趙 紅，宋玉竹

（1.昆明理工大學生命科學學院，云南昆明 650500；2.中國科學院昆明動物研究所，云南昆明 650500）

醋酸鉛對人和小鼠瞬時受體電位A1離子通道的抑制作用

趙 紅1，2，宋玉竹1

（1.昆明理工大學生命科學學院，云南昆明 650500；2.中國科學院昆明動物研究所，云南昆明 650500）

目的 研究醋酸鉛對瞬時受體電位A1（TRPA1）通道的影響。方法 應用細胞內鈣熒光成像系統(tǒng)檢測原代培養(yǎng)的小鼠背根神經節(jié)（DRG）神經元上TRPA1（mTRPA1）通道和外源性表達在HEK293細胞上的人源TRPA1（hTRPA1）和mTRPA1通道介導的細胞外鈣內流；應用雙電極電壓鉗技術記錄外源性表達在爪蟾卵母細胞上的hTRPA1通道介導的電流。結果 醋酸鉛3.0和10.0 μmol·L-1對TRPA1介導的小鼠DRG神經元外鈣內流的抑制率分別為（36.7±4.1）%和（79.4±3.1）%；醋酸鉛濃度依賴性地抑制爪蟾卵母細胞上hTRPA1通道介導的電流，醋酸鉛0.3，1.0，3.0，10.0和30.0 μmol·L-1對+80 mV處電流的抑制率分別為（1.0±0.7）%，（11.6±0.8）%，（57.7±3.2）%，（93.6±2.6）%和（93.2±2.7）%，其IC50為2.4 μmol·L-1。結論 TRPA1通道是鉛的內源性作用靶點，低濃度醋酸鉛可抑制TRPA1通道。

醋酸鉛；背根神經節(jié)；神經元；瞬時受體電位A1通道；電壓鉗技術；鈣成像

鉛作為一種常見的工業(yè)毒物和環(huán)境污染物，對人體健康危害很大。人長期接觸低濃度鉛造成體內蓄積，會導致造血、泌尿、生殖、免疫、神經、心血管和消化等系統(tǒng)長期慢性的損傷。血鉛水平1 mg·L-1時即可表現(xiàn)出行為改變。鉛的神經毒性可導致包括感覺功能、運動能力、注意力、視聽記憶和情感狀態(tài)等在內的神經功能變化［1-2］。鉛主要影響中樞神經系統(tǒng)［3］，而外周神經系統(tǒng)是慢性鉛中毒最主要的靶器官之一［4］。鉛中毒性外周神經疾病的臨床研究也較多，在臨床鉛中毒案例中，有很大比例的患者出現(xiàn)了觸痛覺障礙［5］。

瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP)A1通道是位于外周神經系統(tǒng)上的離子通道，屬于TRP通道中的一種。TRPA1通道可被多種刺激性化學物質所激活，如異硫氰酸丙酯（propyl iso?thiocyanate，AITC）和甲醛等［6］，被認為是人體的一個化學感受器［7］。環(huán)境污染物中也有多種成分能激活TRPA1通道，如丙烯醛、直徑≤2.5 μm的可入肺顆粒物和某些重金屬離子等［8］。作為一個組織傷害感受器的通道，敲除TRPA1通道基因小鼠對傷害性化學刺激的感受顯著降低［9-10］，表明此通道與痛覺感受相關。此外，TRPA1通道還與溫度感受和機械感受相關，參與多種重要的生理和病理過程［11］。

鉛的神經毒性涉及到多種信號傳導系統(tǒng)和離子通道。鉛作用于神經元細胞上多種離子通道，如鉀、鈉和鈣通道等，但是關于鉛對TRPA1通道的作用國內外未見報道。本研究集體已觀察到鉛對小鼠背根神經節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）神經元上TRPA1通道的抑制作用。本研究進一步將小鼠TRPA1（mTRPA1）和人TRPA1（hTRPA1）通道在HEK293細胞和爪蟾卵母細胞中表達，研究醋酸鉛對TRPA1通道的作用。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、試劑和主要儀器

C57BL/6新生小鼠，中國科學院昆明動物研究所，動物許可證號：11401300006046；非州爪蟾，中國科學院上海生命科學學院贈送。HEK293細胞：中國科學院昆明動物研究所。mTRPA1和hTRPA1重組質粒，中國科學院昆明動物研究所楊建研究員實驗室。醋酸鉛（西隴化工股份有限公司）；DMEM和DMEM/F12（美國Corning公司）；膠原蛋白酶P（瑞士Roche公司）；Hanks平衡鹽溶液（HBSS，北京索萊寶科技有限公司）；胰蛋白酶和青/鏈霉素（德國BI公司）；小牛血清和胎牛血清（美國Gibco公司）；NaCl，KCl，MgCl2，HEPES和CaCl2（中國生工生物公司）；Fura-2，F(xiàn)-127和G418（美國Invitrogen公司）；轉染試劑LipofectamineTM2000（美國Life Technology公司）；AITC（美國Sigma公司）；辣椒素和三卡因（中國阿拉丁公司）。CSMZ-168型解剖鏡（德國Motic公司）；5702型水平離心機和5424R型超速離心機（德國Eppendorf公司）；IX71型鈣熒光成像系統(tǒng)（日本Olympus公司）；230V細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；LS-172細菌培養(yǎng)箱（菲律賓LabServ公司）；鈣離子熒光激發(fā)顯微系統(tǒng)（Flexstation3，美國Molecular Devices公司）；1440A雙電極電壓鉗（美國Axon公司）。

1.2 醋酸鉛溶液配制

稱取3.25 g醋酸鉛，溶于100 mL超純水中，配制成醋酸鉛100 mmol·L-1儲存液，室溫保存。臨用時用含鈣的生理溶液（mmol·L-1：NaCl 140，KCl 4.25，MgCl21.7，HEPES 8.5，CaCl22）進行相應的濃度梯度稀釋。

1.3 小鼠DRG神經元和HEK293細胞培養(yǎng)

分離C57BL/6新生小鼠DRG置于HBSS中，用膠原蛋白酶P 0.5 μg·L-1于37℃消化20 min；用胰蛋白酶2 g·L-1于37℃消化2 min；終止酶消化吹打分散后，按109L-1密度將神經元分入96孔板培養(yǎng)，48 h后進行鈣成像實驗。

HEK293細胞培養(yǎng)于含有10%小牛血清、青霉素100 kU·L-1和鏈霉素100 mg·L-1的DMEM，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。穩(wěn)轉系細胞在培養(yǎng)基中另外加入的抗生素G418 0.2 μg·L-1。

1.4 瞬時轉染［6］

采用脂質體瞬時轉染的方法。HEK293細胞傳代24 h之內，細胞密度為80%進行轉染。將hTRPA1和mTRPA1重組質粒1.5 μg與脂質體轉染試劑混合在DMEM中，靜置15~20 min后加入HEK293細胞中開始轉染，質粒轉染48 h后將細胞酶解后進行鈣熒光成像實驗。

1.5 細胞鈣熒光成像實驗［6］

DRG神經元和表達外源性通道的HEK293細胞在含有10 μmol·L-1Fura-2和0.04%F-127的無鈣生理溶液（mmol·L-1：NaCl 140，KCl 4.25，MgCl21.7，HEPES 8.5）中37℃染色1 h，無鈣生理溶液洗滌2次，加入上述含鈣生理溶液。DRG神經元在加入醋酸鉛3和10 μmol·L-12 min之后加入AITC 100 μmol·L-1，進行熒光檢測；陽性對照組為無醋酸鉛處理、直接加入AITC 100 μmol·L-1灌流。HEK293細胞直接進行熒光檢測。使用IX71型鈣熒光成像系統(tǒng)進行細胞鈣熒光采集，Metafluor軟件進行數(shù)據(jù)分析。通過檢測DRG神經元和HEK293細胞加入相應的離子通道特異性激動劑后熒光值的變化，確定醋酸鉛對特定離子通道的作用。

1.6 RNA制備

將hTRPA1重組質粒載體用限制性內切酶將其線性化；然后用PCR試劑盒將DNA進行純化；使用T7 RNA聚合酶體系（5×T7聚合酶緩沖液20 μL+0.1 mol·L-1二硫蘇糖醇10 μL+RNA酶重組核糖核酸酶抑制劑2 μL+25 mmol·L-1rNTPs 10 μL+ 40 U·μL-1T7 RNA聚合酶1 μL+m7G帽子10 μL+水47 μL，共100 μL）體外合成2 h，然后進行mRNA純化；最后用水將RNA溶解，置于-80℃保存。

1.7 卵母細胞制備和TRPA1通道表達及電流記錄

非洲爪蟾用3%三卡因麻醉，腹部取卵母細胞放入生理溶液OR2（mmol·L-1：NaCl 82.4，KCl 2.5，MgCl21，HEPES 5），加入0.15 μg·L-1膠原蛋白酶A振蕩消化1.5 h，OR2振蕩洗滌2次，每次15 min，放入含有青霉素100 kU·L-1和鏈霉素100 mg·L-1的生理溶液ND96（mmol·L-1：NaCl 96，KCl22.5，MgCl21，HEPES 5，CaCl21.8）中進行培養(yǎng)，顯微注射hTRPA1的RNA，每個卵母細胞50.6nL，表達后進行電流記錄。

雙電極電壓鉗電流記錄：記錄時電極電阻為2~ 10 MΩ，采樣頻率為5 kHz。鉗位電壓為-80 mV，給予指令電位從-100持續(xù)至+100 mV，時程為100 ms，用pClamp 10.2軟件處理資料。記錄液（mmol·L-1：NaCl 100，KCl 2.5，MgCl21，HEPES 5）。電極內液：KCl 3 mol·L-1。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗結果數(shù)據(jù)均以x±s表示，統(tǒng)計學處理用方差分析和配對t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。劑量效應曲線的擬合采用Logistic方程。

2 結果

2.1 醋酸鉛抑制小鼠DRG神經元TRPA1通道激動劑AITC引起的鈣離子內流

小鼠DRG神經元用Fura-2染色后進行鈣熒光檢測。據(jù)文獻報道，97%表達TRPA1通道的DRG神經元同時表達TRPV1［6］。在本研究條件下，給神經元依次灌流TRPA1通道特異性激動劑AITC和TRPV1激動劑辣椒素。結果發(fā)現(xiàn)，加入AITC后部分神經元的鈣熒光信號增強（圖1）；隨后加入辣椒素，這些對AITC起反應的神經元均對辣椒素有反應，對AITC有反應的神經元占到對辣椒素有反應神經元的（14.0±1.0）%。加入醋酸鉛后，對辣椒素有反應的神經元數(shù)量穩(wěn)定，而對AITC有反應的神經元數(shù)量明顯降低（P< 0.01）。加入醋酸鉛3和10 μmol·L-1后，對AITC有反應的神經元所占的比例由（14.0±1.0）%分別降至（8.9±1.12）%和（3.0±0.2）%，與陽性對照組之間存在顯著差異（P<0.01，n=5）。由此可見，醋酸鉛抑制了TRPA1通道特異性激動劑AITC引起的鈣熒光信號的增加，醋酸鉛濃度越高，抑制作用越強，提示DRG神經元上的TRPA1通道可能被醋酸鉛抑制。

Fig.1 Propyl isothiocyanate（AITC）induced external calcium influx in dorsal root ganglion（DRG）neurons inhibited by lead acetate（×200）.The representative ratio?metric calcium images of DRG neurons activated by AITC 100 μmol·L-1in the presence（lead acetate 10 μmol·L-1for 2 min）or absence（control）of lead acetate，the duration of AITC perfusion was 1 min.

2.2 醋酸鉛抑制外源性表達在HEK293細胞的TRPA1通道介導的鈣離子內流

mTRPA1通道基因在HEK293細胞過表達后進行活細胞鈣成像實驗。TRPA1通道特異性激動劑AITC 100 μmol·L-1可引起過表達mTRPA1通道的HEK293細胞內鈣熒光信號增加，醋酸鉛3 μmol·L-1可抑制mTRPA1通道介導的鈣信號（圖2A），抑制比例為（47.2±2.8）%。在過表達hTRPA1通道的HEK293細胞中得到類似結果。醋酸鉛對hTRPA1通道介導的鈣熒光信號具有濃度依賴性抑制作用（圖2B），醋酸鉛3.0，5.0，10.0和30.0 μmol·L-1對鈣熒光信號的抑制分別為（30.6±6.0）%，（34.9±4.6）%，（60.2±0.9）%和（62±1.1）%（n=5，P<0.01）。由此可見，醋酸鉛能抑制外源性表達在HEK293細胞上mTRPA1和hTRPA1通道介導的鈣離子內流，此結果與醋酸鉛對神經元的作用一致。

Fig.2 Inhibitory effect of lead acetate on mouse and human transient receptor potential A1（mTRPA1 and hTRPA1）mediated calcium influx，which was expressed in HEK293 cells.A：lead acetate 3 μmol·L-1on mTRPA1 mediated calcium influx（n=8）；B：lead acetate 10 μmol·L-1on hTRPA1 mediated calcium influx（n=6）.HEK293 cells were perfused with AITC 100 μmol·L-1for 1 min，and then perfused with AITC 100 μmol·L-1and lead acetate 10 μmol·L-1for 100 s.

2.3 醋酸鉛抑制外源性表達在爪蟾卵母細胞中的hTRPA1通道介導的電流

為了進一步定量分析醋酸鉛對hTRPA1通道的抑制作用，將hTRPA1通道過表達在爪蟾卵母細胞后運用雙電極電壓鉗技術進行電流記錄。AITC 30 μmol·L-1可引起hTRPA1通道介導的全細胞電流，加入醋酸鉛可抑制hTRPA1通道介導該電流。醋酸鉛抑制hTRPA1通道介導的電流呈濃度依賴性，濃度越高抑制比例越大。醋酸鉛10 μmol·L-1可將AITC 30 μmol·L-1引起的電流抑制85.9%（圖3A）。醋酸鉛0.3，1.0，3.0，10.0和30.0 μmol·L-1對+80 mV處電流的抑制率分別為（1.0±0.7）%，（11.6±0.8）%，（57.7±3.2）%，（93.6±2.6）%和（91.2±2.0）%（n≥4）。分析不同濃度醋酸鉛對hTRPA1介導的電流的抑制率，以Logistic方程擬合，得出醋酸鉛引起電流抑制的濃度效應曲線關系，其IC50為2.4 μmol·L-1（圖3 B）。

Fig.3 Inhibitory effect of lead acetate on hTRPA1-mediated current，which was exogenously expressed inXenopusoocytes.A：inhibitory effect of lead acetate 10 μmol·L-1on hTRPA1-mediated current in the presence of 30 μmol·L-1AITC，the duration of AITC and lead acetate perfusion were 50 s and 90 s，respectively，currents were recorded with the protocol（top）.After treatment with lead acetate 10.0 μmol·L-1，currents were decreased by 85.9%at+80 mV（medium）.B：concentrationresponse curve of lead acetate on hTRPA1-mediated current at+80 mV.The smooth curves were generated from fit of the data using a Logistic equation，and IC50is 2.4 μmol·L-1.x±s，n≥4.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，醋酸鉛對于外周神經系統(tǒng)的TRPA1通道具有抑制作用。據(jù)報道，包括Cr2+和Hg2+在內的多種二價重金屬離子對TRPA1通道有激活作用［12-14］。與這些重金屬離子作用不同的是，本研究結果則表明，醋酸鉛對TRPA1通道有抑制作用。首先，利用鈣熒光成像技術發(fā)現(xiàn)醋酸鉛抑制TRPA1通道的特異性激動劑AITC可引起的DRG神經元細胞外鈣內流產生鈣熒光。細胞鈣熒光是由于細胞外鈣離子流入細胞內與染料Fura-2結合所發(fā)出的熒光，鈣熒光被抑制表明小鼠DRG神經元上的TRPA1通道可能被醋酸鉛所抑制。為證明醋酸鉛對TRPA1通道的作用，在HEK293細胞中外源性表達mTRPA1和hTRPA1通道基因，檢測醋酸鉛對TRPA1通道介導的HEK293細胞鈣熒光的影響。結果表明，醋酸鉛的確能抑制mTRPA1和hTRPA1通道介導的HEK293細胞鈣熒光，該熒光被抑制表明醋酸鉛抑制了mTRPA1和hTRPA1通道介導的鈣離子內流。進一步在爪蟾卵母細胞中外源性過表達hTRPA1通道，對醋酸鉛抑制hTRPA1的作用進行進一步的定量分析。結果表明，醋酸鉛濃度依賴性地抑制hTRPA1通道介導的電流。以上結果均表明，醋酸鉛對TRPA1通道具有抑制作用。

TRPA1通道廣泛分布于DRG、三叉神經節(jié)和結狀神經節(jié)，這些神經廣泛支配著皮膚、呼吸道和胃腸道等組織器官。TRPA1通道的生理功能與疼痛和機械感受相關，其受到抑制可使皮膚對外界的機械感受能力下降。鉛是一種親神經性毒物，體內蓄積到一定水平可引起神經組織損害，鉛中毒重癥病例導致鉛麻痹，出現(xiàn)垂腕、垂足等癥狀。李穎等［5］臨床研究表明，在124例鉛中毒患者中，92例出現(xiàn)了觸痛覺障礙，比例高達74.2%。觸痛覺障礙表明外周神經系統(tǒng)與觸痛覺感受相關的途徑出現(xiàn)了障礙，TRPA1通道是外周神經系統(tǒng)與觸痛覺相關的離子通道。本研究結果表明，醋酸鉛對TRPA1通道具有抑制作用，提示醋酸鉛對TRPA1通道的抑制作用可能是其外周神經系統(tǒng)毒性的重要組成部分。

日常生活中接觸到的大氣、土壤、塵埃、水、裝飾材料、日用品、玩具和學習用品都可能含有鉛。鉛在人體內長期積累對人體危害極大，鉛抑制hTRPA1通道介導的電流的IC50僅為2.4 μmol·L-1，而人體內血鉛濃度>100 μg·L-1（約0.5 μmol·L-1），即視為鉛中毒，這個濃度接近鉛抑制TRPA1通道的濃度。

研究表明，我國人口的鉛中毒比例約10%。杜靜等［15］研究大慶地區(qū)兒童鉛中毒的比例，城區(qū)兒童血鉛濃度≥100 μg·L-1的比例高達21.1%，農村兒童則為18.4%，且隨著年齡的增長，鉛中毒的比例逐漸增高。隨著現(xiàn)代化工業(yè)、交通、運輸業(yè)的快速發(fā)展，鉛污染的危害可能會日益加重，研究鉛中毒機制從而尋求有效的治療方法已成為重要的課題。本研究發(fā)現(xiàn)，醋酸鉛對TRPA1通道有抑制作用，為醋酸鉛對TRPA1通道的抑制作用機制及其外周神經系統(tǒng)毒性作用的研究提供了實驗依據(jù)。

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Inhibitory effect of lead acetate on TRPA1 channel in mice and humans

ZHAO Hong1，2，SONG Yu-zhu1
（1.Academy of Life and Science，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China；2.Kunming Institute of Zoology，Chinese Academy of Sciences，Kunming 650500，China）

OBJECTIVE To investigate the inhibitory effect of lead acetate on transient receptor potential A1（TRPA1）channel.METHODS TRPA1-mediated calcium influx in mice dorsal root ganglion（DRG）neurons and HEK293 cells expressing nouse TRP1（mTRPA1）and human TRPA1（hTRPA1）wasrecorded by intracellular calcium imaging.TRPA1-mediated currents were detected by two-electrode voltage clamp.RESULTS Lead acetate 3.0 and 10.0 μmol·L-1inhibited external calcium influx in DRG neurons by（36.7±4.1）%and（79.4±3.1）%（n=5），respectively.The inhibitory effect of lead acetate on hTRPA1-mediated current was concentration-dependent.Lead acetate 0.3，1.0，3.0，10.0 and 30.0 μmol·L-1inhibited the amplitudes of currents by（1.0±0.7）%，（11.6±0.8）%，（57.7±3.2）%，（93.6± 2.6）%and（91.2±2.0）%（n≥4），respectively，with the IC502.4 μmol·L-1.CONCLUSION TRPA1 channel may be an endogenous target of lead.Lead acetate inhibits TRPA1 channel at a very low concentration.

lead acetate；dorsal root ganglion；neuron；transient receptor potential A1 channel；two-electrode voltage clamp；calcium imaging

SONG Yu-zhu，E-mail：yuzhusong@kmust.edu.cn

R995

A

1000-3002-（2016）09-0949-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.09.007

2015-11-07接受日期：2016-07-15）

（本文編輯：齊春會）

趙 紅，碩士研究生，主要從事神經毒理學研究。

宋玉竹，E-mail：yuzhusong@kmust.edu.cn