羅荔敏，鄢良春，衛(wèi)天喜，華 樺，祝勇軍，趙軍寧＊

（1.華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司 雅安 625000；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥藥理毒理研究所/國家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評價(jià)重點(diǎn)研究室/四川省道地藥材系統(tǒng)開發(fā)工程技術(shù)研究中心/中藥品質(zhì)評價(jià)與創(chuàng)新中藥研究四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 成都 610041）

Microtox（微毒）技術(shù)應(yīng)用于紅花注射液綜合毒性檢測＊

羅荔敏1＊＊，鄢良春2＊＊，衛(wèi)天喜1，華 樺2，祝勇軍1，趙軍寧2＊＊＊

（1.華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司 雅安 625000；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥藥理毒理研究所/國家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評價(jià)重點(diǎn)研究室/四川省道地藥材系統(tǒng)開發(fā)工程技術(shù)研究中心/中藥品質(zhì)評價(jià)與創(chuàng)新中藥研究四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 成都 610041）

目的：探索Microtox技術(shù)應(yīng)用于紅花注射液綜合毒性檢測。方法：以費(fèi)氏弧菌為測試菌種，通過方法學(xué)考察確定最優(yōu)檢測體系及方法學(xué)可靠性；在最優(yōu)檢測體系條件下，對不同生產(chǎn)廠家所生產(chǎn)的紅花注射液進(jìn)行了發(fā)光菌綜合毒性檢測。結(jié)果：2 mL反應(yīng)體系下，最優(yōu)復(fù)蘇液體積0.9 mL/支菌，每個待測樣品加入最優(yōu)的菌液體積50 μL，最優(yōu)檢測時間10 min，最優(yōu)pH范圍5-10，且10 min時發(fā)光強(qiáng)度以80-120萬為宜；重復(fù)性試驗(yàn)、中間精密度試驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%；不同生產(chǎn)廠家A、B、C成品的EC50平均值分別為3.36%、5.58%、4.33%，具有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論：紅花注射液對費(fèi)氏弧菌的毒性存在顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系，且不同生產(chǎn)廠家（包括原研單位在內(nèi)）之間成品EC50值具有顯著性差異，提示紅花注射液成品生物學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)存在進(jìn)一步提升的空間，應(yīng)用Microtox技術(shù)檢測紅花注射液綜合毒性并用于控制不同廠家成品質(zhì)量的波動具有很好的應(yīng)用前景。

Microtox技術(shù) 發(fā)光細(xì)菌 紅花注射液 綜合毒性

紅花注射液是由菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花提取制備的滅菌注射水溶液，其主要成分為查爾酮類及黃酮醇類物質(zhì)，具有良好的活血化瘀、消腫止痛的功效，臨床常用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗死、閉塞性腦血管等疾病，療效顯著[1]。近年來，該藥物在臨床上得到廣泛應(yīng)用，適應(yīng)癥范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，但臨床不良反應(yīng)發(fā)生率也逐漸增多，主要表現(xiàn)為惡心嘔吐、過敏性寒戰(zhàn)、休克等，其中高齡患者居多，不良反應(yīng)現(xiàn)象多發(fā)生在用藥后30 min內(nèi)且多數(shù)為首次用藥[2]。紅花注射液是心腦血管疾病中藥注射劑中比較重要的一個分支，原有生產(chǎn)企業(yè)16家，經(jīng)新版GMP及紅花注射液新質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證過后，現(xiàn)僅存5家企業(yè)繼續(xù)生產(chǎn)，產(chǎn)品集中度及質(zhì)量得到大幅度提升。本研究選取包括原研企業(yè)在內(nèi)的3家代表性企業(yè)（企業(yè)A、企業(yè)B、企業(yè)C）所生產(chǎn)的紅花注射液成品各3批次進(jìn)行了Microtox技術(shù)生物學(xué)綜合毒性測試。

趙軍寧等[3]于2010年在新型中藥質(zhì)量控制模式的思路與方法——“功效-毒性-物質(zhì)”的基礎(chǔ)上，結(jié)合傳統(tǒng)中藥功能主治與現(xiàn)代藥理、毒理及藥物化學(xué)研究成果，建立了新型多指標(biāo)質(zhì)量控制與評價(jià)的方法體系。本研究探索了將Microtox技術(shù)運(yùn)用于紅花注射液綜合毒性評價(jià)的可能性，為輔助該品種質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)藥物

紅花注射液樣品為來自A、B、C三家藥企的成品，每個廠家各取3個批次，所有樣品均為黃紅色至棕紅色的澄明液體。

1.2 菌種

菌種為費(fèi)氏弧菌凍干粉試劑盒（北京濱松光子技術(shù)股份有限公司，菌種型號：CS234，批號：D15G001-D15G025），于-20℃條件下避光保存。

1.3 主要儀器與試劑

費(fèi)氏弧菌復(fù)蘇稀釋液、費(fèi)氏弧菌滲透壓調(diào)節(jié)液（北京濱松光子技術(shù)股份有限公司，批號分別為20150820、20150820）；純化水；BHP9514 發(fā)光菌測試儀（北京濱松光子技術(shù)股份有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 測定發(fā)光強(qiáng)度的方法

從冰箱取出費(fèi)氏弧菌凍干粉1支（-20℃保存），室溫（18℃-25℃）平衡15 min，加入0.9 mL復(fù)蘇液，于室溫下放置10 min后，作為測試用菌液備用。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，先將待測樣品用純化水稀釋至合適的濃度后，再用滲透壓調(diào)節(jié)液（17：3）混勻，作為待測樣品溶液。每次試驗(yàn)均采用復(fù)蘇稀釋液作為空白對照。每支測試管中放入2 mL待測樣品或空白對照液（n=3），分別向各測試管中加入50 μL測試菌液，輕輕震蕩混勻，室溫放置10 min，再用濱松發(fā)光菌測試儀讀取各管發(fā)光強(qiáng)度值。

1.4.2 方法學(xué)考察

（1）測定方法影響因素考察

首先，考察復(fù)蘇液體積、加入菌液體積及時間對空白對照管初始發(fā)光強(qiáng)度值的影響。向平衡后的費(fèi)氏弧菌凍干粉中分別加入0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL復(fù)蘇液進(jìn)行復(fù)蘇，10 min后分別取每個復(fù)蘇液體積下的菌液20、30、40、50、60 μL置于裝有2 mL稀釋液的空白對照管中（n=3），輕輕震蕩從混勻開始計(jì)時，每2 min測定1次發(fā)光強(qiáng)度值，比較不同復(fù)蘇液體積、不同菌液加入量及不同測定時間對空白對照管初始發(fā)光強(qiáng)度值的影響。

然后，考察時間對不同濃度待測樣品發(fā)光強(qiáng)度值的影響。向待測管中加入2 mL不同濃度下待測樣品溶液（n=3），加入精密量取最優(yōu)復(fù)蘇參數(shù)條件下測試菌液，輕輕震蕩從混勻開始計(jì)時，每2 min測定1次發(fā)光強(qiáng)度值，比較時間對不同濃度待測樣品發(fā)光強(qiáng)度值的影響。

最后，考察pH對發(fā)光強(qiáng)度的影響。用NaOH溶液或HCl溶液與復(fù)蘇稀釋液以適宜的比例混合混合，配制pH為1、2、4、5、8、10、11、12、14的復(fù)蘇稀釋液；分別取上述復(fù)蘇稀釋液2 mL于測試管中（n=3），加入50 μL測試菌液，輕輕震蕩使之充分混勻開始計(jì)時，每2 min測定1次發(fā)光強(qiáng)度值，比較pH對發(fā)光強(qiáng)度的影響。

（2）精密度考察

重復(fù)性考察的試驗(yàn)步驟：以“1.5.1”項(xiàng)下方法對不同廠家各個批次的紅花注射液成品進(jìn)行檢測，每批樣品平行3次試驗(yàn)，對結(jié)果進(jìn)行分析。

另外，中間精密度考察的試驗(yàn)步驟分為2個方面：①不同人員：以“1.5.1”項(xiàng)下方法由不同的試驗(yàn)員在同一個工作日對同一批紅花注射液成品進(jìn)行檢測，對結(jié)果進(jìn)行分析；②不同工作日：由相同的試驗(yàn)員在不同工作日對同一批紅花注射液成品進(jìn)行檢測，對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4.3 費(fèi)氏弧菌—紅花注射液綜合毒性評價(jià)

按照“1.5.1”項(xiàng)下方法，對不同廠家各個批次的紅花注射液成品進(jìn)行發(fā)光強(qiáng)度檢測，并計(jì)算抑制率和半數(shù)抑制濃度（EC50值），根據(jù)EC50值對比各樣品的綜合毒性大?。‥C50值與各樣品的綜合毒性成負(fù)相關(guān)）分析樣品的綜合毒性。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理和毒性評價(jià)

抑制率計(jì)算公式如下：

采用Excel對數(shù)模型擬合并繪制濃度-抑制率曲線，根據(jù)曲線擬合公式計(jì)算樣品的EC50值（半數(shù)抑制濃度），以EC50值表征紅花注射液綜合毒性的大小，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用Excel 軟件先進(jìn)行F-TEST方差齊性檢驗(yàn)，后進(jìn)行T-TEST 雙尾等方差檢驗(yàn)。P＞0.05無顯著性差異，P＜0.05有顯著性差異。P＜0.01有及顯著性差異。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 影響因素考察

2.1.1 復(fù)蘇液體積、加入菌液體積及時間對空白對照管初始發(fā)光強(qiáng)度值的影響

由圖1可見，固定加入不同體積的菌液、不同體積的復(fù)蘇液會造成初始發(fā)光強(qiáng)度值隨時間的走勢不同，隨復(fù)蘇液體積增大初始發(fā)光強(qiáng)度值呈現(xiàn)先增高后降低趨勢；固定復(fù)蘇液體積，加入不同體積的菌液會造成初始發(fā)光強(qiáng)度值隨時間的走勢不同，隨所加菌液體積增大初始發(fā)光強(qiáng)度值亦呈現(xiàn)先增高后降低趨勢；說明測試用菌液中的菌液濃度不是越高越好。結(jié)合上述試驗(yàn)結(jié)果，為減小試驗(yàn)誤差同時考慮成本問題，選取最優(yōu)復(fù)蘇液體積0.9 mL，每管加菌液體積50 μL、10-30 min內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度值基本沒有太大變化可用于試驗(yàn)測定（初始發(fā)光強(qiáng)度值在80-120萬之間為宜）。

圖1 復(fù)蘇液體積、加入菌液體積及時間對空白對照管初始發(fā)光強(qiáng)度值的影響

2.1.2 時間對不同濃度待測樣品發(fā)光強(qiáng)度值的影響

由圖2可見，不同濃度的紅花注射液對費(fèi)氏弧菌初試發(fā)光強(qiáng)度值的影響不同，低濃度促進(jìn)發(fā)光，高濃度抑制發(fā)光，且中間濃度發(fā)光強(qiáng)度抑制率在15 min左右開始發(fā)生衰減。綜合空白對照管的測試結(jié)果，設(shè)定紅花注射液-費(fèi)氏弧菌綜合毒性評價(jià)體系參數(shù)為：復(fù)蘇液0.9 mL，每管加入菌液50 μL，最優(yōu)檢測時間10 min。

2.1.3 pH對發(fā)光強(qiáng)度的影響

由圖3可見，待測樣品溶液pH在5-10 h對發(fā)光強(qiáng)度值的影響較小，相對偏差小于10%。

2.2 精密度考察

2.2.1 重復(fù)性

根據(jù)表1可見，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的相對偏差小于15%。

2.2.2 中間精密度

根據(jù)表2可見，中間精密度試驗(yàn)的相對偏差小于15%。

2.3 不同廠家紅花注射液成品綜合毒性比較

由表3和圖4可見，不同生產(chǎn)廠家A、B、C的紅花注射液成品EC50值差異較大T-TEST雙尾等方差檢驗(yàn)，P＜0.01有極顯著性差異。

圖2 時間對不同濃度待測樣品發(fā)光強(qiáng)度值的影響

圖3 pH對發(fā)光強(qiáng)度的影響

表1 3批生脈注射液成品重復(fù)性試驗(yàn)

表2 中間精密度試驗(yàn)試驗(yàn)

表3 不同廠家生脈注射液成品生物綜合毒性結(jié)果

3 討論

3.1 Microtox技術(shù)綜合毒性評價(jià)體系

圖4 不同廠家紅花注射液成品生物綜合毒性結(jié)果

圖5 發(fā)光菌發(fā)光代謝過程和原理圖

利用發(fā)光菌生理上的獨(dú)特性，Microtox技術(shù)根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度的變化檢測待測樣品的生物毒性，也是目前GB/T 15441-1995和ISO11348認(rèn)證的急性毒理測試方法。細(xì)菌有很多種類，但是其發(fā)光原理是相同的，都是酶促氧化反應(yīng)。一般主要有熒光素酶、FMN、NADH、NADPH、長鏈脂肪醛（RCHO）、分子氧等物質(zhì)參與發(fā)光反應(yīng)。在正常的生理?xiàng)l件下發(fā)光菌能發(fā)出波長在450-490 nm的藍(lán)綠色可見光，發(fā)光強(qiáng)度在特定試驗(yàn)條件下是恒定的，發(fā)光強(qiáng)度在接觸外來受試物時會發(fā)生變化，外來受試物抑制細(xì)菌發(fā)光主要通過2個途徑：①直接抑制酶類參與發(fā)光反應(yīng)的活性；②抑制與發(fā)光反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)代謝過程。原理圖如下[4]：

該技術(shù)評價(jià)體系優(yōu)點(diǎn)包括：①發(fā)光菌具有與高等生物類似的物理化學(xué)性質(zhì)和酶促反應(yīng)過程特點(diǎn)，模擬性強(qiáng)，是一種綜合毒性檢測方法；②該方法為國際公認(rèn)的客觀可靠的方法，且方法簡單、便于操作、重復(fù)性好；③反應(yīng)靈敏度高，比一般生物反應(yīng)細(xì)胞靈敏幾個數(shù)量級；④可以同時獲得多個定量參數(shù)，EC50、標(biāo)準(zhǔn)毒物參比值、毒性劑量-效應(yīng)動力曲線等多個定量參數(shù)的測定，綜合表征上述注射劑毒性特點(diǎn)[5-13]。

3.2 紅花注射液對發(fā)光菌的綜合毒性

本研究首次應(yīng)用一種Microtox技術(shù)方法測定了紅花注射液成品的生物綜合毒性，選取費(fèi)氏弧菌作為發(fā)光菌測試菌種，考察并建立其生物綜合毒性評價(jià)體系，確定最優(yōu)復(fù)蘇液體積為0.9 mL，最優(yōu)菌液加入量為50 μL，最優(yōu)檢測時間10 min，最優(yōu)pH范圍5-10，且10 min時空白對照發(fā)光強(qiáng)度以80-120萬為宜。在此體系下，重復(fù)性和中間精密度均良好，相對偏差小于15%，方法可靠。從研究結(jié)果分析，紅花注射液對費(fèi)氏弧菌的毒性存在顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系，且不同生產(chǎn)廠家（包括原研單位在內(nèi)）之間成品EC50值具有顯著性差異，提示紅花注射液成品生物學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)存在進(jìn)一步提升的空間，采用Microtox技術(shù)檢測紅花注射液綜合毒性并用于控制不同廠家成品質(zhì)量波動具有很好的應(yīng)用前景。

1 練偉靈,劉世峰. 紅花注射液致不良反應(yīng)一般規(guī)律及特點(diǎn)分析. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2015,11(2)：130-131.

2 梁俐麗,王琳,高永麗. 紅花注射液不良反應(yīng)文獻(xiàn)概述. 中國藥物濫用防治雜志, 2015, 21(4)：241-242.

3 趙軍寧,鄢良春,宋軍. 建立以“功效”為核心的新型中藥質(zhì)量評價(jià)模式. 中藥藥理與臨床,2010,26(5)：158-161.

4 Meighen E A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Mol bio Rev, 1991, 55(1)：123-142.

5 趙軍寧,鄢良春. 基于Microtox技術(shù)（微毒測試）的中藥綜合毒性快速評價(jià). 世界中醫(yī)藥, 2014,9(2)：137-144.

6 趙軍寧,鄢良春，鄭曉秋,等. 一種快速檢測中藥注射劑綜合毒性的生物測試方法. 中國： ZL201310210195.8.

7 趙軍寧,鄢良春,朱雅寧,等. 一種快速檢測紅花注射液綜合毒性的生物測試方法. 中國： ZL201410113782.X.

8 趙軍寧,鄢良春,鄭曉秋,等. 一種快速檢測魚腥草注射液綜合毒性的生物測試方法. 中國： ZL201310369652.8.

9 李孝容,華樺,鄢良春,等. 蒼耳子微毒測試(Microtox)與小鼠急性毒性的相關(guān)性研究.中藥藥理與臨床,2016,32(2)：134-138.

10 夏見英,華樺,鄢良春,等. 基于 Microtox 技術(shù)快速檢測蒼耳子藥材及其飲片、成方制劑毒性變化規(guī)律. 中藥藥理與臨床,2016,32(2)：151-154.

11 熊靜悅,李孝容,鄢良春,等. Microtox 中藥注射劑微毒測試體系明亮發(fā)光桿菌 502 和青?；【?Q67 發(fā)光反應(yīng)條件的比較研究. 中藥藥理與臨床,2016,32(2)：227-230.

12 鄭曉秋,鄢良春,趙軍寧,等. 應(yīng)用Microtox 技術(shù)檢測魚腥草注射液綜合毒性的研究.中藥藥理與臨床,2013,29(6)：92-95.

13 熊靜悅,李孝容,鄢良春,等. 基于 Microtox 技術(shù)的中藥注射劑微毒快速測試體系反應(yīng)條件的優(yōu)化與方法學(xué)的考察.中國中藥雜志,2016,41(9)：1622-1626.

The Microtox-Based Fast Test of Comprehensive Toxicity of Safflower Injection

Luo Limin1, Yan liangchun2, Wei Tianxi1, Hua Hua2, Zhu Yongjun1, Zhao Junning2
(1.China Resources 999 Pharmaceutical Co., Ltd. (Ya'an), Ya'an 625000, China; 2.Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu, 610041, China)

This study aimed at exploring a new method--microtox technology to evaluate the comprehensivetoxicity of safflower injections from different drug manufacturers. In the experiment, we investigated the characteristic parameters of vibrio fischeri (CS234) under different conditions, and then locked the optimum parameters for safflower injection assay： recovery liquid volume 0.9 mL in freeze-dried vial, 50 μL bacteria suspension in each sample, and the detection time of 10 mins after adding the bacteria suspension. Under this optimum detection condition, we found that the EC50values were 3.36%, 5.58% and 4.33%, being significantly different between 3 representative drug manufacturers (P ＜ 0.05). In conclusion, it was implied that the biological detection standards of safflower injections need improving, while the microtox-based fast test of the comprehensive toxicity of safflower injection showed a favorable and prospective application to controlling the product qualities of different manufacturers.

Microtox technology, luminous bacteria, safflower injection, comprehensive toxicity

10.11842/wst.2016.11.015

R285

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-11-15

修回日期：2016-11-20

＊ 科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2015ZX09501004-001-005）：基于Microtox（微毒）測試的中藥安全性快速檢測、質(zhì)量控制與風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警新技術(shù)研究，負(fù)責(zé)人：趙軍寧；國家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81470180）：基于Microtox技術(shù)的中藥毒性分級原理與標(biāo)準(zhǔn)研究，負(fù)責(zé)人：趙軍寧；國家中醫(yī)藥管理局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201507004）：與臨床病癥相關(guān)的確有療效常用中藥炮制技術(shù)與配伍減“毒”研究——蒼耳子，負(fù)責(zé)人：華樺；四川省科技廳定向財(cái)力轉(zhuǎn)移支付項(xiàng)目（2015ZYZF0087）：紅花注射液致不良反應(yīng)物研究，負(fù)責(zé)人：祝勇軍。

＊＊ 羅荔敏、鄢良春為共同第一作者。

＊＊＊ 通訊作者：趙軍寧，本刊編委，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥藥理學(xué)、中藥質(zhì)量生物控制、道地藥材與民族藥系統(tǒng)研究開發(fā)等。