靳 溪，席 超，劉 愷，劉 進

（北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗技術(shù)中心，北京 100875）

GADD45 α在遺傳毒性檢測中的分子原理及研究進展

靳 溪，席 超，劉 愷，劉 進

（北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗技術(shù)中心，北京 100875）

GADD45α作為細胞生長阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因家族成員，參與細胞周期阻滯、細胞凋亡和細胞衰老等調(diào)控，在多種因素誘導(dǎo)的細胞應(yīng)激及DNA損傷應(yīng)答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要生物學(xué)功能。多種轉(zhuǎn)錄因子和蛋白參與GADD45α基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。GADD45α蛋白通過與其他蛋白相互作用在基因組穩(wěn)定性相關(guān)的細胞應(yīng)答調(diào)控中發(fā)揮作用?；贕ADD45α的細胞調(diào)控特性構(gòu)建的遺傳毒性檢測系統(tǒng)被應(yīng)用于外源化合物的體外遺傳毒性評價，為遺傳毒性評價研究提供了新的思路。本文就GADD45α在遺傳毒性檢測應(yīng)用中的分子原理和研究進展進行綜述。

GADD45α；DNA損傷；細胞周期；遺傳毒性檢測

生長阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因（growth arrest and DNA damage-inducible 45α，GADD45α）又名DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因1（DNA damage-inducible transcript 1）。多種細胞應(yīng)激因素，包括遺傳毒性化合物、細胞營養(yǎng)缺乏、電離輻射和紫外線輻射等都能誘導(dǎo)GADD45α的轉(zhuǎn)錄表達，該基因過度表達會導(dǎo)致細胞出現(xiàn)生長阻滯和凋亡現(xiàn)象。該基因編碼的蛋白是一類調(diào)控分子，其主要功能是保護細胞，在細胞周期阻滯、細胞增殖、細胞凋亡和細胞衰老等調(diào)控進程中發(fā)揮重要作用［1-6］?；贕ADD45α的細胞調(diào)控特性構(gòu)建的遺傳毒性檢測系統(tǒng)已被應(yīng)用于外源化合物的遺傳毒性檢測。該檢測方法實現(xiàn)了基于人源細胞的體外遺傳毒性評價，具有高特異性、可操作性和良好重復(fù)性的優(yōu)勢，同時可滿足高通量檢測的需求，為毒理學(xué)評價方法提供有益的研究參考。

1 GADD45 α遺傳毒性檢測系統(tǒng)分子原理

基于GADD45α的分子調(diào)控機制構(gòu)建的遺傳毒性檢測系統(tǒng)主要包括報告質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染細胞2部分，其核心是由該基因啟動子、外顯子和內(nèi)含子序列，結(jié)合報告熒光基因序列〔綠色熒光蛋白（green fluo?rescent protein，GFP）或熒光素酶〕及調(diào)控元件構(gòu)建的報告質(zhì)粒（圖1）。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人淋巴母細胞TK6形成GADD45α遺傳毒性檢測系統(tǒng)，即可應(yīng)用于外源化合物的遺傳毒性評價。該基因在多種DNA損傷誘導(dǎo)因素下通過不同的調(diào)控途徑激活轉(zhuǎn)錄。若外源化合物具有誘導(dǎo)DNA損傷的效應(yīng)，則報告質(zhì)粒中該基因啟動子激活，繼而發(fā)出報告熒光，綜合統(tǒng)計分析細胞中熒光強度差異和變化可判斷外源化合物誘導(dǎo)該基因轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)，由此實現(xiàn)對外源化合物的遺傳毒性評價［7-8］。

圖1報告質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖.Ⅰ：叉頭盒O類轉(zhuǎn)錄因子3a結(jié)合位點；Ⅱ：Wilms腫瘤基因1-早期生長應(yīng)答因子1結(jié)合位點；Ⅲ：八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1和CCAAT結(jié)合位點；GFP：綠色熒光蛋白.

1.1 GADD45α基因

人GADD45α基因位于染色體1p3112，全長3278 bp，有4個外顯子，mRNA全長1398 bp（NM_001924），編碼序列全長498 bp［9］。它主要表達在細胞核內(nèi)，并廣泛表達于多種正常組織中。該基因在物種之間高度保守，在人類、羅猴、家貓、倉鼠、小鼠和大鼠有＞90%的氨基酸序列具有一致性［10-11］。在多種小鼠細胞系、人成纖維細胞、人淋巴細胞和人多種腫瘤細胞中，已證明特定的DNA損傷試劑誘導(dǎo)GADD45α基因表達上調(diào)。該基因參與多種因素誘導(dǎo)的細胞DNA損傷和細胞凋亡，以及細胞周期和DNA修復(fù)等調(diào)控，具有重要的生物學(xué)功能［12-17］。

1.2 GADD45α基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

多種轉(zhuǎn)錄因子和蛋白參與該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。根據(jù)外源刺激、細胞類型和生長環(huán)境等條件不同，該基因表達調(diào)控途徑也不同。

1.2.1 P53蛋白與GADD45α轉(zhuǎn)錄調(diào)控

P53介導(dǎo)的GADD45α上調(diào)是水飛薊賓在紫外線輻射誘導(dǎo)細胞損傷時發(fā)揮保護作用的主要調(diào)節(jié)機制［18］。該基因的第三內(nèi)含子中有一個高度保守的P53結(jié)合位點，結(jié)合此位點可促進該基因的轉(zhuǎn)錄表達。另外，P53與其他蛋白相互作用間接調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。Wilms腫瘤基因1（Wilms tumor 1，WT1）是一個重要的腫瘤抑制蛋白，核轉(zhuǎn)錄因子GADD45α啟動子區(qū)有WT1結(jié)合位點，P53可通過依賴和非依賴途徑調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達［19］。各種影響P53與WT1結(jié)合的因素或影響其功能的因素均可能導(dǎo)致GADD45α轉(zhuǎn)錄活性的改變。

1.2.2 乳腺癌1號基因蛋白（breast cancer 1，BRCA1）與GADD45α轉(zhuǎn)錄調(diào)控

研究發(fā)現(xiàn)，隨著BRCA1的誘導(dǎo)表達，GADD45α的mRNA水平顯著升高。多種人細胞系瞬時轉(zhuǎn)染表達BRCA1質(zhì)粒也能誘導(dǎo)GADD45α基因表達［20］。在DNA損傷因素作用下，八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 1（octamer binding transcription factor 1，OCT1）和核轉(zhuǎn)錄因子Y亞基α（nuclear transcrip?tion factor Y subunit alpha，NF-YA）表達增高，提示這2個轉(zhuǎn)錄因子可能參與了遺傳毒性的細胞應(yīng)答。在GADD45α基因啟動子-121~-75 bp區(qū)間有OCT1結(jié)合位點和CCAAT框，可分別與轉(zhuǎn)錄因子OCT1和NF-YA結(jié)合。凝膠遷移實驗進一步證實它們可與GADD45α基因啟動子結(jié)合［21-24］。BRCA1對GADD45α的轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要是通過與轉(zhuǎn)錄因子OCT1和NF-YA相互作用，進而結(jié)合于GADD45α基因啟動子區(qū)OCT1結(jié)合位點和CCAAT框，調(diào)節(jié)GADD45α的基因轉(zhuǎn)錄。GADD45α基因啟動子區(qū)段OCT1結(jié)合位點和CCAAT框的堿基序列突變或缺失會導(dǎo)致BRCA1誘導(dǎo)GADD45α基因轉(zhuǎn)錄表達的作用下降［22］。Aurora激酶抑制劑通過招募OCT1轉(zhuǎn)錄因子至基因啟動子關(guān)鍵區(qū)域調(diào)控GADD45α轉(zhuǎn)錄表達［25］。通過OCT-1和NF-YA激活GADD45α轉(zhuǎn)錄是紫外線輻射、甲磺酸甲酯和曲古菌素A等刺激因素重要的細胞應(yīng)答調(diào)控方式［21，24］。

1.2.3 其他蛋白與GADD45α轉(zhuǎn)錄調(diào)控

CCAAT增強子結(jié)合蛋白（CCAAT enhancer binding protein,C/EBP）可誘導(dǎo)GADD45α基因表達［26］。亞砷酸鹽和亮氨酸缺乏、蛋白酶體抑制及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等因素誘導(dǎo)活化轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）激活該基因轉(zhuǎn)錄［27］。在磷酸肌醇3抑制劑或氧化應(yīng)激刺激下，叉頭盒O類轉(zhuǎn)錄因子3a（forkhead box O 3a，F(xiàn)OXO3a）蛋白結(jié)合到該基因啟動子激活GADD45α基因轉(zhuǎn)錄［28-29］。小鼠成纖維細胞中Myc顯著并有選擇性地抑制FOXO介導(dǎo)的GADD45α基因表達，Myc和Akt通過失活FOXO抑制該基因轉(zhuǎn)錄［30］。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated pro?tein kinases，MAPK）信號通路誘導(dǎo)GADD45α表達是通過P38和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-ter?minal kinase,JNK）活化c-Jun。與P53類似，c-Jun在GADD45α第三內(nèi)含子區(qū)域存在結(jié)合位點，激活GADD45α基因的轉(zhuǎn)錄。雌激素受體β以不依賴配體的方式與該基因啟動子結(jié)合募集c-Jun，激活該基因轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控細胞周期G2/M期阻滯［31］。GADD45α在DNA損傷誘導(dǎo)的細胞衰老調(diào)控中發(fā)揮重要作用。它通過P38信號通路調(diào)控反式激活P53以維持細胞衰老表型。GADD45α，P38和P53之間的反饋調(diào)節(jié)在成纖維細胞、角質(zhì)細胞等類型細胞DNA損傷后誘導(dǎo)和維持細胞衰老表型的調(diào)控中必不可少［26，32］。

1.3 GADD45α參與DNA修復(fù)調(diào)控

GADD45α主要通過促進蛋白質(zhì)之間相互作用或改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來發(fā)揮其生物學(xué)功能。各種因素誘導(dǎo)細胞應(yīng)激或DNA損傷后，它通過參與細胞周期、細胞凋亡和DNA修復(fù)等功能的調(diào)控以維持細胞基因組穩(wěn)定性。已有很多文獻報道，GADD45α參與細胞周期G1/S期和G2/M期阻滯、細胞凋亡和中心體穩(wěn)定性的調(diào)控機制［3，33-38］。各種因素誘導(dǎo)基因組DNA出現(xiàn)損傷后，DNA會通過多種途徑調(diào)節(jié)進行損傷修復(fù)，以保證基因組穩(wěn)定性，防止惡變。損傷修復(fù)主要包括錯配修復(fù)、直接修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)和易錯修復(fù)等。研究發(fā)現(xiàn)，GADD45α在細胞DNA損傷修復(fù)中具有重要作用。

GADD45α缺失小鼠造血干細胞在電離輻射刺激后DNA修復(fù)延遲［39］。在共濟失調(diào)毛細血管擴張突變基因缺失小鼠的造血干細胞中，GADD45α基因缺失加重細胞DNA損傷［40］。在甲磺酸甲酯誘導(dǎo)DNA損傷后的DNA修復(fù)中，GADD45α參與堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）過程［38，41］。GADD45α缺失可減少BER，影響無嘌呤無嘧啶核酸內(nèi)切酶（apurinic/apyrimidinic endonuclease，APE）在胞質(zhì)定位，并且降低APE和增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的相互作用，延緩無嘌呤位點的移除［42］。有機硒誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細胞DNA損傷后的BER活性與GADD45α和修復(fù)蛋白（PCNA/APE1）相互作用有關(guān)。GADD45α蛋白上存在PCNA蛋白結(jié)合位點，GADD45α通過與PCNA和DNA修復(fù)復(fù)合物相互作用調(diào)控DNA修復(fù)。PCNA與GADD45α的結(jié)合位點對于APE和PCNA相互作用調(diào)控十分重要，并因此影響B(tài)ER效果［43］。GADD45α和P21競爭性與PCNA相互作用。在紫外線輻射的角質(zhì)細胞中，GADD45α下調(diào)P21的表達并促進BER進程［26］。

核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair，NER）是紫外輻射誘導(dǎo)人體細胞DNA損傷后DNA修復(fù)的重要途徑。體外實驗和細胞實驗表明，重組GADD45α可促進NER。GADD45α主要通過識別紫外輻射誘導(dǎo)的細胞染色體結(jié)構(gòu)變化，并調(diào)控DNA修復(fù)復(fù)合物的組裝參與NER。GADD45α缺失導(dǎo)致全基因組水平NER功能下降及細胞對DNA損傷應(yīng)激敏感，如GADD45α缺失的結(jié)直腸癌細胞缺失NER功能，同時對紫外輻射和順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)激更加敏感［28，44］。

各種因素誘導(dǎo)細胞應(yīng)激或DNA損傷后，GADD45α基因的轉(zhuǎn)錄激活是GADD45α蛋白發(fā)揮細胞調(diào)控功能的分子基礎(chǔ)。GADD45α通過參與細胞周期、細胞凋亡和DNA修復(fù)等功能的調(diào)控以維持細胞基因組穩(wěn)定性。遺傳毒性檢測系統(tǒng)中應(yīng)用的人源細胞自身對于DNA損傷刺激因素會做出反饋調(diào)節(jié)，細胞中GADD45α蛋白通過發(fā)揮維持細胞基因組穩(wěn)定性的調(diào)控功能，保障應(yīng)用于檢測系統(tǒng)細胞的存活。

2 GADD45 α遺傳毒性檢測系統(tǒng)的應(yīng)用

基于GADD45α在DNA損傷細胞應(yīng)答調(diào)控中的特性和體外毒理學(xué)評價發(fā)展需求，已研發(fā)出基于GADD45α分子調(diào)控機制的人源細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)，并已應(yīng)用于外源化合物的毒理學(xué)評價。該系統(tǒng)在體外遺傳毒性化合物檢測中具有高度特異性和良好的重復(fù)性，被國際生命科學(xué)學(xué)會健康與環(huán)境科學(xué)研究所［45］、英國食品消費品和環(huán)境化合物致突變委員會［46］及歐洲食品安全局［47］等國際機構(gòu)認可為一種有效的新化合物體外遺傳毒性評價工具。

基于GADD45α分子調(diào)控機制構(gòu)建的遺傳毒性檢測系統(tǒng)依據(jù)報告基因類型，可分為基于熒光蛋白基因表達發(fā)出綠色熒光的細胞GSHC（green screen human cells）檢測系統(tǒng)和基于熒光素酶發(fā)光原理發(fā)出藍色熒光的細胞BSHC（blue screen human cells）檢測系統(tǒng)。目前，這2種檢測系統(tǒng)均被應(yīng)用于外源化合物體外遺傳毒性評價。

2.1 GSHC檢測系統(tǒng)

GSHC檢測系統(tǒng)由Hastwell等［7］最初構(gòu)建，以GFP作為報告基因，將報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TK6細胞，以96孔板對外源化合物遺傳毒性進行評價。用該檢測系統(tǒng)對直接遺傳毒性化合物、非整倍體誘發(fā)劑、核苷酸合成抑制劑、拓撲異構(gòu)酶抑制劑和活性氧簇等34種在其他遺傳毒性檢測實驗中（Ames實驗、染色體斷裂實驗和小鼠淋巴瘤細胞實驗等）至少1項呈陽性結(jié)果的化合物進行評價。結(jié)果顯示，31種化合物具有遺傳毒性，其中11種GSHC檢測陽性的化合物在Ames實驗中呈陰性。同時應(yīng)用GSHC檢測系統(tǒng)檢測41種遺傳毒性陰性的化合物結(jié)果均顯示為陰性。應(yīng)用GSHC檢測系統(tǒng)對75種藥品進行遺傳毒性檢測并與其他遺傳毒性檢測方法結(jié)果進行比較分析。結(jié)果顯示，GSHC檢測系統(tǒng)的靈敏度高于Ames實驗，特異性高于體外哺乳動物細胞基因突變實驗，說明GSHC檢測系統(tǒng)對于遺傳毒性化合物具有良好的檢測靈敏度和特異性，可在藥物研發(fā)工作中用于尚無臨床安全評價數(shù)據(jù)的候選藥物對人體潛在遺傳毒性評價［48］。應(yīng)用GSHC檢測系統(tǒng)對8種化合物進行遺傳毒性評價，由4個實驗室分別進行，獲得了一致性的結(jié)果，說明GSHC檢測方法具備可操作性，實驗結(jié)果有良好的重復(fù)性［49］。

應(yīng)用GSHC檢測系統(tǒng)，在添加或不添加S9混合物的條件下，檢測歐洲替代方法驗證中心（Euro?pean Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM）規(guī)定的體外遺傳毒性檢測效果評估化合物列表中62種化合物?；衔锕卜譃?類。第1類化合物是體內(nèi)遺傳毒性陽性化合物，在哺乳動物細胞中檢測應(yīng)得到體外遺傳毒性陽性結(jié)果；第2類化合物是非DNA效應(yīng)化合物（包括非遺傳毒性致癌物），在哺乳動物細胞中檢測應(yīng)得到體外遺傳毒性陰性結(jié)果；第3類化合物是非DNA效應(yīng)化合物（包括非遺傳毒性致癌物）、代謝性毒物和其他化合物，在哺乳動物細胞中檢測應(yīng)得到體外遺傳毒性陰性結(jié)果，但是已有研究報道，其在高濃度或高水平細胞毒性效應(yīng)條件下遺傳毒性檢測呈陽性結(jié)果。GSHC檢測第1類化合物陽性結(jié)果占比90%，第2類化合物陰性結(jié)果占比96%，第3類化合物中76%呈現(xiàn)陰性結(jié)果。一方面說明GSHC檢測系統(tǒng)對于遺傳毒性化合物具有較好的檢測特異性，可有效控制檢測結(jié)果假陽性率［50］；另一方面提示該檢測系統(tǒng)不能應(yīng)用于非遺傳毒性致癌物的檢測。

在將16種化合物應(yīng)用于GSHC檢測系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)，盡管GADD45α參與DNA損傷應(yīng)答和細胞凋亡的細胞信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，但檢測結(jié)果顯示細胞凋亡誘導(dǎo)因素不會導(dǎo)致假陽性結(jié)果，說明GSHC檢測系統(tǒng)可有效區(qū)分遺傳毒性因素和凋亡刺激因素［51］。應(yīng)用GSHC檢測系統(tǒng)、SOS顯色反應(yīng)、Mini-Ames實驗和微核實驗對高德美公司22種化合物進行遺傳毒性早期篩選。GSHC檢測系統(tǒng)的靈敏度和特異性優(yōu)于SOS顯色反應(yīng)，檢測陽性結(jié)果與Mini-Ames實驗陽性結(jié)果一致，與微核實驗陽性結(jié)果90%一致，說明GSHC檢測系統(tǒng)在候選藥物體外遺傳毒性早期篩查工作中是一種合適且有效的篩選工具［52］。Johnson等［53］應(yīng)用GSHC檢測系統(tǒng)檢測到4種組蛋白脫乙?；敢种苿╊愃幬锞哂畜w外遺傳毒性效應(yīng)，推測該類藥物的抗腫瘤活性機制可能與其遺傳毒性作用相關(guān)，為該類藥物的研發(fā)和管理評價工作提供參考。

2.2 BSHC檢測系統(tǒng)

GSHC檢測系統(tǒng)應(yīng)用GFP作為報告熒光，但在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)某些化合物存在自發(fā)熒光。因此，干擾檢測結(jié)果或無法被GSHC檢測系統(tǒng)檢測［50］。將報告質(zhì)粒中GFP基因替換為高斯熒光素酶（Gaussia luciferase，GLu）基因構(gòu)建基于熒光素酶發(fā)光原理的BSHC檢測系統(tǒng)可有效解決這一問題。GLu報告熒光在特定底物存在時才會產(chǎn)生，由此可實現(xiàn)排除化合物自發(fā)熒光的檢測干擾。另一方面，因為報告熒光的產(chǎn)生需要底物存在，當(dāng)不加入底物時，檢測系統(tǒng)無熒光產(chǎn)生，由此可對細胞進行熒光標(biāo)記，實現(xiàn)細胞生長情況的準(zhǔn)確監(jiān)測，為應(yīng)用BSHC檢測系統(tǒng)時減少細胞使用數(shù)量提供可能，由此，BSHC檢測系統(tǒng)具有高通量檢測的可能［54］。

應(yīng)用BSHC檢測系統(tǒng)，在添加或不添加S9混合物的條件下，檢測ECVAM規(guī)定的體外遺傳毒性檢測效果評估化合物列表中60種化合物?；衔锕卜譃?類（與GSHC的3類相同，略）。BSHC檢測第1類化合物陽性結(jié)果占比80%，第2類化合物100%陰性結(jié)果，第3類化合物中67.7%呈現(xiàn)陰性結(jié)果。說明BSHC檢測系統(tǒng)可應(yīng)用于體外遺傳毒性化合物篩選，與GSHC檢測系統(tǒng)一樣具有較好的檢測特異性。應(yīng)用GSHC檢測系統(tǒng)時，第2類化合物中僅有乙二胺四乙酸三鈉呈現(xiàn)遺傳毒性陽性結(jié)果，這可能與螯合劑降低細胞內(nèi)金屬離子濃度的化學(xué)特性有關(guān)。應(yīng)用BSHC檢測系統(tǒng)時，第2類化合物均未出現(xiàn)遺傳毒性陽性結(jié)果，說明BSHC檢測系統(tǒng)不受螯合劑作用干擾。但在第3類化合物檢測結(jié)果中，BSHC陰性率低于GSHC檢測結(jié)果，分析可能的原因，一是與2種檢測方法發(fā)光原理不同相關(guān)，二是與檢測化合物的濃度有關(guān)［54］。

Simpson等［55］應(yīng)用384孔板BSHC檢測系統(tǒng)檢測GSHC檢測結(jié)果呈陽性或陰性化合物，并綜合分析已有研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用此檢測系統(tǒng)與96孔板的BSHC及GSHC的檢測結(jié)果一致。Etter等［56］應(yīng)用BSHC檢測系統(tǒng)對70種香料和香味化合物進行了體外遺傳毒性評價，發(fā)現(xiàn)相比于常規(guī)體外毒性檢測方法，BSHC檢測系統(tǒng)是一種有效的香料和香味化合物的安全性評價工具，可應(yīng)用于缺乏常規(guī)遺傳毒性實驗數(shù)據(jù)資料的化合物體外遺傳毒性檢測。

應(yīng)用GSHC和BSHC檢測系統(tǒng)評價20種非甾體抗炎藥物。結(jié)果表明，非甾體抗炎藥物不易誘導(dǎo)2種檢測系統(tǒng)得出假陽性結(jié)果。因為該類藥物不是遺傳毒性致癌物，由此說明這2種檢測系統(tǒng)在體外遺傳毒性評價中具有較高的特異性［46］。Scott等［57］應(yīng)用這2種檢測系統(tǒng)評價Ames實驗呈陽性結(jié)果的硼酸對真核生物的遺傳毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硼酸對于真核細胞僅有微弱或陰性的遺傳毒性效應(yīng)。因此，該研究建議，在將Ames實驗呈陽性結(jié)果的化合物評價結(jié)論推論到人體遺傳毒性效應(yīng)之前還需其他的體外或體內(nèi)評價數(shù)據(jù)。

基于GADD45α的分子調(diào)控機制構(gòu)建的遺傳毒性檢測系統(tǒng)，從最初的GSHC檢測系統(tǒng)到BSHC檢測系統(tǒng)，從96孔通量到384孔通量，檢測方法在不斷發(fā)展。用于構(gòu)建檢測系統(tǒng)的人源細胞不再局限于TK6。Xin等［58］構(gòu)建基于熒光素酶的報告質(zhì)粒，而后轉(zhuǎn)染A549細胞和HepG2細胞，應(yīng)用這2種攜帶報告質(zhì)粒的細胞系可有效檢測出MMS、苯并芘和甲醛等化合物的遺傳毒性效應(yīng)，并應(yīng)用此檢測系統(tǒng)實現(xiàn)快速、靈敏的檢測煉焦?fàn)t提取有機物遺傳毒性效應(yīng)。實驗結(jié)果表明，該檢測系統(tǒng)可在較低濃度下有效檢出不同類型環(huán)境中遺傳毒性物質(zhì)。相比A549細胞，將報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞所構(gòu)建的檢測系統(tǒng)在環(huán)境污染物遺傳毒性評價中更具應(yīng)用價值。

3 結(jié)語

GADD45α作為細胞生長阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因，參與細胞周期阻滯、細胞凋亡和細胞衰老等功能調(diào)控，在多種因素誘導(dǎo)細胞應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要生物學(xué)功能。深入研究GADD45α基因及其蛋白的調(diào)控功能，有助于揭示遺傳毒性因素誘導(dǎo)細胞應(yīng)答效應(yīng)的作用機制，為化合物的毒理作用機制研究提供理論基礎(chǔ)。基于GADD45α的細胞調(diào)控特性構(gòu)建的遺傳毒性檢測系統(tǒng)已被應(yīng)用于化合物體外遺傳毒性評價工作，該檢測系統(tǒng)對于遺傳毒性化合物檢測具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性，是一種有效的體外評價工具。但在檢測應(yīng)用中也可能出現(xiàn)某些受試化合物抑制熒光素酶發(fā)光反應(yīng)，從而呈現(xiàn)假陰性結(jié)果；受試化合物的細胞毒性過強時會影響檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性。通過對檢測系統(tǒng)報告質(zhì)粒進行改造，對轉(zhuǎn)染細胞進行更多的實驗篩選，全面優(yōu)化檢測體系，該檢測系統(tǒng)可在藥物篩選、環(huán)境污染物鑒定和化妝品安全性評價等領(lǐng)域，為化合物的體外毒理學(xué)評價提供新的策略。

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GADD45 α in genotoxicity test：molecular principles and research progress

JIN Xi，XI Chao，LIU Kai，LIU Jin
（Experimental Technology Center，College of Life Sciences，Beijing Normal University，Beijing 100875，China）

As a member of growth arrest and DNA damage inducible gene family，GADD45α participats in the regulation of cell cycle，cell senescence，cell survival and apoptosis.GADD45α plays a critical role in the responses to cell injury induced by a variety of factors including cell stress and genotoxic chemicals.Different transcription factors and proteins are involved in transcriptional regulation ofGADD45αgene.GADD45α protein has been implicated in the regulation of genomic stability related cellular responses through interaction with other proteins.Genotoxicity test systems based on the char?acteristics ofGADD45α in regulation of cell function，can be applied to the detection of potentially genotoxic compounds，which provides new ideas and methods about genotoxicity assessment.The molecular mechanism and research progress ofGADD45α in genotoxicity test are summarized in this article.

GADD45α；DNA damage；cell cycle；genotoxicity test

LIU Jin，Tel：（010）58808688，E-mail：liujin@bnu.edu.cn

R394.6

A

1000-3002-（2016）09-0989-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.09.013

Foundation item：The project supported by Fundamental Research Funds for the Central Universities（2013YB49）

2015-09-21 接受日期：2016-07-05）

（本文編輯：賀云霞）

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助（2013YB49）

靳 溪，女，博士，工程師，主要從事遺傳毒理學(xué)研究，E-mail：jinxi@bnu.edu.cn

劉 進，E-mail：liujin@bnu.edu.cn，Tel：（010）58808688