高 雁 張 爽 宋澤璧 高 慧

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600

鹽知母化學(xué)成分α-葡萄糖苷酶抑制作用研究

高 雁 張 爽 宋澤璧 高 慧▲

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600

目的對(duì)鹽知母化學(xué)成分α-葡萄糖苷酶抑制作用進(jìn)行比較研究，以探討鹽知母降血糖作用的增效原理，為后期研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。方法采用高效液相色譜法，以PNPG（對(duì)硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷）為底物比較鹽知母化學(xué)成分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。結(jié)果從鹽知母氯仿層中分離得到的順-扁柏樹脂酚，對(duì)α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制作用，且優(yōu)于阿卡波糖的作用。同時(shí)芒果苷、知母皂苷AⅢ等鹽知母的增量成分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用也相對(duì)較強(qiáng)。結(jié)論鹽知母活性部位氯仿層分離物，順-扁柏樹脂酚對(duì)α-葡萄糖苷酶具有較高的抑制活性，提示鹽知母活性部位分離物順-扁柏樹脂酚在抗糖尿病產(chǎn)品開發(fā)方面具有很好的應(yīng)用前景。

鹽知母；化學(xué)成分；α-葡萄糖苷酶；糖尿病

中藥知母的來源為百合科植物知母（Anemarrhenaasphode-loidesBge）的干燥根莖，傳統(tǒng)功效為清熱瀉火、滋陰潤(rùn)燥[1]。鹽炙法是知母的主要炮制方法，鹽知母為歷版中國(guó)藥典所收載，是知母的主流炮制品種。知母鹽炙后能夠符合“用鹽走腎臟”的傳統(tǒng)炮制理論，能夠引藥入腎經(jīng)，滋陰降火的作用得到增強(qiáng)。本課題組在前期研究鹽知母的藥效作用時(shí)，報(bào)道過知母能夠降低高血糖大鼠的血糖，且鹽知母作用更為顯著[2-3]，并對(duì)鹽知母進(jìn)行化學(xué)成分研究，發(fā)現(xiàn)鹽炙后知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷含量升高。對(duì)鹽知母活性部位進(jìn)行化學(xué)成分研究[4]，分離得到順-扁柏樹脂酚、構(gòu)樹寧B、牡荊素[5]。

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝紊亂性疾病。血糖主要來源于食物中的糖類和碳水化合物，其在α-葡萄糖苷酶的作用下被催化水解成單糖，可被小腸吸收。由此可見，α-葡萄糖苷酶是血糖產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，有效抑制其作用，可減緩糖尿病患者餐后血糖值[6-8]。目前，α-葡萄糖苷酶抑制劑已廣泛應(yīng)用于臨床。α-葡萄糖苷酶抑制劑通過可逆地占據(jù)α-葡萄糖苷酶與碳水化合物的結(jié)合位點(diǎn)，抑制α-葡萄糖苷酶水解多糖為單糖，從而有效抑制糖尿病患者的餐后血糖升高[9-10]，使患者血糖維持在一定水平，改善血糖穩(wěn)定指數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)以鹽知母降血糖活性部位氯仿層分離得到的化合物，順-扁柏樹脂酚、構(gòu)樹寧B，以及前期分離得到的增量成分知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ和現(xiàn)有的芒果苷、新芒果苷、異芒果苷、牡荊素、知母皂苷BⅢ、知母皂苷E等化學(xué)成分從α-葡萄糖苷酶抑制角度，開展體外降血糖比較研究。以期從中尋找新的α-葡萄糖苷酶抑制劑。研究結(jié)果將對(duì)闡明鹽知母降血糖增效原理提供科學(xué)內(nèi)涵，為今后鹽知母臨床用藥提供指導(dǎo)。

1 儀器與方法

1.1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司，Agilent 1100型）；PH酸度計(jì)（上海鵬順科學(xué)儀器有限公司）；十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士METTLER，AE240型）；電熱恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）。

知母藥材購(gòu)于西陵知母道地產(chǎn)區(qū)（河北省易縣），經(jīng)對(duì)照藥典鑒定為知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖；鹽知母按前期優(yōu)選的工藝自行炮制。芒果苷對(duì)照品（批號(hào)111607-200402），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度≥98%；新芒果苷對(duì)照品（批號(hào)20131214）、異芒果苷對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：20121221）；知母皂苷AⅢ（批號(hào)13042609）、知母皂苷BⅡ（批號(hào)13120910）、知母皂苷BⅢ（批號(hào)13121110）、知母皂苷E（批號(hào)13090301）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%；順-扁柏樹脂酚、構(gòu)樹寧B，自制，純度≥98%；牡荊素，自制，純度≥98%；阿卡波糖（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)：BJ09769，）；對(duì)-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，上海源葉生物技術(shù)有限公司）；對(duì)-硝基苯酚、牛血清白蛋白純度≥95%、α-葡萄糖苷酶均購(gòu)自sigma公司；HPLC級(jí)甲醇（天津科密歐）、HPLC級(jí)乙腈（天津科密歐）、娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液制備 精密稱取適量的新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、牡荊素、知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷E、順-扁柏樹脂酚、構(gòu)樹寧B、阿卡波糖的對(duì)照品，分別配制成濃度為0.270mg/mL、0.233mg/mL、0.234mg/mL、0.207mg/mL、0.287mg/mL、0.496mg/mL、0.192mg/ mL、0.560mg/mL、0.246mg/mL、0.214mg/mL、0.203mg/mL的樣品溶液。

1.2.2 反應(yīng)溶液的制備 磷酸鹽緩沖液（pH6.8）：稱取K2HPO4·3H2O、KH2PO4適量（7.6834g、4.5819g），用超純水溶解，調(diào)整pH至6.8，然后定容500mL，置冰箱保藏。

α-葡萄糖苷酶：取α-葡萄糖苷酶，用含0.2% BSA上述磷酸緩沖溶液溶解，配制成α-葡萄糖苷酶儲(chǔ)備溶液（0.3U/mL）。

PNPG溶液：精密稱取適量 PNPG，用少許緩沖溶液溶解，然后定容于10mL，置冰箱保藏。

Na2CO3終止劑：稱取2.162g Na2CO3，用少許超純水溶解，然后定容于100mL。

1.2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定[11-14]取1.5mL離心管中，向其中加入10μL磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.8）和30μL α-葡萄糖苷酶，振蕩混勻，于37℃孵育20min，加入40μL PNPG（8.0mmol/L）開啟反應(yīng)，振蕩混勻，于37℃反應(yīng)30min，之后加入80μL Na2CO3（0.2mol/L）終止反應(yīng)，再加水稀釋，至500μL，振蕩混勻，過濾。采用HPLC法，檢測(cè)產(chǎn)物中PNP的濃度，計(jì)算α-葡萄糖苷酶的活性。

取1.2.1中各樣品溶液作為待測(cè)樣品，以相同體積代替緩沖溶液加入到反應(yīng)體系中。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（以等體積的Acarbose代替磷酸鹽緩沖溶液）、空白對(duì)照（以等體積的磷酸鹽緩沖溶液代替酶液），測(cè)試各個(gè)單體成分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性，計(jì)算抑制率：抑制率=A-B/A×100%式中，A為不加待測(cè)樣品時(shí)PNP的濃度（扣除相應(yīng)空白，mmol/L）；B為加入待測(cè)樣品后PNP的濃度（扣除相應(yīng)空白，mmol/L）。

1.2.4 HPLC法測(cè)定PNP的含量 色譜條件：Ecosil色譜柱（4.6mm×250mm，120-5-C18AQ，5μm），流動(dòng)相為乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫條件為：0～8min，20%～29%A；8～14min，29%～80%A；14～18 min，80%～20%A；18～28min，20%～20%A；以314nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為室溫。

PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線：精確稱取PNP標(biāo)準(zhǔn)品置50mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖溶液超聲溶解后，加磷酸鹽緩沖溶液至刻度，制備PNP儲(chǔ)備液（5.68mmol/L）。將儲(chǔ)備液稀釋成1.136mmol/L、0.568mmol/L、0.284mmol/L、0.170mmol/L、0.0568mmol/L、0.0284mmol/L、0.0170 mmol/L，按照上述梯度洗脫條件，分別進(jìn)樣，以所得峰面積為縱坐標(biāo)，以PNP濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照上述色譜條件，各待測(cè)樣品反應(yīng)溶液分別進(jìn)樣，根據(jù)峰面積計(jì)算濃度。

2 結(jié)果

2.1 PNP標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

求得PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=36057x+459.08，r=0.9993， 說 明 PNP在0.017～1.136mmol/L與峰面積之間呈現(xiàn)的線性關(guān)系。

2.2 鹽知母化學(xué)成分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：各化合物中以從鹽知母活性部位中分離得到的順-扁柏樹脂酚對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用最強(qiáng)，且明顯優(yōu)于阿卡波糖的作用。同時(shí)芒果苷、知母皂苷AⅢ等鹽知母的增量成分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率也相對(duì)較高。見表1。

表1 各成分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率

3 討論

目前，評(píng)價(jià)藥物降血糖作用的指標(biāo)主要為血糖以及胰島素水平。血糖水平評(píng)價(jià)主要包括體內(nèi)空腹血糖、糖耐量以及體外酶抑制兩方面。本實(shí)驗(yàn)采用PNPG為底物的酶抑制劑篩選模型進(jìn)而評(píng)價(jià)鹽知母化學(xué)成分的降血糖作用，該方法快捷、簡(jiǎn)單易于操作。

合成類藥物包括阿卡波糖、伏格列波糖等α-葡萄糖苷酶抑制劑已廣泛應(yīng)用于臨床[15]。但由于存在一些副作用。所以，更多的研究著重于從中藥中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑，為了尋找到更安全、高效的糖尿病治療藥。本實(shí)驗(yàn)對(duì)現(xiàn)有的鹽知母化學(xué)成分進(jìn)行酶抑制作用研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從鹽知母降血糖活性部位氯仿層中分離得到的順-扁柏樹脂酚，對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用最強(qiáng)。同時(shí)芒果苷、知母皂苷AⅢ等對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率也相對(duì)較高。這就提示鹽知母降血糖作用顯著增強(qiáng)可能與鹽知母的新增成分及增量成分有關(guān)，在以后工作中將進(jìn)一步予以研究。因此，本實(shí)驗(yàn)為研究鹽知母化學(xué)成分酶抑制劑提供了理論依據(jù)，為鹽知母作為糖尿病治療藥的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)參考。

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Study on inhibitory effect of chemical componentsin the salt AnemarrhenaeRhizoma on α-glucosidase

GAO Yan ZHANG Shuang SONG Zebi GAO Hui
School of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China

ObjectiveTo compare the inhibitory effect of chemical componentsin the salt AnemarrhenaeRhizoma on α-glucosidase, to explore itsthe synergistic effects ofhypoglycemic mechanism, and to provide the scientific basis for later research.MethodsWith the method of HPLC, PNPG was used as substrate to compare the α-glucosidase inhibition effect between the differentchemical componentsin the salt AnemarrhenaeRhizoma.ResultsThe separation from the salt AnemarrhenaeRhizoma by chloroform-cis-hinokiresionl had a strong inhibitory effect onαglucosidase, and it was better than the positive control group acarbose. The incremental compontensin the salt AnemarrhenaeRhizomalike mangiferin and timosaponin AⅢ groups showed a certain inhibition.ConclusionThe extraction of the salt processed AnemarrhenaeRhizoma by chloroform-cis-hinokiresionl can inhibit α-glucosidase activity obviously, which reminds us it has good application prospects in product development of antidiabetics.

SaltAnemarrhenaRhizoma;Chemical components;α-glucosidase;Diabetes

R284

B

2095-0616（2016）21-60-03

2016-08-02）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81102810）；遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（201320165）。

▲通訊作者