劉 峰 董少紅吳美善 梁瑞娟 熊 瑋 劉華東 陳科奇 林 峰

深圳市人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣東深圳 518100

紫檀芪通過PI3K-AKT信號(hào)途徑抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡

劉 峰 董少紅▲吳美善 梁瑞娟 熊 瑋 劉華東 陳科奇 林 峰

深圳市人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣東深圳 518100

目的探討紫檀芪對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，以及對(duì)磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路的影響。方法乳鼠心肌細(xì)胞經(jīng)過缺氧/復(fù)氧（H/R）處理，再模擬心肌缺血再灌注損傷。實(shí)驗(yàn)分為正常組，模型組（H/R），紫檀芪組（H/R+0.5，5，50μmol/L紫檀芪）。MTT法檢測各組心肌細(xì)胞活力；倒置顯微鏡拍照檢測各組心肌細(xì)胞形態(tài)；Annexin V-FITC/PI 流式雙染法檢測各組心肌細(xì)胞凋亡； Western blot分析PI3K/AKT激活狀況。結(jié)果與正常組比較，模型組中心肌細(xì)胞皺縮，變圓變亮，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡率顯著提高，PI3K表達(dá)量及AKT磷酸化程度降低，差異均具有顯著性（P＜0.05）；與模型組比較，5，50μmol/L紫檀芪組中心肌形態(tài)恢復(fù)，細(xì)胞活力上升，PI3K表達(dá)量提高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.5，5，50μmol/L紫檀芪組心肌細(xì)胞凋亡程度下降，AKT磷酸化水平上升，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論紫檀芪可抵抗缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡，PI3K/AKT信號(hào)被激活是其作用表達(dá)的主要方式。

紫檀芪；乳鼠心肌細(xì)胞；缺氧/復(fù)氧；細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是缺血性心肌損傷的重要表現(xiàn)之一，要使心臟功能得到改善，始終保護(hù)缺血/心臟再灌注，心肌細(xì)胞減少凋亡數(shù)量等，需要激活PI3K-Akt通路[1-3]。紫檀芪Pterostilbene （Pte）具有抗真菌、抗細(xì)胞增殖，預(yù)防氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗炎、降血脂等作用，可改善缺血再灌注損傷[4-5]。心肌細(xì)胞凋亡（尤其是缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡）與紫檀芪相關(guān)的研究數(shù)據(jù)較少，因此進(jìn)行了本次研究，闡明Pte對(duì)心肌IR損傷的作用（保護(hù)作用及可能機(jī)制作用），為更好的治療心肌IR損傷提供了可行的重要依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料

南方醫(yī)科大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室提供了本次研究的所有材料與實(shí)驗(yàn)儀器。Wistar乳鼠（出生12d）100只，雌雄不做限制。美國Gibco公司提供本次實(shí)驗(yàn)所需胰蛋白酶及胰脫氧核糖核酸酶，杭州四季青生物工程材料有限公司提供本次實(shí)驗(yàn)的胎牛血及四甲基偶氮唑鹽（ MTT）。中國?？寺∩锕咎峁┍敬螌?shí)驗(yàn)的DMEM培養(yǎng)基。瑞士羅氏公司提供本次實(shí)驗(yàn)的青霉素及鏈霉素。抗AKT，p-AKT，PI3K，GADPH單克隆抗體購自購于美國Santncruz公司。紫檀芪，購于日本富士株式會(huì)社。本次研究進(jìn)行前，已經(jīng)被動(dòng)物研究委員會(huì)準(zhǔn)許，研究過程中所選擇的動(dòng)物都受到了人道待遇（依照美國衛(wèi)生部頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和關(guān)愛指南》，NIH頒布86-23，1986年修訂）批。

1.2 方法

1.2.1 心肌細(xì)胞分離培養(yǎng) 新生乳鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)參考已有的文獻(xiàn)記載。具體措施為，單個(gè)細(xì)胞被從Wistar乳鼠（出生12d）的心肌碎片（1～2mm3）中分離出來，分離環(huán)境為4℃，應(yīng)用材料為胰蛋白酶（0.06%），在室溫37℃下進(jìn)行消化（應(yīng)用膠原酶）45min。之后在同樣室溫下進(jìn)行培養(yǎng)1h，培養(yǎng)液為DMEM液[成分為氟脫氧鳥苷、HEPES、胎牛血清FBS、青霉素、鏈霉素，劑量（濃度）分別為2μmol/L、15mmol/L、5%、100U/mL、100mg/mL]，培養(yǎng)結(jié)果為使非心肌細(xì)胞貼壁。細(xì)胞培養(yǎng)瓶里（25cm2）存放上清中心肌細(xì)胞懸液，培養(yǎng)瓶密度在1×105細(xì)胞數(shù)/ cm2。培養(yǎng)環(huán)境為37℃，濕度為5%CO2恒定，培養(yǎng)液應(yīng)用10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，進(jìn)行3d的培養(yǎng)。

1.2.2 缺氧復(fù)氧損傷模型（H/R）的建立及分組 缺氧復(fù)氧損傷模型（H/R）的建立是對(duì)缺氧溶液與復(fù)氧溶液的制備，并且制備過程中應(yīng)用Koyama等。缺氧為原代乳鼠心肌細(xì)胞的正常培養(yǎng)液被缺氧液置替換，并被封閉20min；復(fù)氧為缺氧液又被復(fù)氧液替換，并進(jìn)行15min的培養(yǎng)。分為5組，各（20只）：A組：正常對(duì)照組（Control）；B組： H/R組；C組：H/R+LPte組；D組：H/R+MPte組； E組： H/R+HPte組。

1.2.3 MTT法（細(xì)胞活力檢測） 細(xì)胞濃度進(jìn)行調(diào)整（在乳鼠心肌細(xì)胞處于生長對(duì)數(shù)期被消化之后），96孔板進(jìn)行細(xì)胞接種，給藥方法按照分組情況進(jìn)行1d的培養(yǎng)，將培養(yǎng)結(jié)果倒置在纖維鏡下進(jìn)行觀察并拍照，最后進(jìn)行OD值測定[4h培養(yǎng)（每個(gè)孔板加MTT（ 5mg/mL） 20L），將上清去除，再進(jìn)行10min培養(yǎng)（每個(gè)孔板加DMSO 150 L）]。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測方法 培養(yǎng)皿（35mm）接種上4×105個(gè)細(xì)胞（每孔含量），并將個(gè)細(xì)胞進(jìn)行消化和離心，選擇3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)（24，48，60h）進(jìn)行細(xì)胞收集。常規(guī)消化，PBS洗滌，離心5min，收集細(xì)胞； 進(jìn)行室溫下避光反應(yīng)（5～15min），反應(yīng)溶液按順序加入Binding Buffer 500L 懸浮細(xì)胞、Annexin V-FITC 5L、與PI 5L混勻，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測1小時(shí)內(nèi)的細(xì)胞凋亡數(shù)量。

1.2.5 Westernblot檢測 消化心肌細(xì)胞（處于生長對(duì)數(shù)期的乳鼠），調(diào)整細(xì)胞濃（8×103個(gè)細(xì)胞/ mL），每孔1×104個(gè)心肌細(xì)胞接種于96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞。收集細(xì)胞樣本，預(yù)冷PBS洗3次，蛋白提取采用的方法為細(xì)胞裂解法，上樣緩沖液被加在相同含量蛋白中，使每組蛋白上樣量均為30μg，蛋白電泳在凝膠中進(jìn)行（4%～12% SDS-PAGE），最終聚偏氟乙烯膜PVDF上會(huì)有蛋白轉(zhuǎn)移過來，封閉2h的TBS-T緩沖液（5%脫脂奶中），在4℃環(huán)境下過夜（分別加入抗Bcl-2，抗Bax，抗Akt，抗Caspase-9和抗α-actin抗體），膜進(jìn)行3遍清洗后與辣根過氧化物酶聯(lián)合的二抗（1：2000）孵育1h。Quantity One軟件測定灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。本次研究中的所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫檀芪對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)及活力的影響

如圖1表示，與A組比較，B組中心肌細(xì)胞皺縮，細(xì)胞變圓變亮； 與B組相比，加入Pte組中的細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)。如圖2表示，與A組比較，B組中心肌細(xì)胞活力下降，具有顯著性差異（P＜0.05）； 與B組比較，添加Pte組的細(xì)胞活力改善，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)異常及活力下降是Pte的顯著特點(diǎn)；同時(shí)觀察到Pte可劑量依賴性提高乳鼠心肌細(xì)胞H/R后的生存率。

2.2 紫檀芪對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

圖1 紫檀芪對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2 紫檀芪對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞活力的影響

各組組內(nèi)比較結(jié)果：早期凋亡與晚期凋亡之間結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；組間比較結(jié)果（表1）：與Control組（A組）對(duì)比，B組顯著提高的是早期凋亡和晚期凋亡的乳鼠心肌細(xì)胞數(shù)量，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）； 與H/R組比較，各個(gè)濃度紫檀芪組的乳鼠心肌細(xì)胞數(shù)減少（早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表1中t、P值為組間比較。

表1 紫檀芪影響缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的情況分析（）

表1 紫檀芪影響缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的情況分析（）

注：與Control組比較，▲P＜0.05；與H/R組比較，★P＜0.05，◆P＜0.05

?組別 早期凋亡（%）晚期凋亡（ %） t P Control 0.5±0.2 2.8±0.2 36.4 ＜0.05 H/R 8.9±0.4▲ 34.2±3.1▲ 36.2 ＜0.05 H/R+LPte 8.1±1.3★ 26.4±2.6★ 28.2 ＜0.05 H/R+MPte 6.9±0.6◆ 15.2±1.7◆ 20.6 ＜0.05 H/R+HPte 3.7±0.3◆ 9.5±0.6◆ 38.7 ＜0.05

2.3 紫檀芪對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

與Control組[P13K表達(dá)值為（2.2±1.2），AKT磷酸化水平為（0.8±0.1）]比較，H/R組中PI3K表達(dá)值為（0.4±0.1）及AKT磷酸化水平為（0.3±0.1），有所降低，具有顯著性差異（P＜0.05）； 與H/R組比較，H/R+LPte組PI3K表達(dá)值為（0.5±0.1），AKT磷酸化水平為（0.4±0.1）；H/R+MPte組PI3K表達(dá)值為（1.2±0.2），AKT磷酸化水平為（0.7±0.1）；E：H/R+HPte組PI3K表達(dá)值為（1.4±0.2），AKT磷酸化水平為（1.5±0.3）；各個(gè)濃度紫檀芪組PI3K表達(dá)量顯著提高，具有顯著性差異（P＜0.05）；各個(gè)濃度紫檀芪組AKT 磷酸化水平顯著提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3、表2。

圖3 紫檀芪對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

表2 各組P13K表達(dá)與AKT磷酸化水平

3 討論

氧自由基增加，炎性因子浸潤，鈣離子超載，細(xì)胞凋亡等是缺血再灌注損傷發(fā)生的重要影響因素，多條凋亡途徑會(huì)造成缺血再灌注損傷（PI3K/AKT、酪氨酸激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子、轉(zhuǎn)錄激活子JAK-STAT等）[6-7]。PI3K/AKT信號(hào)通路具有關(guān)鍵作用（在心肌IR損傷中），PI3K/AKT信號(hào)通路被激活可能是由于心肌IR引起而導(dǎo)致。AKT的上游激酶為PI3K，磷酸化形式的PI3K蛋白可以反映PI3K/AKT信號(hào)通路的活性[8-9]。本次研究表明，p-AKT在模型組中的水平較高，表示IR時(shí)PI3K/AKT信號(hào)通路被激活，紫檀芪給予后該蛋白的磷酸化形式被進(jìn)一步提升，表示紫檀芪主要分子作用靶點(diǎn)可能是PI3K/AKT信號(hào)通路，通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮心肌保護(hù)效果，紫檀芪促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖存活，同時(shí)一氧化氮合成酶eNOS在PI3K/AKT下游靶點(diǎn)被激活，釋放一氧化氮NO，從而起到擴(kuò)張血管改善微循環(huán)的作用，進(jìn)而起到心肌保護(hù)作用，但其具體的機(jī)制還需進(jìn)一步探索[10-11]。而對(duì)于IR時(shí)PI3K/AKT通路本身處于激活狀態(tài)可能與反饋機(jī)制有關(guān)[12]。本研究證實(shí)紫檀芪能夠促進(jìn)PI3K/AKT信號(hào)蛋白的表達(dá)減輕心肌損傷，對(duì)心肌缺血再灌注起著保護(hù)效應(yīng)。然而在活體動(dòng)物中，紫檀芪控制著極其復(fù)雜的相關(guān)信號(hào)通路機(jī)制[13-16]，對(duì)于紫檀芪在PI3K/AKT的變化及缺血再灌注心肌損傷的影響，需要做進(jìn)一步的研究探索。

本次研究紫檀芪對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)對(duì)磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路的影響進(jìn)行了分析，選取100只Wistar乳鼠（出生12天）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示：以缺氧復(fù)氧損傷B組和控制組A組為對(duì)照，C、D、E組乳鼠心肌細(xì)胞活力與兩組比較有顯著差異，P＜0.05；與A組比較B組顯著提高的是早期凋亡和晚期凋亡的乳鼠心肌細(xì)胞數(shù)量，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與B組比較，C、D、E組的不同濃度紫檀芪的乳鼠心肌細(xì)胞數(shù)減少（早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與A組比較，B組中PI3K表達(dá)及AKT磷酸化程度降低，差異具有顯著性差異（P＜0.05）；與B組比較，C、D、E組的不同濃度紫檀芪的PI3K表達(dá)量顯著提高，差異具有顯著性差異（P＜0.05）；C、D、E組的不同濃度紫檀芪的AKT 磷酸化水平顯著提高，具有顯著性差異（P＜0.05）。

紫檀芪對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡（在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)下）有抑制作用，并能有效提高細(xì)胞活力、改善細(xì)胞形態(tài)、同時(shí)激活PI3K/AKT信號(hào)通路。

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Pterocarpus on apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes induced by hypoxia / reoxygenation through the PI3K-AKT signal pathway

LIU Feng DONG Shaohong WU Meishan LIANG Ruijuan XIONG Wei LIU Huadong CHEN Keqi LIN Feng
Department of Internal Medicine-Cardiovascular,Shenzhen People's Hospital,Shenzhen 518100,China

ObjectiveTo investigate the effect of Pterocarpus on apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes induced by hypoxia / reoxygenation and the effect of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) / protein kinase B (AKT) signaling pathway.MethodsCardiomyocytes of neonatal rats were subjected to hypoxia / reoxygenation (H / R), and the hearts were subjected to myocardial ischemia-reperfusion injury. The rats were divided into normal group, model group (H / R) and pterocarpus stilbene group (H/R+0.5,5,50μmol/L).Cell viability was measured by MTT assay. Cardiomyocyte morphology was detected by inverted microscope. Annexin V-FITC / PI flow cytometry was used to detect the apoptosis of cardiomyocytes.PI3K/AKT activation was analyzed by Western blot.ResultsCompared with the normal group, the center of model group of muscle cell was shrinkage, rounding and brightening, and the cell viability decreased, early and late apoptosis rate of cells increased significantly. The expression of PI3K and the phosphorylation of AKT in the model group were significantly higher than those in the model group (P＜ 0.05). Compared with the model group, 5, 50mol/L of pterostilbene group center muscle morphological was recovery, cell viability was increased, and the rosewood the expression of PI3K was increased, and the difference was significant (P＜0.05). 0.5,5,50 mol/L pterostilbene group the apoptosis of myocardial cells decreased, the phosphorylation level of AKT increased, the difference was significant (P＜ 0.05).ConclusionPterocarpus can resist cardiomyocyte apoptosis induced by hypoxia / reoxygenation, and activation of PI3K / AKT signal is the main way of its expression.

Pterocarpus stilbene;Neonatal rat cardiomyocytes;Hypoxia/reoxygenation;Cell apoptosis

R285.6

A

2095-0616（2016）21-38-04

2016-09-06）

廣東省深圳市博士創(chuàng)新項(xiàng)目（201605004）。

▲通訊作者