于大多數(shù)藥物來說，在研發(fā)過程中為了提高其生物利用度，要求藥物在吸收部位必須具有一定的水溶解度，因為人體的介質(zhì)是水，水是藥物轉(zhuǎn)運的載體，而細胞膜的雙脂質(zhì)層的結(jié)構(gòu)，要求藥物有一定的脂溶性才能穿透細胞膜。本研究對比了三氯甲烷、正己烷和乙酸乙酯的相對萃取效率。結(jié)果表明，乙酸乙酯對尿液和胃液有較高的萃取效率，原因在于CBZ易溶于乙醇和丙酮等極性溶劑，難溶于水，而乙酸乙酯水溶解性和極性較三氯甲烷和正己烷強。因此，在尿液和胃液中的分散程度較好，對CBZ的溶解度也較三氯甲烷和正己烷高。由于受采血量限制，本研究并未對血清的提取進行優(yōu)化對比，但本研究旨在快速篩查中毒原因以及毒物進入人體后的代謝途徑及機制。因此，乙酸乙酯作為提取溶劑已能滿足要求。

綜上所述，該法前處理簡單，通過GC-MS分離及圖庫檢索，可快速篩查中毒患者的中毒原因，結(jié)果準確可靠。CBZ進入人體后，經(jīng)過代謝，在尿中極少以CBZ形式排出，其主要以M1，M2，M3和M5代謝物形式排出。在尿中的13種CBZ代謝產(chǎn)物中有11種經(jīng)圖庫檢索可確定結(jié)構(gòu)，另2種（M3和M11）代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)仍需進一步分離及鑒定。

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Determination of carbamazepine and its metabolites in biological samples from a poisoned patient by GC-MS analysis

ZHOU Li-ping，CHEN Jiu，GUO Jia-ming，LIU Yi-min
（Evaluation and Testing Center for Occupational Hygiene，Hospital of Prevention and Treatment for Occupational Diseases，Guangzhou 510620，China）

OBJECTIVE To investigate the forms of carbamazepine and its metabolites in the gastric juice，blood and urine samples from a poisoned patient and its metabolic pathways.METHODS The gastric juice，blood and urine samples were obtained from a patient who was rushed to the Hospital of Prevention and Treatment for Occupational Diseases to be treated for an overdose of carbamazepine for about six hours.The samples were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry.The metabolites were identified from their mass spectra by comparison with spectra in NIST 98 libraries. The metabolic pathways were inferred by fragmentation regularities of mass spectra and the published data.RESULTS The results showed that only M1 was found in the gastric juice sample.Four metabo?lites，such as iminostilbene（M1），9-methyl-acridine（M2），9-propyl-acridan（M4）and M3，were found in the blood sample and thirteen metabolites，including M1，M2，M4，acridine（M5），acridone（M6），9，10-dihydro Acridine（M7），1a，10b-dihydro-6H-dibenz［b，f］oxireno［d］azepine-6-carboxamide（M8），9-acridinemethanol（M9），10，11-dihydrodiol-carbamazepine（M10），2-methyl-acridone（M12），4-methyl-acridone（M13），undetermined M3 and M11，were found in the urine from the poi?soned patient.The forms of carbamazepine metabolites in the gastric juice，blood and urine were different. Little carbamazepine was found in the urine after metabolism.CONCLUSION Based on the analysis by gas chromatography-mass spectrometry and identification of NIST 98 libraries，the metabolites could be identified accurately，which can help analyze the metabolic mechanism and pathways of carbam?azepine.

gas chromatography-mass spectrometry；carbamazepine；metabolites

LIU Yi-min，E-mail：ymliu61@163.com，Tel：（020）38981264

R969.1

A

1000-3002-（2016）09-0961-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.09.009

Foundation item：The project supported by Laboratory Construction Project of Occupational Environment and Health Effect in Guangzhou City（2014SY000020）

2015-12-18接受日期：2016-07-11）

（本文編輯：沈海南）

廣州市職業(yè)環(huán)境與健康效應實驗室建設(shè)項目（2014SY000020）

周麗屏，（1981-），女，碩士研究生，分析化學工程師，理化檢驗主管技師，主要從事職業(yè)衛(wèi)生檢測及化學中毒應急救援檢測工作。

劉移民，E-mail：ymliu61@163.com，Tel：（020）38981264