丁朋曉曾慶華羅 森李小琴王玲紅

1.遵義醫(yī)藥高等專科學校，貴州遵義 563006；2.遵義師范學院，貴州遵義 563006

4種藥用植物內(nèi)生放線菌的分離與初步研究

丁朋曉1曾慶華1羅 森1李小琴2王玲紅2

1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W校，貴州遵義 563006；2.遵義師范學院，貴州遵義 563006

目的分離并研究具有抑菌活性的藥用植物內(nèi)生放線菌。方法使用高氏一號培養(yǎng)基定向篩選藥用植物內(nèi)生放線菌，采用濾紙擴散法評價分離菌株的抑菌活性，進而通過形態(tài)學、生理生化等特征的分析對其進行鑒定。結果共分離得到63株內(nèi)生放線菌。對金黃色葡萄菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌等表現(xiàn)出選擇性抑菌作用的菌株有17株，其中Y6菌株抗菌譜較廣、抑菌作用較強。初步鑒定結果表明Y6菌株是鏈霉菌屬的一個成員。結論Y6對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好。

內(nèi)生放線菌；抑菌活性；分離；鑒定

植物內(nèi)生菌是指寄生在正常植物組織內(nèi)部，對植物不會引起明顯感染癥狀的微生物，主要包括真菌、細菌、放線菌。由于內(nèi)生菌對植物生長不產(chǎn)生明顯的影響，所以對內(nèi)生菌的研究容易被人忽視，人們最早研究內(nèi)生菌是19世紀中葉開始[1-2]，20世紀90年代以后，內(nèi)生菌的研究由內(nèi)生真菌逐漸擴大到內(nèi)生細菌、內(nèi)生放線菌。特別是1993年，有學者從短葉紫衫中分離出能夠產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌后，內(nèi)生菌的研究越來越被人重視[3]，有更多的學者從植物中分離出內(nèi)生放線菌，有些對植物病原菌有較好的拮抗作用，有些對人體病原菌有較好的拮抗作用[4-6]，內(nèi)生放線菌成為新的有生物活性的次生代謝產(chǎn)物的重要來源。資料表明，從植物內(nèi)生菌中得到的活性物質(zhì)有一半是未知的新化合物，而從土壤微生物中得到的新化合物只占其總量的38%[3]。所以，隨著土壤放線菌的大量研究，很難再發(fā)現(xiàn)新的生物活性物質(zhì)。內(nèi)生菌特殊的生存環(huán)境決定了它與外界自然環(huán)境中生長的微生物有不同的特性，故植物內(nèi)生放線菌的研究成為熱點。貴州有得天獨厚的地理氣候條件，藥用植物資源豐富，本文采集貴州多種藥用植物，對分離到的內(nèi)生放線菌進行初步鑒定及抗菌活性研究，旨在為藥用植物資源的利用開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 用于實驗的植物樣品魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）、麥冬（Ophiopogon japonicus）、馬齒莧（Portulaca deracea L.）、車前草（Plantago depressa Willd.）采自于貴州遵義、銅仁等地，裝入無菌袋中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 放線菌的分離和篩選采用高氏一號培養(yǎng)基[7]：可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，KNO31g，K2HPO40.5g，K2Cr2O70.05mg，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4。配置時，先用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，倒入少量的沸水中，在火上加熱，邊攪拌邊依次加入其它成分，溶化后補足水分到所需量，調(diào)PH值，滅菌。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基采用酵母膏-麥芽汁培養(yǎng)基：酵母粉4g，麥芽浸提物5g，葡萄糖4g，水1000mL，pH 7.2～7.4[8]。

供試菌株的活化用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.6。

1.1.3 供試菌株 革蘭陽性菌：金黃色葡萄 菌（Staphylococcus aureus）、表 皮 葡 萄 球 菌（Staphylococcus epidermidis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；革蘭陰性菌：大腸桿菌（Escherichia Coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）均由病原微生物實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 植物內(nèi)生放線菌的分離 將剛滅菌好的高氏一號培養(yǎng)基，待溫度降至55℃左右時，按照75.0mg/L重鉻酸鉀，100.0mg/L制霉菌素，20.0mg/L萘啶酮酸加入此培養(yǎng)基，用以抑制雜菌生長，充分搖動混勻后將培養(yǎng)基傾注到無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，20W紫外燈照射30min后放置4℃?zhèn)溆肹9]。

取采摘的新鮮植物先用清水沖洗去表面泥沙，再用加有洗滌劑的水浸洗15min，清洗過程中盡量不弄傷葉片，待植物稍干后取其根、莖、葉分別剪成1cm的小段，各稱重5g，在75%酒精溶液里浸泡5min，無菌水沖洗5次，0.1%升汞溶液浸泡根、莖、葉三個部位都設置不同的侵泡時間2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0min，最后無菌水沖洗4～5次，晾干。將其分別置于無菌研缽中，加入10mL無菌水研碎成汁液，靜置15min。將根、莖、葉汁液分別取100μL懸液涂于高氏一號平板培養(yǎng)基內(nèi)，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3周，觀察培養(yǎng)基上菌落生長情況。生長出的菌株用平板劃線分離法進一步純化菌落，挑取肉眼觀察形態(tài)有差異的菌落進行純培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 植物表面消毒的檢測 采用漂洗液檢驗法，取最后一次的洗滌水300μL涂布在高氏一號培養(yǎng)基上。每個樣品重復3次，于28℃，培養(yǎng)1～4周，若培養(yǎng)基上均無菌落出現(xiàn)，表明植物材料表面消毒徹底[10]。

1.2.3 供試菌株稀釋度的確定 將供試菌株用接種環(huán)取一環(huán)放到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30℃，培養(yǎng)1d。取1mL放入裝有9mL無菌水的試管中配成濃度為10-1的細菌懸浮液，依次配出濃度梯度為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的細菌懸浮液，吸取10-3、10-4、10-5和10-6菌懸液100μL分別涂布到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，每個濃度3個重復，置于30℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h后觀察平板上細菌生長情況，選擇長出的菌落剛好覆蓋平板時的濃度進行抑菌試驗。

1.2.4 內(nèi)生放線菌抑菌活性檢測 用接種環(huán)取少量分離純化到的放線菌接種于含30mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，置于28℃，180r/min搖床上振蕩培養(yǎng)7～14d，培養(yǎng)液經(jīng)4000r/min，4℃離心15min，上清液置4℃冰箱備用。取上述適宜稀釋度的菌懸液100μL加入到50℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中混勻，待培養(yǎng)基凝固后，采用濾紙擴散法[11]檢測所分離放線菌對供試菌株的拮抗作用，濾紙蘸取無菌水作為空白對照。置于37℃培養(yǎng)箱，24h后觀察結果，發(fā)酵液活性高的會抑制細菌的生長形成抑菌圈，測量直徑大小。每個樣品做3個重復。

1.2.5 內(nèi)生拮抗放線菌的初步鑒定 將具拮抗作用的內(nèi)生放線菌篩選出來，用劃線法接種到高氏一號培養(yǎng)基上，在無菌條件下將滅菌的蓋玻片以45°角扦插在接種線上，每個平板扦插4～5片，28℃下培養(yǎng)10d左右，有放線菌的一面朝上，將蓋玻片置于顯微鏡下，觀察放線菌、基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、孢子絲鏈特征和生理生化特征進行初步鑒定[12]。

2 結果

2.1 表面消毒效果檢測

植株不同部位要想達到徹底消毒效果，所需要的時間略微有差異，根部徹底消毒需要的時間比葉、莖稍長。不同植物所需時間也略有差異，魚腥草、麥冬≥5min，馬齒莧≥5.5min，車前草≥4.5min時，基本無雜菌生長，見表1，但是考慮到一方面消毒時間久可能會同時殺死內(nèi)生菌，影響內(nèi)生放線菌的分離；另一方面，為了方便實驗操作，所以4種植物最佳消毒時間定為5.5min。

2.2 內(nèi)生放線菌的分離

對從貴州不同地區(qū)采集到的魚腥草、馬齒莧、車前草、麥冬4種植物根、莖、葉通過表面消毒檢測，將最后一次洗滌液涂布培養(yǎng)基上無菌落長出，從而證明分離到的菌株是來源于植物內(nèi)部。4種植物共得到了63株內(nèi)生放線菌，其中魚腥草21株、馬齒莧23株、車前草12株、麥冬7株。植物不同部位內(nèi)生放線菌的分布有差異，從根部共分離到32株，占得到放線菌總數(shù)的50.79%；從莖中共分離到24株，占38.10%；從葉中共分離到7株，占11.11%。植物不同組織部位分離到的菌株數(shù)量由多到少依次是：根＞莖＞葉。見表2。

表1 植物表面消毒結果

表3 4種藥用植物內(nèi)生放線菌對5種供試菌有抑菌活性的菌株數(shù)

表2 植物內(nèi)生放線菌分離的菌株數(shù)

2.3 內(nèi)生放線菌的抗菌活性

采用濾紙擴散法測定分離到的內(nèi)生放線菌對供試菌的抑菌活性，不同植物內(nèi)生放線菌能對五種供試菌產(chǎn)生抑菌作用的菌株數(shù)有差異，見表3。4種藥用植物中共分離到內(nèi)生放線菌63株，對供試菌有不同程度抑菌活性的菌株有17株，約占分離菌株總數(shù)的27.98%。其中8株對金黃色葡萄球菌有抑菌作用，2株對表皮葡萄球菌有抑菌作用，3株對枯草芽孢桿菌有抑菌作用，7株對大腸桿菌有抑菌作用，1株對銅綠假單胞菌有抑菌作用，見表4。

Y6、C4、C12抑菌普相對較廣，其他菌株對供試菌有選擇性的抑菌作用。其中Y6表現(xiàn)出較好的抑菌活性，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在11mm～16mm，對大腸桿菌的抑菌圈直徑在9mm～12mm，其余16株菌株對供試菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑小于10mm。

表4 對5種供試菌有抑菌活性的菌株統(tǒng)計

2.4 有抑菌活性菌株的初步鑒定

2.4.1 形態(tài)特征觀察 在抗菌活性檢測的基礎上，選擇抑菌范圍廣，抑菌圈直徑較大的Y6菌株進行初步鑒定研究。將Y6菌株培養(yǎng)在高氏一號培養(yǎng)基上菌落呈圓形，較規(guī)則，早期菌落淺灰色，隨著培養(yǎng)時間延長菌落顏色加深，通過光學顯微鏡觀察基內(nèi)菌絲淺褐色、褐色，氣生菌絲發(fā)達，淺黃色或白色，菌絲比較豐富，孢子鏈直或偶有螺旋，見圖1～2。

圖1 Y6生長在高氏一號培養(yǎng)基上形態(tài)（10×40）

圖2 Y6生長在高氏一號培養(yǎng)基上形態(tài)（10×100）

2.4.2 生理生化特征 Y6在對C源的利用上，能利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖，但不能利用半乳糖、木糖、肌醇；能夠液化明膠，使牛奶先凝固后液化，可以水解淀粉，能夠分解硫化氫，但不能水解纖維素。

通過形態(tài)特征和生理生化特征，結合《放線菌的分類和鑒定》初步確定Y6為鏈霉菌屬。

3 討論

植物內(nèi)生放線菌分離時，消毒處理中設置時間梯度，既保證徹底殺死植物外表面雜菌，又保證分離到更多內(nèi)生菌，故最后一步用0.1%升汞對根、莖、葉進行不同時間消毒，消毒時間越長，長出雜菌的幾率越小，消毒越徹底。不同植物不同組織設置了不同的消毒時間，最終找到每種植物組織的最佳消毒時間，提高內(nèi)生菌分離概率。本研究以藥用植物的根、莖、葉組織為材料，從4種植物中共得到了63株內(nèi)生放線菌，不僅根部分離到的內(nèi)生菌數(shù)量最多，而且根部徹底消毒需要的時間比葉、莖稍長，除了與植物各器官組織結構和生理代謝不同外，也可能是與根部生長在有機質(zhì)豐富的土壤中有關[13]，導致根部微生物種類數(shù)量比莖、葉多有關。

抗菌活性檢測中，分離到的內(nèi)生放線菌中有17株對供試菌有選擇性的抑菌作用。魚腥草分離到抑菌活性菌株相對較多，主要集中在對革蘭陽性菌的抑菌作用。Conn曾報道，植物內(nèi)生放線菌與植物抗性存在著一定的關聯(lián)[14]，而魚腥草含魚腥草素，對金黃色葡萄球菌、肺炎球菌等多種革蘭陽性菌均有不同程度的抑制作用[15]，所以懷疑魚腥草內(nèi)生放線菌的抑菌特點與魚腥草的中藥特性有相關性。17株活性菌株中，對2種以上供試菌有選擇性抑菌活性的內(nèi)生放線菌有3株，其中魚腥草內(nèi)生放線菌Y6抑菌活性相對較強，具有潛在的研究意義。通過抗菌活性檢測，其發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好，這對深入開發(fā)藥用植物資源提供了參考，但是菌株發(fā)酵液的抗菌成分的鑒定與分離有待下一步研究。通過高氏一號培養(yǎng)基上生長特征觀察、生理生化反應觀察，初步確定Y6為鏈霉菌屬。

植物內(nèi)生放線菌來源特殊，該領域下的內(nèi)生放線菌的研究還是一個比較欠缺的領域[16]。目前，雖然人們開始越來越多的研究植物內(nèi)生放線菌，但是主要應用在生防制劑上[17]，故植物內(nèi)生放線菌還有很大的研究潛力與研究廣度。本研究中雖然篩選到了63株對供試菌有選擇性抑菌作用的菌株，最終卻只有1株相對具有較好的抑菌效果，說明本實驗的研究方法還有待進一步改進，以提高有效菌株的分離率。

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Separation of four kinds of medicinal plant endophytic actinomycetes

DING Pengxiao1ZENG Qinghua1LUO Sen1LI Xiaoqin2WANG Linghong2
1.Zunyi Medical College,Zunyi 563006,China;2.Zunyi Normal College,Zunyi 563006,China

ObjectiveTo separate and explore the endophytic actinomycetes of medicinal plants with antibacterial activity.MethodsGao 1 medium was used to directly selected the medicinal plant endophytic actinomycetes. Filter paper diffusion method was used to evaluate the antimicrobial activity of isolated strains.It was identified by morphological, physiological and biochemical characteristics.ResultsA total of 63 strains of endophytic actinomycetes were isolated.There were 17 strains with selective antibacterial activity on staphylococcus aureus,staphylococcus epidermidis,bacillus subtilis,escherichia coli,pseudomonas aeruginosa etc.Among them, the antibacterial spectrum of Y6 strain was broad,and it had strong antibacterial effect. Preliminary identification showed that the Y6 strain was a member of the genus Streptomyces.ConclusionThe inhibitory effect of Y6 on Staphylococcus aureus is better.

Endophytic actinomycetes bacteria;Bacteriostatic activity;Separation;Appraisal

S567

B

2095-0616（2016）21-63-05

2016-08-06）

貴州省遵義市科技計劃項目[遵市科合社字（2012）31號]。